Summary
Målet med denna presentation är att visa in vivo och in vitro tekniker för uppfödning av entomopatogena nematoder. In vivo-metoder anser uppfödning av dessa nematoder med en insekt värd, medan de metoder in vitro utnyttjar rika agar media.
Abstract
Entomopatogena nematoder (EPN) (Steinernematidae och Heterorhabditidae) har en mutualistisk partnerskap med gramnegativa Gamma-Proteobacteria i familjen Enterobacteriaceae. Xenorhabdus bakterier förknippade med steinernematids nematoder medan Photorhabdus är symbionter av heterorhabditids. Tillsammans nematoder och bakterier bildar en potent insekticid komplex som dödar ett stort antal insektsarter i en intim och specifik partnerskap. Häri visar vi in vivo och in vitro tekniker som vanligen används vid uppfödning av dessa nematoder under laboratorieförhållanden. Dessutom är dessa metoder utgör viktiga steg för en framgångsrik etablering av EPN kulturer och även ligga till grund för andra biologiska testsystem som utnyttjar dessa organismer för forskning. Produktionen av aposymbiotic (symbiont fritt) nematoder är ofta avgörande för en djupgående och mångfacetterad metod för studier av symbios. Dettaprotokollet inte kräver tillsats av antibiotika och kan göras på en kort tid med standard laboratorieutrustning. Nematoder som produceras på detta sätt är relativt robust, även om deras efterlevande i lager kan variera beroende på vilken art som används. De tekniker som beskrivs i denna presentation motsvarar de som beskrivs av olika författare och förfinats av P. Stock laboratorium, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Dessa tekniker är skilda från kroppen av tekniker som används vid massproduktion av dessa organismer för växtskydd ändamål.
Introduction
Entomopatogena nematoder (EPN) Steinernema och Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) och deras bakterie symbionter, Xenorhabdus och Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) anses en framväxande modell av markdjur mikrob symbiotiska förhållanden 2-4,6,10,19. Xenorhabdus och Photorhabdus spp. är hyste som symbionter i tarmen hos den enda fritt levande skede av nematoder, även känd som den smitt juvenil (IJ) eller 3: e stadiet smittsam juvenil 8,10,13. Bakterien-nematoden paret är patogen för ett brett spektrum av insekter och har framgångsrikt genomförts i biologisk bekämpning och integrerat växtskydd program världen över 6,8.
Häri visar vi ett urval av in vivo och in vitro-tekniker som ofta utnyttjas för uppfödning av EPN under laboratorieförhållanden. In vivo-metoder begrunda en insekt värd för uppfödning av nematoderna. Vanligtvis är omogna stadier av olika insekts order (dvs Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, osv.) Anses vara lämpliga värdar. In vivo metoder brukar anses för underhåll av nematoder kulturer i labbet. Denna metod kanske inte passar när man överväger massproduktion av nematoderna. Stora mängder insekts värdar kan krävas för detta ändamål kräver mer tid och extra kostnader i samband med insektsodling.
Entomopatogena nematoder kan också odlas in vitro i flera medier. Beroende på målet för undersökningen; i vitro-metoder kan eller överväga att införliva de symbiotiska bakterier i media. I den här presentationen, beskriver vi två vanliga metoder för förökning av EPN. Ingredienserna i medierna ger en källa till näringsämnen för symbiotiska bakterien and en sterol källa för nematoderna. In vitro-metoder erbjuder fördelen uppfödning av EPN utan en insekt värd.
Ursprungligen många av medierna in vitro utvecklades användes för förökning av EPN när lämpliga insekts värdar är inte tillgängliga. Men under de senaste åren, har uppfödnings in vitro-metoder blivit allmänt används i forskning för att förstå mutualistisk förhållandet mellan EPN och deras symbiotiska bakterier 17,19.
De tekniker som beskrivs i denna presentation motsvarar de som beskrivs av olika författare och finslipa Stock Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). Dessa tekniker är skilda från kroppen av tekniker som används vid massproduktion av dessa organismer för växtskydd ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vivo Uppfödning av entomopatogena nematoder med sina Symboitic Bakterier
- Invertera en 100 x 15 mm plastpetriskål och placera två skivor av filterpapper (90 mm) i locket på skålen.
- Fördela 1 ml IJ (infektiösa yngel) vattensuspension (vid en koncentration av 1000-2000 IJ / ml) på filterpapper.
OBS: IJ behöver inte vara ytsteriliseras. - Lägg 10 sista stadiet larver av större waxmoth Galleria mellon till skålen. Målet är att ge cirka 100-200 IJs / larv.
- Täck locket med botten av petriskålen (fig 1) och märka den petriskål. Nämn följande information: nematod artnamn (om känt); isolera kod / beteckning; Datum infektion fälla fastställdes.
- Placera skålen i en löst förseglad plastpåse (för att bevara fukt) och hålla den i mörker vid antingen rumstemperatur eller i en inkubator mellan 20-25 ° C. Kontrollera rätter dagligen
OBSERVERA: Mörker underlättar nematodinfektion, som det härmar naturliga infektionsförhållanden i jorden. - Efter 3-5 dagar, ta bort kadaver med tecken på nematodinfektion till en modifierad Vit fälla 7.
OBS: Om kadaver luktar unken, kan detta vara en indikation på att odlingen inte var framgångsrik och / eller det fanns föroreningar. Ställ en ny infektion kammare med en ny sats av nematoder och insekter.
2. In vitro Uppfödning av entomopatogena nematoder med sina symbiotiska bakterier
- Lever-njure Agar Metod 9,19
- Chop lever och njure i små bitar (2 cm 3 eller mindre) och placera i en mixer med NaCl, agar och 300 ml vatten och blanda tills köttet blir en flytande massa, tjock pasta eller puré. Sedan, överför blandningen till en 1 L Erlenmeyer-kolv.
- Lägg de sista 200 ml vatten till blandaren kärlet och dekantera eventuella kvarvarande material iErlenmeyerkolv. Autoklavera under 15 min vid 121 ° C. Efter autoklavering tillåter agar svalna röra innan du häller.
OBSERVERA: Pipettering av mediet rekommenderas inte eftersom detta medium tenderar att ha bitar av kött. - Häll ~ 20 ml agar på 5 (eller 6) cm petriskålar under omrörning för hand eller virvlande Erlenmeyerkolven mellan häller för en mer homogen media. Tillåt agar stelna och lagra skålar vid 4 ° C tills det behövs
OBS: Använd en brand steriliserad metall spatel för att bryta upp några stora bitar av kött hälls i petriskålen.
- Lipid Agar Metod 9,19
- Förbered lipid agarmedium genom att blanda ihop näringsbuljong, agar och jästextrakt och häll blandningen i en 2 L Erlenmeyerkolv. Tillsätt destillerat H2O och MgCl2 • 6 H2O och autoklav under 15 minuter vid 121 ° C.
- Tillsätt steril blandning av majsolja och majssirap blanda och rör eller snurra kraftigt och ofta för att skingra oljedroppar jämnt.
- Häll ~ 20 ml agar på ett 5 (eller 6) cm petriskålar och låta ägarn stelna och lagra skålar vid 4 ° C tills det behövs.
- Serie önskad symbiotiska bakterier på lipid-agarplatta och inkubera plattorna vid 28 ° C under 24-48 timmar.
OBS: Sprid 100-200 pl över natten (12-16 timmar) LB subkultur. - Dagen efter, tillsätt ca 0,4 ml ytsteriliserades nematod fjädring (ägg eller infektiösa ungfisk) och inkubera plattorna vid rumstemperatur i mörker eller i en inkubator vid 22 ± 3 ° C.
OBS: Lägg inte till mer än 0,4 ml nematod befrielsen, eftersom det kan skapa en alltför fuktig miljö som är ogynnsam för nematod tillväxt. - Övervaka kulturer dagligen. Kulturer ska ta fram en ny generation av IJs i ca 12 dagar (Figur 2).
- Överför nedre skålen med agar när nematoder ses krypa sidorna av skålen (figur 3A) till en modifierad Vit fälla (se Orozco et al. 12) för att skörda IJ (Figur 3B). Utför detta steg i dragskåp huva för att minska föroreningen av media.
- Samla IJs från den modifierade Vit fällan vid uppkomst och skölj IJ fjädring för att ta bort något medium skräp. Affär IJ i steriliserat destillerat vatten vid 10 ° C (i en kall temperatur inkubator eller kylrum) eller använd omedelbart om det behövs.
OBS: Beroende på målet med studien, utsäde plattorna med antingen symbiont-koloniserade eller aposymbiotic nematoder.
3. In vitro Uppfödning av Aposymbiotic (symbiont-fri) entomopatogena Nematoder
- Infect 10-20 G. mellon larver med IJs av de önskade nematodarter (se avsnitt 1). Efter tre eller fyra dagar (vid denna tid IJs borde ha mognattill första generationens vuxna) samlar kadaver.
OBS: Tid till förfall och antal honor som krävs för att få ett tillräckligt antal ägg varierar beroende på art. Infect mer G. mellon larver vid behov och börja dissektioner redan på 48 h efter infektion för att bedöma om de är i rätt utvecklingsstadium. - Placera varje cadaver individuellt i en petriskål med koksaltlösning (M9-buffert 18). Dissekera ett lik genom att dra sitt huvud med en fin spets pincett.
- Samla minst 20 gravid (med ägg inuti) honor med en fin nål (L-form helst) och placera dem i en klocka glas innehållande 10 ml M9 buffert (Figur 4A).
- Bered en axenizing lösning genom att beakta följande ingredienser: 6,75 ml destillerat vatten, 1,25 ml 5 N NaOH och 2,25 ml kommersiellt tillgänglig blekmedel utspädd till 3% hypoklorit.
OBS: NaOH är en grundläggande lösning-handskar, skyddsglasögon och annan lämplig skyddsutrustningklädsel.
OBS: Bered färsk axenizing lösning varje gång, som blekmedel bryts ned i ljuset. Förbered flera partier av axenizing lösning och genomfört ytan sterilisering och skörd av ägg i flera urglas. - Skölj honor minst tre gånger med M9 buffert fyller urglas med buffertlösning och suger upp buffert med en pipett. Se till att honorna kvar i urglas. Upprepa detta steg två gånger.
- Omedelbart tillsätt axenizing lösning och låt honorna att förbli i denna lösning under inte mer än 10 till 15 min. Beakta nematod vävnader som börjar att upplösas medan äggen (som är resistent mot den axenizing lösning) förblir intakta.
- Störa manuellt kvinnokroppar för att påskynda processen, genom att skära dem med en nål eller skalpell (figur 4B, C). Ta bort äggen genom att pipettera dem i 1,5 ml mikrorör, undvika att lägga någon olöst vävnad.
OBS: Använd som meventuella mikrocentrifugrör som krävs för att plocka ägg och arbeta snabbt, eftersom lönsamheten för äggen kommer att minska under en längre tids exponering för axenizing lösning. - Vortex rör för 15 sek med hjälp av "hög hastighet inställning" för att ytterligare ta bort nematod vävnader knutna till äggen. Alternativt, om en virvel är inte tillgänglig, pipettera upp och ner lösningen flera gånger.
- Pellet ägg efter centrifugering vid ca 18.000 g under 2 min. Öka hastigheten om äggen inte tillräckligt pellet. Ta axenizing lösning och skölj två gånger genom att fylla mikrocentrifugrör med sterilt destillerat vatten och centrifugera en gång vid 900 xg under 1 min.
- Efter den sista tvätten, suspendera ägg i 300-500 pl sterilt destillerat vatten och placera dem i en steril 3 cm petriskål eller steriliserad urglas. Kom ihåg att ägg är nu ytsteriliseras, så använd sterila pipetter och / eller pippetter tips och vatten för att bibehålla renhet av äggen.
- Undersök ägg under en dissekera mikroskop (30-50X förstoring) för att bekräfta att de är intakta (Figur 4D) och överföra dem till en 5 cm platta med lever-njur-agar (se avsnitt 2.1)
OBS: Lägg inte till mer än 400 l av ägget suspensionen på plattorna, eftersom det kommer att göra agar alltför blöt. - Etikett plattor med lämplig information och förvara dem upprätt i mörker vid 28 ° C. Kläckning av äggen bör vara uppenbart natten.
OBSERVERA: Vatten kan kondensera på locket på skålen men det kommer att avdunsta efter en eller två dagar. Vid denna tid, placera skålen i plastpåse för att behålla fukten i agar och undvika dess torkning. - Observera rätter regelbundet och kassera alla rätter som visar tecken på svamp-eller bakterieangrepp. När IJs ses migrera upp väggen i petriskålen, ta bort locket och överföra den nedre skålen med agar till en modifierad Vita fälla 12. Tänk sterila förhållanden vid överföring skålen i Modified Vita fälla för att undvika kontaminering av den exponerade media.
- Fortsätt att övervaka de vita Fällor och skörde IJ efter behov.
OBS: Aposymbiotic nematoder kommer att fortsätta att vandra in i vattnet i Vita fälla för många dagar och till och med veckor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo uppfödningsmetod använder levande insekter som värdar för nematod tillväxt och reproduktion. Infektion kamrarna är en effektiv metod för att exponera insekter IJ. Detta är den enda etapp i nematoderna livscykel som vektorer bakterie symbionter från en insekt värd till en annan. Figur 1 visar upp för en infektion kammare samt de material som behövs för att bygga den här kammaren. In vitro tillåter uppfödningsmetoder EPN att växa utan en insekt värd men genomförs också för uppfödning av aposymbiotic (symbiont fritt) nematoder. Figur 2 visar en lipid agarplatta med olika nematod steg. Lipid agarplattor kan också övervägas i korshybridisering tester som krävs för att validera nematod identitet baserad på den biologiska arter konceptet. Levern njure agar metoden ursprungligen beskriven av Poinar & Thomas (1966) 14. Denna metod tillåter nematoderna att mogna och reproe utan en insekt värd och kan användas för att bakre nematoder utan sina symbiotiska bakterier (dvs. producerar aposymbiotic nematoder). En nackdel med denna metod är att det är utsatt för kontaminering på grund av deras rika natur, att oönskade bakterier eller svampar att växa. Figur 3A visar lever-njur-agarplattor med IJS kryper på den sida av plattan. Vid detta stadium kan överföras bottendelen av petriskålen till en modifierad Vit fälla. Figur 3B visar en lever-njur platta med Steinernema nematoder i en modifierad Vit fälla för skörd av IJs avkomma. Figur 4A visar ett urglas med en dräktig Steinernema honor innan deras axenization. Figur 4B visar störningar av honorna med en dissekera nål. Figur 4C visar störde honor i axenizing lösningen. Figur 4D visar en intakt ägg av nematoden Steinernemen carpocapsae.
Figur 1 Utarbeta en infektion kammare för in vivo-uppfödning av EPN. Övre raden visar en 5 cm petriskål och filterpapper. Den nedre raden visar en 10 cm petriskål och filterpapper. Kallelse antal insektslarver läggas till varje infektionskammare.
Figur 2 Lipid agar metod för in vitro-uppfödning av EPN. Bilden visar en närbild (20X förstoring) av en maträtt med vuxna nematoder utvecklas på mediet.
Figur 3 Lever-njure agarplatta. Bild A till vänster visar en maträtt med framgångsrik tillväxt av nematoder. Informations nematoder kryper på sidan av skålen. Bild B visar en lever-njure agarplatta placeras i en modifierad Vit fälla för skörd av IJ nematoder.
Figur 4 Watch glas med gravida honor i axenizing lösning. Bild A visar gravida honor i axenizing lösningen. Bild B visar slipning av honorna med en dissekera nål. Bild C visar stört honor. Bild D visar en intakt ägg av nematoden Steinernema carpocapsae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av en lämplig värd är en nyckelfaktor för en framgångsrik in vivo uppfödning av EPN. Vanligtvis kan både steinernematids och heterorhabditids reproducera och fullfölja sin livscykel i larver av större vax mal, Galleria mellon (Lepidoptera: Pyralidae). Däremot kan andra insektsarter från olika familjer och / eller beställningar vägas. Några av de för närvarande beskrivna nematodart är kända att ha specificitet för ett särskilt insektsvärden. Exempelvis S. kushidai och S. scarabaei är inte särskilt virulent för lepidopteran larver, och behöver ordningen skalbaggar larver som scarabskalbaggen larver (Scarabaeidae) för framgångsrik uppfödning i labbet. En annan art, S. scapterisci, föredrar orthopteran insekter som syrsor eller mullvad syrsor.
När en lämplig dator är tillgänglig eller när försöksförhållandena kräver det, kan in vitro-metoder användas för uppfödning av EPN. Dessa metoder använder medier som erbjuder en rik källa till näringsämnen för nematoder och deras bakterie symbionter. I denna presentation beskrev vi två typer av agar (lever-njure och lipid) som kan utnyttjas för en framgångsrik tillväxt och reproduktion av EPN med eller utan deras symbiotiska bakterier.
Användare bör vara medvetna om att det lever-njur-agar är en rik media och är därför lätt förorenas. Steril teknik rekommenderas vid hantering både axenized äggen och de inokulerade plattorna under alla steg av förfarandet. Plattor som är förorenade med bakterier eller svamp ska kasseras omedelbart.
Vid uppfödning aposymbiotic Steinernema IJs, bör försiktighet iakttas för att korrekt lysera kvinnliga nematod vävnader, eftersom de skulle kunna hysa Xenorhabdus bakterier. Dessutom, för att validera att IJ verkligen fria från symbiotiska bakterier rekommenderar vi slipning av ett urval av nyskördade IJs i LB med en handhållen motor drivna mortelstöt enligt (Heungens et al. 2002) 7 och plattan suspensionen på NBTA media 1. Om bakteriekolonier hittas (efter inkubation över natten) kommer det att vara antingen en indikation på en dålig axenization teknik eller resultatet av kontaminering.
Uppfödning av aposymbiotic Steinernema nematoder är en teknik som även kan ses i ett brett spektrum av förfaranden och experiment. Läsare bör vara medvetna om att konsekvenserna av uppfödnings Steinernema nematoder utan symbionter över flera generationer kan ha en inverkan på nematod kondition och överlevnad över generationstider. Några studier tyder de måste företa sin hoppar i naturliga system 5,11,15-17. Emellertid har dessa studier gjorts på ett begränsat antal arter och ytterligare prospekterings behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka tidigare medlemmar i Stock lab: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson och Sam-Kyu Kim för deras bidrag till att förbättra många av dessa protokoll. Detta arbete har finansierats delvis av National Science Foundation IOS-0840932 och IOS-0724978 till SP Stock
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M. The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis. Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).
- Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. Entomopathogenic Nematology. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. The Prokaryotes. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, NY. 473-488 (2002).
- Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera). Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , CRC Press. Raton, FL. (1990).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).
- Kaya, H. K., Gaugler, R.
- Kaya, H. K., Stock, S. P. Techniques in insect nematology. Manual of techniques in insect pathology. Lackey, L. A. , Academic Press. London. 281-324 (1997).
- Koppenhöfer, H. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. Nguyen, K. B., Hunt, D. J. , Brill. Leiden-Boston. 735-759 (2007).
- Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp. Nematologica. 39, 385-399 (1993).
- Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (89), (2014).
- Poinar, G. O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda). Nematologica. 12, 105-108 (1966).
- Poinar, G. O. Jr, Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).
- Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).
- Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus). BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).
- Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. ed, C. .elegans.W. ormB. ook. , Available from: http://www.wormbook.org (2006).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. Lacey, L. A. , Elsevier. Yakima, WA. 373-426 (2012).
