Summary
המטרה של מצגת זו היא להוכיח in vivo ובטכניקות מבחנה לגידול של נמטודות entomopathogenic. בvivo שיטות לשקול הגידול של נמטודות אלה עם מארח חרק, ואילו השיטות במבחנה לנצל מדיה אגר עשירה.
Abstract
נמטודות Entomopathogenic (EPN) (Steinernematidae וHeterorhabditidae) יש שותפות mutualistic עם Gamma-Proteobacteria גראם שלילי במשפחת חיידקי Enterobacteriaceae. Xenorhabdus קשורים לנמטודות steinernematids בעוד Photorhabdus היא סימביוזה של heterorhabditids. יחד נמטודות וחיידקים יוצרים מורכבת קוטלי חרקים חזקים שהורג מגוון רחב של מיני חרקים בשותפות אינטימית וספציפית. במסמך זה, אנו מדגימים in vivo ובטכניקות מבחנה בשימוש נפוץ בגידול של נמטודות אלה בתנאי מעבדה. יתר על כן, טכניקות אלה מייצגים שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של תרבויות EPN וגם יוצרות את הבסיס לbioassays האחר שעושים שימוש באורגניזמים אלה למחקר. הייצור של נמטודות aposymbiotic (ללא הסימביונט) הוא לעתים קרובות קריטי לעומק ובגישה רבת פנים למחקר של סימביוזה. זהפרוטוקול אינו דורש תוספת של אנטיביוטיקה וניתן להשיג בפרק זמן קצר עם ציוד מעבדה סטנדרטי. נמטודות מיוצרות באופן זה הן חזקות יחסית, אם כי השארות שלהם באחסון עשויות להשתנות בהתאם למין משמש. הטכניקות מפורטות במצגת זו מתאימות לאלה המתוארים על ידי מחברים שונים ומעודנים על ידי המעבדה של פ המלאי, אוניברסיטת אריזונה (טוסון, אריזונה, ארה"ב). טכניקות אלו נבדלות מהגוף של טכניקות המשמשים בייצור ההמוני של יצורים אלה למטרות טיפול במזיקים.
Introduction
נמטודות Entomopathogenic (EPN) Steinernema וspp Heterorhabditis. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) והסימביוזה עם החיידקים שלהם, Xenorhabdus וspp Photorhabdus (Enterobacteriaceae) נחשבים מודל מתהווה של יחסים סימביוטיים בעלי חי חיידק יבשתי 2-4,6,10,19. Xenorhabdus וspp Photorhabdus. הם טיפחו כבסימביוזה במעיו של שלב חיים נטולי רק של נמטודות, הידוע גם בנוער המזהם (IJ) או שלב 3 rd מזהם נוער 8,10,13. זוג החיידק-נמטודות הוא פתוגניים למגוון רחב של חרקים והצלחה יושם בהדברה ביולוגית ותוכניות טיפול משולבים במזיקים בעולם 6,8.
במסמך זה אנו מציגים מבחר של in vivo ו במבחנת טכניקות שלעתים קרובות למימוש לגידול של EPN בתנאי מעבדה. אניn שיטות vivo להרהר מארח חרק לגידול של נמטודות. בדרך כלל, בשלבי בוסר של הזמנות חרקים שונות (כלומר פרפרים, Coleoptera, Diptera, וכו '.) נחשבים מארחים מתאימים. בvivo שיטות נחשבות בדרך כלל לתחזוקה של תרבויות נמטודות במעבדה. שיטה זו עשויה שלא להיות מתאימה כאשר בוחנים ייצור המוני של נמטודות. כמויות גדולות של מארחי חרקים עשויות להידרש לעניין זה דורש יותר זמן ועלויות נוספות הקשורות לגידול החרקים.
יכולה גם להיות מתורבת נמטודות Entomopathogenic במבחנה בכמה כלי תקשורת. בהתאם למטרת המחקר, בשיטות מבחנה עשויה או לשקול ההתאגדות של החיידקים סימביוטיים בתקשורת. במצגת זו, אנו מתארים שתי שיטות נפוצות להפצת EPN. מרכיביה של התקשורת לספק מקור של חומרים מזינים לחיידק סימביוטיבמבחנה שיטות nd מקור סטרולים לנמטודות. מציעות את היתרון הגידול של EPN ללא מארח חרק.
במקור, רבים מכלי התקשורת במבחנה פיתחו שמשו לכפל של EPN כאשר מארחי חרקים מתאימים אינם זמינים. עם זאת, במהלך השנים האחרונות, במבחנה שיטות גידול הפכו עובדים רבים במחקר שמטרתו להבין את הקשר בין mutualistic EPN והחיידקים סימביוטיים 17,19.
הטכניקות מפורטות במצגת זו מתאימות לאלה המתוארים על ידי מחברים שונים ומעודנים על ידי המעבדה המלאי, אוניברסיטת אריזונה (טוסון, אריזונה, ארה"ב). טכניקות אלו נבדלות מהגוף של טכניקות המשמשים בייצור ההמוני של יצורים אלה למטרות טיפול במזיקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 בvivo גידול של Entomopathogenic נמטודות עם החיידקים Symboitic
- הפוך צלחת פטרי פלסטיק 100 x 15 מ"מ ומניח את שני דיסקים של נייר סינון (90 מ"מ) במכסה של הצלחת.
- לפזר באופן שווה 1 מ"ל של ההשעיה IJ (קטינים מזהמים) מים (בריכוז של 1,000-2,000 IJ / מ"ל) על נייר הסינון.
הערה: IJS לא צריך להיות מעוקר לפני שטח. - הוסף 10 זחלי instar האחרונים של mellonella Galleria waxmoth הגדול יותר לצלחת. המטרה היא לספק כ 100-200 IJS / זחל.
- כסה את המכסה עם החלק התחתון של צלחת פטרי (איור 1) ולתייג את צלחת פטרי. להזכיר את המידע הבא: שם מין נמטודות (אם ידוע); לבודד קוד / ייעוד; מלכודת זיהום נקבעה מועד.
- מניחים את הצלחת, בתוך שקית פלסטיק אטומה באופן רופף (כדי לחסוך בלחות) ולשמור אותו בחושך בבית או בטמפרטורת חדר או באינקובטור בין 20-25 ° C. הגעה מנות יומית
הערה: חושך מאפשר זיהום נמטודות, כפי שהוא מחקה תנאי זיהום טבעיים באדמה. - אחרי 3-5 ימים, להסיר את הגופות עם סימנים של זיהום נמטודות למלכודת לבנה שונה 7.
הערה: אם הגופות להריח רקוב, זה עשוי להיות סימן לכך שculturing לא היה מוצלח ו / או לא היה זיהום. הגדר קאמרי זיהום חדש עם קבוצה חדשה של נמטודות וחרקים.
.2 במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות עם החיידקים סימביוטיים שלהם
- כבד כליות אגר שיטה 9,19
- קוצצים כבד וכליות לחתיכות קטנות (2 סנטימטר 3 או קטן יותר) ומקום לבלנדר עם NaCl, אגר ו300 מ"ל של מים ותערובת עד שהבשר הופך לעיסה נוזלית, דבק או פירה סמיך. לאחר מכן, להעביר את התערובת לבקבוק 1 ליטר Erlenmeyer.
- הוסף את 200 מ"ל הסופי של מים לספינת הבלנדר ולמזוג כל מדיה שנותרה לבקבוק Erlenmeyer. החיטוי במשך 15 דקות ב 121 C °. לאחר המעוקר לאפשר אגר להתקרר לגעת לפני המזיגה.
הערה: Pipetting של מדיום אינו מומלץ משום שהמדיום הזה נוטה להיות נתחי בשר. - יוצקים ~ 20 מ"ל של אגר על 5 סנטימטר צלחות פטרי (או 6), בעוד יד ערבוב או מתערבל בקבוק Erlenmeyer בין מוזג לתקשורת הומוגני יותר. לאפשר אגר לביסוס ומנות לאחסן ב 4 ° C עד צורך
הערה: השתמש במרית מתכת מעוקרת להבה כדי לשבור את כל נתחים גדולים של בשר שפכו לתוך צלחת פטרי.
- שומנים אגר שיטת 9,19
- להכין מדיום אגר שומנים על ידי ערבוב יחד מרק מזין, תמצית אגר ושמרים ויוצקים לערבב לתוך בקבוק 2 ליטר Erlenmeyer. הוסף מזוקק H 2 O וMgCl 2 • 6 שעות 2 O וחיטוי ל15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
- להוסיף תערובת עקרה של תערובת שמן וסירופ תירס תירס ומערבבים או מערבולת במרץ, ולעתים קרובות לפזר טיפות שמן באופן שווה.
- יוצקים ~ 20 אגר מ"ל על 5 סנטימטר צלחות פטרי (או 6) ולאפשר אגר לביסוס ומנות לאחסן ב 4 ° C עד צורך.
- Streak רצוי חיידקים סימביוטיים על הצלחת אגר שומנים ודגירת צלחות ב28 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעה.
הערה: מורחים 100-200 μl של תת הלילה (12-16 לשעה) LB. - היום אחרי, להוסיף כ 0.4 מ"ל של השעיה משטח מעוקר נמטודות (ביצים או קטינים מזהמים) ודגירת צלחות בטמפרטורת חדר בחושך או בחממה ב22 ± 3 מעלות צלזיוס.
הערה: אל תוסיף יותר מ 0.4 מ"ל של ההשעיה נמטודות כפי שהוא יכול ליצור סביבת יתר על המידה רטובה שהיא שלילי לצמיחת נמטודות. - צג תרבויות יומי. תרבויות צריכה לייצר דור חדש של IJS בכ -12 ימים (איור 2).
- העבר את צלחת תחתית עם אגר כאשר נמטודות נראית זחילה הצדדים של הצלחת (איור 3 א) למלכודת לבנה שונה (ראה אל אורוסקו et. 12) למסוק IJS (איור 3 ב). לבצע שלב זה תחת הזרימה למינרית להפחתת זיהום מכלי התקשורת.
- לאסוף IJS מהמלכודת הלבנה שונה על הופעתה ולשטוף השעיה IJ כדי להסיר כל פסולת בינונית. חנות IJ במעוקר מים מזוקקים ב10 ° C (בחממה קרה בטמפרטורה או בחדר קר) או להשתמש באופן מיידי במידת הצורך.
הערה: בהתאם למטרת המחקר, זרע הצלחות גם עם נמטודות-יישב הסימביונט או aposymbiotic.
.3 במבחנה הגידול של Aposymbiotic (הסימביונט-חינם) Entomopathogenic נמטודות
- להדביק 10-20 G. זחלי mellonella עם IJS של מיני נמטודות הרצויות (ראה סעיף 1). אחרי 3 או 4 ימים (בשלב זה IJS צריך הבשיללמבוגרים דור הראשונים) לאסוף גופות.
הערה: זמן לפדיון ומספר הנקבות הדרושות כדי להשיג מספר מספיק של ביצים משתנית בהתאם למינים. להדביק עוד G. mellonella זחלים במידת צורך ולהתחיל והניתוחים מוקדם ככל לאחר זיהום 48 שעות כדי להעריך אם הן נמצאות בשלב התפתחותי תקין. - מניחים כל גופה בנפרד בצלחת פטרי עם תמיסת מלח (חיץ M9 18). לנתח גווייה על ידי משיכת ראשו עם מלקחיים קצה קנס.
- לאסוף לפחות 20 הרה להולדת (עם ביצים בפנים) נקבות עם מחט דקה (L-צורה רצוי) ולמקם אותם בזכוכית שעון המכילה 10 מ"ל של חיץ M9 (איור 4 א).
- הכן פתרון axenizing על ידי בהתחשב את המרכיבים הבאים: 6.75 מ"ל מים מזוקקים, 1.25 מ"ל 5 N NaOH, ו2.25 מ"ל פתרון אקונומיקה זמין מסחרי בדילול מלא להיפוכלוריט 3%.
הערה: NaOH הוא פתרון כפפות, משקפי מגן בסיסי ואחרים מתאים מגןבגדים צריכים להיות משוחק.
הערה: הכן פתרון axenizing טרי בכל פעם, כמו אקונומיקה מדרדרת באור. הכן כמה קבוצות של פתרון axenizing ולבצע עיקור המשטח וקציר של ביצים במשקפיים שעון מרובים. - יש לשטוף את נקבות לפחות שלוש פעמים עם חיץ M9 מילוי זכוכית שעון עם פתרון חיץ ומתחנף חיץ עם טפטפת. ודא הנשים יישארו בזכוכית השעון. חזור על פעולה זו עוד פעמיים.
- מייד להוסיף את פתרון axenizing ולאפשר את הנקבות להישאר בפתרון זה עבור לא יותר מ 10-15 דקות. שים לב לרקמות נמטודות מתחילות להתפורר תוך הביצים (שהם עמידים לפתרון axenizing) נותרו על כנן.
- ידני לשבש גוף נשי כדי לזרז את התהליך, על ידי חיתוכם עם מחט או אזמל (איור 4 ב, ג). הסר ביצים על ידי pipetting אותם לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge, הימנעות הוספת כל רקמה שלא נמסה.
הערה: שימוש כמ 'כל צינורות microcentrifuge ככל שיידרשו כדי לאסוף ביצים ולעבוד במהירות, כפי שהכדאיות של הביצים תקטן על פני תקופה ממושכת של חשיפה לפתרון axenizing. - צינורות וורטקס ל15 שניות באמצעות "הגדרת מהירות גבוהה" כדי להסיר עוד נמטודות רקמות מחוברת לביצים. לחלופין, אם מערבולת אינה זמינה, pipet למעלה ולמטה כמה פעמים הפתרון.
- ביצים גלולה על ידי צנטריפוגה בכ 18,000 גרם במשך 2 דקות. להגדיל את המהירות אם ביצים לא מספיק גלולה. הסר פתרון axenizing ולשטוף פעמיים על ידי מילוי צינור microcentrifuge עם מים מזוקקים סטריליים ו צנטריפוגות עוד פעם אחת ב900 XG דקות 1.
- לאחר השטיפה האחרונה, resuspend ביצים ב300-500 μl של מים מזוקקים סטריליים ולמקם אותם בצלחת סטרילית 3 סנטימטר פטרי או כוס שעון מעוקרת. זכור כי ביצים נמצאות כעת מעוקר משטח, כך שיש להשתמש טפטפות סטרילי ו / או טיפים pippetter ומים כדי לשמור על ניקיון של הביצים.
- לבחון ביצים תחת מיקרוסקופ לנתח (הגדלה 30-50X) כדי לאשר שהם שלמים (איור 4D) ולהעביר אותם לצלחת 5 סנטימטר עם אגר כבד כליות (ראה סעיף 2.1)
הערה: אל תוסיף יותר מ -400 μl של ההשעיה הביצה על הצלחות כמו זה יגרום אגר מוגזם רטוב. - צלחות תווית עם מידע מתאים ולאחסן אותם זקופה בחושך ב28 ° C. בקיעה של ביצים צריכה להיות הלילה מאליו.
הערה: מים עשויים להתעבות על המכסה של הצלחת אבל זה יתאדה לאחר 1 או 2 ימים. בשלב זה, למקם את הצלחת בשקית ניילון כדי לשמור על לחות של אגר ולהימנע מהייבוש שלה. - שימו לב מנות מעת לעת ולבטל את כל מנות שמראות סימנים של פטרייה או זיהום חיידקים. ברגע שIJS נראה נודדים במעלה הקיר של צלחת פטרי, להסיר את המכסה ולהעביר את צלחת תחתית עם אגר למלכודת לבנה הותאם 12. שקול תנאים סטריליים בעת העברת המנה לmodifieמלכודת לבנה ד כדי למנוע זיהום של התקשורת החשופה.
- המשך ניטור הלבן המלכודות וIJ קציר בהתאם לצורך.
הערה: נמטודות Aposymbiotic תמשיך לנדוד לתוך המים הלבנים המלכודת במשך ימים רבים ואפילו שבועות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטת גידול in vivo משתמשת חרקים חיים כמארחים לצמיחת נמטודות ורבייה. תאי דלקת הם שיטה יעילה לחשיפת IJS חרקים. זהו השלב היחיד במעגל החיים 'נמטודות שוקטורים בסימביוזת החיידקים ממארח חרק אחד למשנהו. איור 1 מציג את להגדיר עבור תא זיהום, כמו גם את החומרים הדרושים לבניית תא זה. במבחנה שיטות גידול לאפשר EPN לגדול בלי מארח חרק, אלא גם מיושמים לגידול של נמטודות aposymbiotic (ללא הסימביונט). איור 2 מראה צלחת אגר שומנים עם שלבי נמטודות שונים. צלחות אגר שומנים גם יכולות להיחשב בבדיקות הכלאה צולבת אשר נדרשות כדי לאמת את זהות נמטודות מבוססת על רעיון המינים הביולוגי. השיטה אגר כליות כבד תוארה במקור על ידי Poinar & Thomas (1966) 14. שיטה זו מאפשרת נמטודות להתבגר ורפרודוקציהדואר ללא מארח חרק והוא יכול לשמש לנמטודות האחורית ללא חיידקים סימביוטיים שלהם (כלומר לייצר נמטודות aposymbiotic). חסרון של שיטה זו היא שהיא נוטה לזיהום בגלל האופי העשיר שלהם, המאפשר חיידקים או פטריות לא רצויים לגדול. איור 3 א מציג צלחות אגר כבד כליות עם IJS זוחל על הצד השני של הצלחת. בשלב זה החלק התחתון של צלחת פטרי ניתן להעביר למלכודת לבנה שונה. איור 3 מדגים צלחת כבד כליות עם נמטודות Steinernema במלכודת לבנה הותאם לאסיף צאצאי IJS. איור 4 א תערוכות זכוכית שעון עם הרה להולדת נקבות Steinernema לפני axenization. איור 4 מציגה את השיבוש של הנקבות עם איזמל מנתחים. איור 4C תערוכות שיבש נקבות בפתרון axenizing. איור 4D תערוכות ביצה שלמה של נמטודות Steinernemcarpocapsae.
איור 1 להגדיר של תא זיהום לגידול in vivo של EPN. שורה עליונה מציגה נייר 5 סנטימטר צלחת פטרי ומסנן. בשורה התחתונה מציגה נייר צלחת ומסנן 10 סנטימטר פטרי. מספר הודעה של זחלי חרקים, הוסיף לכל תא זיהום.
שיטה אגר 2 שומנים איור לגידול במבחנה של EPN. התמונה מראה תקריב (הגדלה 20X) של צלחת עם נמטודות בוגרות מתפתחות במדיום.
איור 3 כבד כליה אגר צלחת. תמונה משמאל ניתן לראות צלחת עם צמיחה מוצלחת של נמטודות. שים לב נמטודות זוחלת על הצד השני של הצלחת. תמונה ב 'מראה צלחת אגר כבד כליות ממוקמת במלכודת לבנה הותאם לאסיף נמטודות IJ.
איור 4 כוס Watch עם נקבות הרות להולדת בaxenizing פתרון. תמונה מראה נשים הרות להולדת בפתרון axenizing. תמונה ב 'מראה שחיקה של הנקבות עם מחט לנתח. מציג C התמונה שיבש נקבות. התמונה D תערוכות ביצה שלמה של carpocapsae Steinernema נמטודות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שימוש מארח מתאים הוא גורם מפתח להצלחה בגידול vivo של EPN. בדרך כלל, שתי steinernematids וheterorhabditids יכולים להתרבות ולהשלים בהצלחה מחזור החיים שלהם בזחלים של עש הדונג הגדול יותר, mellonella Galleria (פרפרים: Pyralidae). עם זאת, מיני חרקים אחרים ממשפחות ו / או צווים שונים יכולים להיחשב. כמה ממיני נמטודות תיארו כיום ידועים יש ספציפי למארח חרקים מסוים. לדוגמא, ס ' kushidai וס scarabaei אינו מאוד ארסי לזחלי lepidopteran, וצריך זחלים קשים כנפיים כגון זחלי חיפושית חרפושית (Scarabaeidae) לגידול מוצלח במעבדה. מין אחר, S. scapterisci, מעדיף חרקים orthopteran כגון צרצרים או צרצרי שומה.
כאשר מארח מתאים אינו זמין, או כאשר תנאי ניסוי דורשים את זה, יכול להיות מועסק במבחנה שיטות לגידול של EPנ 'שיטות אלו משתמשות במדיה המציעים מקור עשיר של חומרים מזינים לנמטודות והסימביוזה עם החיידקים שלהם. במצגת זו שתארנו שני סוגים של אגר (כבד כליות ושומנים בדם) שיכול להיות מנוצל לצמיחה המוצלחת ורבייה של EPN עם או בלי החיידקים סימביוטיים שלהם.
משתמשים צריכים להיות מודעים לכך שאגרה כבד הכליות היא מדיה עשירה, ולכן הוא מזדהם בקלות. טכניקה סטרילית מומלצת בטיפול בשני ביצי axenized והצלחות המחוסנות במהלך כל השלבים של ההליך. צלחות כי הם מזוהמים בחיידקים או פטרייה צריכה להיות מושלכות באופן מיידי.
כאשר גידול aposymbiotic Steinernema IJS, יש להקפיד לlyse כראוי רקמות נמטודות הנשיות, כפי שהם עשויים להכיל חיידקי Xenorhabdus. כמו כן, כדי לאמת שIJ אמנם נקי מחיידקים סימביוטיים, אנו ממליצים שחיקה של מדגם של IJS הטרי שנקטפו בLB עם מוטו שנערך בידr-מונע העלי לפי (Heungens et al. 2002) 7 וצלחת ההשעיה על גבי מדיה NBTA 1. אם מושבות חיידקים נמצאות (לאחר דגירה הלילה) זה יהיה גם אינדיקציה לטכניקת axenization עניה או התוצאה של זיהום.
הגידול של נמטודות Steinernema aposymbiotic הוא טכניקה שיכולה להיחשב גם במגוון רחב של נהלים וניסויים. קוראים צריכים להיות מודעים לכך שההשפעה של נמטודות Steinernema גידול ללא סימביוזה עם במשך דורות רבים עשויה להיות השפעה על כושר נמטודות והישרדות על פני פעמים דור. כמה מחקרים מראים שיש הצורך בזיווג שלהם במערכות טבעיות 5,11,15-17. עם זאת, מחקרים אלו נעשו על מספר מצומצם של מינים ויש צורך בחקירה נוספת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לחברי העבר של המעבדה המלאי: מינג-Min לי, קתרין Plichta, ויקטוריה מירנדה-תומפסון וסם-קיו קים על תרומתם לשיפור של רבים מהפרוטוקולים הללו. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענק הקרן הלאומית למדע IOS-0840932 וIOS-0724978 לצילומי SP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M. The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis. Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).
- Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. Entomopathogenic Nematology. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).
- Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera). Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , CRC Press. Raton, FL. (1990).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. Manual of techniques in insect pathology. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).
- Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp. Nematologica. 39, 385-399 (1993).
- Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (89), (2014).
- Poinar, G. O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda). Nematologica. 12, 105-108 (1966).
- Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).
- Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).
- Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus). BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).
- Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).
