Summary
このプレゼンテーションの目的は、 生体内および昆虫病原性線虫の飼育のためのインビトロ技術に実証することである。 インビトロ法は、リッチ寒天培地を利用し、一方、 インビボの方法は、昆虫宿主でこれらの線虫の飼育を考えてみましょう。
Abstract
昆虫病原性線虫（EPN）（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）は 、腸内細菌科にグラム陰性ガンマプロテオバクテリアと共生のパートナーシップを持っている。 フォトルハブダスは heterorhabditidsの共生している間Xenorhabdus細菌がsteinernematids線虫に関連付けられています。一緒線虫や細菌は親密で、特定の提携で昆虫種の広い範囲を殺す強力な殺虫複合体を形成する。ここで、私たちは、生体内で 、一般に実験室条件下で、これらの線虫の飼育に使用されるインビトロ技術で実証している。さらに、これらの技術は、EPN培養の確立に成功するための重要なステップを表し、また、研究のために、これらの生物を利用する他のバイオアッセイの基礎を形成する。 aposymbiotic（シンビオントフリー）線虫の生産は、多くの場合、深いと共生の研究に多面的なアプローチのために重要である。このプロトコルは、抗生物質の添加を必要とせず、標準的な実験装置を用いて短時間で行うことができる。貯蔵におけるそれらの生存が使用される種に依存して変化し得るが、このようにして製造線虫は、比較的ロバストである。このプレゼンテーションで詳述技術は、P株価の研究所、アリゾナ大学（ツーソン、アリゾナ州、米国）により、さまざまな著者によって記載され、洗練されたものに対応する。これらの技術は、害虫管理の目的のためにこれらの生物の大量生産に使用される技法の本体から区別される。
Introduction
昆虫病原性線虫（EPN）SteinernemaとHeterorhabditis属 。 （Steinernematidae、Heterorhabditidae）とそれらの細菌の共生、XenorhabdusとのPhotorhabdus属（腸内細菌）が陸生動物-微生物共生関係2-4,6,10,19。XenorhabdusとのPhotorhabdus属の創発モデルと考えられている。また、感染性若年性（IJ）として知られている線虫の唯一の自由生活段階、または第3段階感染幼若8,10,13の腸内に共生として保有されている。細菌線虫ペアは昆虫の広い範囲の病原性であり、成功裏に6,8、世界中の生物学的制御と統合された害虫管理プログラムに実装されています。
ここで私たちは、生体内で 、頻繁に実験室条件下でEPNの飼育のために行使されたインビトロ技術での選択を示している。 私をnは、生体内の方法は、線虫の飼育用の昆虫宿主を企図している。通常、さまざまな昆虫の受注（ すなわち鱗翅目 、 甲虫目 、 双翅目 、 等 ）の未成熟な段階は、適切なホストとみなされます。メソッドは、通常、実験室での線虫の培養物の維持のために考慮されるインビボ 。線虫の量産を考慮した場合、この方法は適切でないかもしれない。昆虫宿主の大量のは、より多くの時間と昆虫飼育に関連する追加費用を要求して、この目的のために必要な場合があります。
昆虫病原性線虫には、いくつかのメディアに対してインビトロで培養することができる。研究の目的に応じて、 インビトロ法で 、またはメディア内共生細菌の混入を考慮することができる。この発表では、EPNの伝播のための2つの一般的に使用される方法が記載されている。培地の成分は、共生細菌aの栄養素の供給源を提供ND線虫用のステロール源。 インビトロ法は、昆虫宿主なしで優位にEPNの飼育を提供します。
適切な昆虫宿主が利用できない場合、もともと開発されたインビトロでのメディアの多くは、EPNの乗算のために使用した。しかし、過去数年間にわたり、in vitroでの飼育方法が広くEPNとその共生細菌17,19間の共生関係を理解することを目指して研究に採用になっている。
このプレゼンテーションで詳述技術は、さまざまな著者によって記載され、証券研究所、アリゾナ大学（ツーソン、アリゾナ州、米国）によって洗練ものに対応する。これらの技術は、害虫管理の目的のためにこれらの生物の大量生産に使用される技法の本体から区別される。
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Protocol
彼らのSymboitic細菌と昆虫病原線虫の1。 インビボ飼育
- 100×15ミリメートルのプラスチックシャーレを反転し、皿のふたにろ紙（90ミリメートル）の2つのディスクを配置します。
- 均等に濾紙上（1,000〜2,000 IJ / mlの濃度で）IJ（感染少年）水懸濁液1mlを分配する。
注：IJSは表面殺菌する必要はありません。 - 皿に大きなwaxmothのハチノスツヅリガの10終齢幼虫を追加します。目標は、約100〜200 IJS /幼虫を提供することにある。
- ペトリ皿（ 図1）の底部とふたをカバーし、ペトリ皿にラベルを付ける。以下の情報に言及：線虫種名（既知の場合）;コード/指定を隔離する。日付感染トラップが設定されました。
- （水分を節約するために）緩く密封されたビニール袋の中に皿を置き、どちら室温または20〜25℃の間のインキュベーター内で暗所に保管してください。毎日の料理をチェックする
注：それは土壌中に自然感染状態を模倣として闇は、線虫の感染を容易にします。 - 3〜5日後に、変更されたホワイトトラップ7への線虫感染の兆候で死体を取り除く。
注：死体が腐敗の臭い場合、これは培養が成功しなかった、および/または汚染があったことを示す可能性があります。線虫および昆虫の新しいバッチで新しい感染室を設定します。
彼らの共生細菌を持つ昆虫病原線虫の2 のin vitro飼育
- 肝臓、腎臓天法9,19
- 小片（2 cm 3程度以下）に肝臓と腎臓をみじん切りにし、NaCl、寒天と水300mlでブレンダーに入れ、肉が液体パルプ、濃厚なペーストやピューレになるまでブレンドする。その後、1 Lの三角フラスコに移し、混合物。
- ブレンダー容器に水の最終200ミリリットルを加え、中に残っているメディアをデカント三角フラスコ。 121°Cで15分間オートクレーブ。許可オートクレーブ後の寒天注ぐ前に触れて冷却する。
注：この培地は、肉の塊を持っている傾向があるため、媒体のピペッティングは推奨されません。 - 手の攪拌または間の三角フラスコを旋回がより均質なメディアに注ぐながら5（または6）cmのペトリ皿に寒天〜20ミリリットルを注ぐ。必要になるまで寒天は4℃で固化し、店の食器を許可する
注：ペトリ皿に注ぎ、肉のいずれかの大きな塊を破壊する火炎滅菌金属スパチュラを使用してください。
- 脂質天法9,19
- 栄養ブロス、寒天及び酵母エキスを一緒に混合することにより、脂質寒天培地を準備し、2リットルの三角フラスコに混ぜ注ぐ。 121℃で15分間、H 2 OおよびMgCl 2•6H 2 O、オートクレーブ蒸留追加。
- コーン油、コーンシロップミックスの無菌ミックスを加え、攪拌または均等に油滴を分散させるために積極的かつ頻繁に渦巻く。
- 5（または6）cmのペトリ皿上に〜20ミリリットル寒天を注ぎ、必要になるまで寒天4℃で固化し、店の料理をすることができます。
- ストリークは、脂質寒天プレートに共生細菌を希望し、24〜48時間、28℃でプレートをインキュベートする。
注：一晩（12-16時間）のLBサブカルチャーの100〜200μlのスプレッド。 - 翌日は、約0.4ミリリットル表面殺菌し、線虫懸濁液（卵や感染少年）のを追加し、暗いまたは22±3℃のインキュベーター内で、室温でプレートをインキュベートする。
注：それは、線虫の成長に好ましくない過度に湿潤環境を作成することができますように線虫懸濁液を超える0.4ミリリットルを追加しないでください。 - 毎日文化を監視します。培養物は、約12日間（ 図2）にIJSの新世代を生成する必要があります。
- 線虫が変更ホワイトトラップにディッシュ（ 図3A）の側面をクロール見ているときIJS（ 図3B）を収穫する（オロスコら 12参照）寒天でボトムディッシュを転送します。メディアの汚染を減らすために、層流フードの下に、この手順を実行します。
- 出現時に変更されたホワイトトラップからIJSを収集し、あらゆる媒体破片を除去するIJサスペンションをすすぐ。ストア（コールド温度インキュベーターまたは低温室）で10℃での滅菌蒸留水にIJまたは必要に応じてすぐに使用しています。
注：研究の目的に応じて、シンビオント·保菌またはaposymbiotic線虫のいずれかでプレートをシード。
3 インビトロ Aposymbioticの飼育（共生フリー）昆虫病原線虫
- 10-20 G.に感染希望線虫種のIJSとmellonella幼虫 （セクション1を参照）。 3または4日後（この時点でIJSは成熟しているはず第一世代の成人に）死体を収集します。
注：卵の適切な数を得るために必要な雌の成熟度と数に時間が種によって異なります。より多くのGを感染させるmellonella幼虫必要であれば、彼らは右の発達段階にあるかどうかを評価するために、早ければ48時間後に感染症などの解剖を開始します。 - 生理食塩水（M9バッファ18）とのペトリ皿に個別に死体を置きます。先端の細い鉗子で頭を引いて、死体を解剖。
- 細い針（好ましくはL字型）で、少なくとも20（内側卵）妊娠、女性を集め、M9バッファー（ 図4A）の10ミリリットルを含む時計皿に置いてください。
- 以下の成分を考慮してaxenizing溶液を調製：蒸留水6.75ミリリットル、1.25ミリリットル5NのNaOH、および2.25ミリリットルの市販の漂白剤溶液を3％の次亜塩素酸を希釈した。
注：NaOHを塩基性溶液、手袋、ゴーグルや他の適切な保護である衣服は着用してください。
注：漂白剤は、光の中で分解する、新鮮なaxenizing液を毎回準備します。 axenizing液のいくつかのバッチを用意し、複数の時計皿に卵の表面殺菌や収穫を行う。 - M9バッファは緩衝液で時計皿を充填し、ピペットを用いてバッファを吸い取って、女性には少なくとも3回洗浄します。女性は時計皿に残っていることを確認します。このステップをさらに2回繰り返します。
- すぐにaxenizingソリューションを追加し、女性は10〜15分を超えないために、この溶液中に残存することができます。 （axenizing液に抵抗性である）卵は無傷のままでいる間に崩壊し始めて線虫の組織を観察します。
- 手動で針またはメス（ 図4B、C）でそれらを切断することによって、プロセスをスピードアップするために女性の身体を破壊する。未溶解組織を加える避け、1.5mlのマイクロチューブにそれらをピペッティングすることにより、卵を除去します。
注：Mとして使用卵を収集し、卵の生存能力として、迅速に作業するために、必要に応じて、任意のマイクロチューブはaxenizing溶液への曝露の長期間にわたって減少します。 - 「高速設定」を使用して15秒間ボルテックスチューブは、更に、卵に付着線虫組織を除去した。別の方法として、渦が利用できない場合、解決策を上下にピペットを数回。
- で約18000グラムで2分間の遠心分離によってペレット卵。卵は十分にペレットされない場合は速度を上げてください。 axenizing液を取り出し、1分間900×gで滅菌蒸留水と遠心機1のより多くの時間をマイクロチューブに充填することにより二回すすいでください。
- 最後の洗浄後、滅菌蒸留水300〜500μlの卵を再懸濁し、滅菌3センチメートルペトリ皿または滅菌時計皿に置いてください。卵は今表面殺菌であることを忘れないでください、そう卵の清浄度を維持するために、滅菌ピペットおよび/またはpippetterのヒントや水を使用しています。
- 彼らは（ 図4D）は無傷であることを確認するために解剖顕微鏡（30-50X倍率）の下で卵を調べ、肝臓、腎臓寒天と5cmのプレートに移す（セクション2.1を参照）
注：それは寒天が過度に濡れになりますので、プレート上の卵の懸濁液の400以上のμLを追加しないでください。 - 適切な情報をラベルプレート、28℃の暗所で直立に格納します。卵の孵化することは明白で、一晩でなければなりません。
注：水は皿の蓋の上に凝縮することがありますが、それは1日または2日後に蒸発する。この時、寒天の水分を保持し、その乾燥を避けるために、ビニール袋に皿を置く。 - 定期的に料理を守り、真菌や細菌汚染の兆候を示すあらゆる料理を捨てる。 IJSがペトリ皿の壁を移行見たら、ふたを取り外して、修正されたホワイトトラップ12に寒天でボトムディッシュを転送します。 modifieに皿を転送する際に、無菌状態を考慮してくださいdはホワイトトラップが露出メディアの汚染を回避する。
- 必要に応じてホワイトトラップと収穫IJの監視を続けます。
注：Aposymbiotic線虫は何日あっても数週間ホワイトトラップの水の中に移動していきます。
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Representative Results
in vivoでの飼育方法は、線虫の成長と再生のための宿主としてのライブ昆虫を使用しています。感染室は昆虫のIJSを露出させるための効率的な方法である。これは別の昆虫宿主から細菌共生ベクトル線虫のライフサイクルにおける唯一のステージである。1は感染室だけでなく、このチャンバーを構築するために必要な材料のために設定示しています。 インビトロ飼育方法を許可EPN昆虫宿主なしで成長するだけでなく、aposymbiotic（シンビオントフリー）線虫の飼育のために実装されています。 図2を参照すると、別の線虫のステージを有する脂質寒天プレートを示している。寒天プレート脂質はまた、生物種の概念に基づいて、線虫のアイデンティティを検証するために必要とされるクロスハイブリダイゼーション試験において考慮することができる。肝臓、腎臓寒天法は、もともとPoinar·トーマス（1966）14によって記載された。この方法では、線虫が成熟しreproducすることができます昆虫宿主なしで、電子とその共生細菌なしで後部線虫に使用することができます（ つまり aposymbiotic線虫を生産）。この方法の欠点は、それが不要な細菌または真菌が成長する。 図3Aは IJSは、プレートの側面にクロール肝臓、腎臓寒天プレートを示している可能に、それらの豊富な性質の汚染を受けやすいということである。この段階では、シャーレの底部が変更されたホワイトトラップに転送することができます。 図3Bは IJS子孫の収穫のために修正されたホワイトトラップ内Steinernema線虫と肝臓、腎臓プレートを示しています。 図4（a）は、妊娠した時計皿を示していますSteinernema女性先立ってaxenizationへ。 図4Bは、解剖針でメスの破壊が表示されます。 図4Cは axenizing溶液中で破砕し、女性を示している。 図4Dは、線虫Steinernemの無傷の卵を示しているcarpocapsae。
EPN のin vivo飼育のための感染室の図1。設定をバックアップします。トップ行を5cmシャーレ、ろ紙を示しています。一番下の行を10cmペトリ皿と濾紙を表示する。昆虫の幼虫の通知数は、各感染チャンバーに添加した。
EPN のin vitro飼育については、図2の脂質寒天方法。画像が媒体に発展大人の線虫と皿のクローズアップ（20X倍率）を示す。
図3。肝臓、腎臓寒天プレート。左の画像Aは、線虫の正常な成長と皿を示しています。皿の側面にクロール線虫に注意してください。イメージBは、IJ線虫の採取のために変更されたホワイトトラップに置か肝臓腎臓寒天プレートを示している。
axenizing溶液中の妊娠雌と図4の時計ガラス。画像Aが axenizing溶液中に妊娠、女性を示しています。イメージBを解剖針で雌の研削を示している。画像Cが表示され、女性を破壊した。画像Dは、線虫Steinernemaのcarpocapsaeの無傷の卵を示している。
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Discussion
適当な宿主を使用すると、EPNの生体内で飼育することに成功するための重要な要因である。通常、両方steinernematidsとheterorhabditidsを再現することができますし、正常に高いワックス蛾、 ハチノスツヅリガ （鱗翅目：メイガ）の幼虫で、そのライフサイクルを完了。しかし、異なるファミリーおよび/または指図から他の昆虫種が考えられる。現在記載され線虫種のいくつかは、特定の昆虫宿主に対する特異性を有することが知られている。例えば、S. kushidaiとS. scarabaeiは鱗翅目の幼虫に非常に病原性はなく、そのような実験室で成功した飼育用のコガネムシの幼虫（コガネムシ科）などの甲虫の幼虫を必要としています。別の種、S. scapterisciは、コオロギやケラなどの直翅目の昆虫を好む。
適切なホストが使用できないか、実験条件は、それを必要とする際に、 インビトロ法は、EPの飼育のために使用することができる場合にはN.これらの方法は、線虫とその細菌の共生のための栄養素の豊富な供給源を提供するメディアを使用。このプレゼンテーションでは、またはその共生細菌なしで成功した成長とEPNの再生のために利用することができる寒天（肝臓、腎臓および脂質）の二種類を記述した。
ユーザーは、肝臓、腎臓寒天がリッチメディアであるため、容易に汚染されていることに注意する必要があります。滅菌技術は手順のすべてのステップの間にaxenized卵と接種したプレートの両方の処理に推奨されます。細菌や真菌で汚染されているプレートをすぐに破棄してください。
aposymbiotic Steinernema IJSを飼育する場合、彼らはXenorhabdus細菌を抱くことができように、ケアは、適切に女性の線虫の組織を溶解するために注意する必要があります。また、IJは、実際に共生細菌を含まないことを検証するために、私たちは、手持ちのモトを含むLB中の新たに採取しIJSのサンプルの粉砕を推奨（Heungens ら 、2002）に従って7乳棒をRドリブンとNBTAメディア1上にサスペンションをめっきする。細菌コロニー（一晩のインキュベーションの後に）発見された場合には、貧しいaxenization技法の表示又は汚染の結果のいずれかになります。
aposymbiotic Steinernema線虫の飼育も手順や実験の広い配列で考慮することができる技術である。読者は、複数世代にわたる共生のない飼育Steinernema線虫の影響は世代時間にわたる線虫のフィットネスや生存に影響を与える可能性があることに注意する必要があります。いくつかの研究では、自然のシステム5,11,15-17でのペアリングの必要性を示唆している。しかし、これらの研究は、種限られた数の上で行われており、さらなる調査が必要である。
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Disclosures
利害関係が宣言されていない。
Acknowledgments
これらのプロトコルの多くの改善への貢献のために明ミン·リー、キャスリンPlichta、ビクトリアミランダ·トンプソンとサム·キュッキム：著者は、在庫ラボの過去のメンバーに感謝したい。この作品は、SP株に国立科学財団の助成金IOS-0840932およびIOS-0724978によって部分的に資金を供給された
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
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