Summary
इस प्रस्तुति का लक्ष्य vivo में और entomopathogenic नेमाटोड के पालन के लिए इन विट्रो तकनीक में प्रदर्शित करने के लिए है. इन विट्रो तरीकों अमीर अगर मीडिया का उपयोग जबकि में विवो तरीकों, एक कीट मेजबान के साथ इन नेमाटोड के पालन पर विचार करें.
Abstract
Photorhabdus heterorhabditids की symbionts हैं जबकि Entomopathogenic नेमाटोड (EPN) (Steinernematidae और Heterorhabditidae) Enterobacteriaceae. Xenorhabdus बैक्टीरिया steinernematids नेमाटोड के साथ जुड़े रहे हैं परिवार में ग्राम नकारात्मक गामा Proteobacteria साथ पारस्परिक साझेदारी है. साथ में नेमाटोड और बैक्टीरिया एक अंतरंग और विशिष्ट साझेदारी में कीड़ों की प्रजाति की एक विस्तृत श्रृंखला को मारता है कि एक शक्तिशाली कीटनाशक जटिल रूप में. इस के साथ साथ, हम vivo में और आमतौर पर प्रयोगशाला परिस्थितियों में इन नेमाटोड के पालन में इस्तेमाल विट्रो तकनीक में प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, इन तकनीकों EPN संस्कृतियों के सफल स्थापना के लिए महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं और यह भी अनुसंधान के लिए इन जीवों का उपयोग करने वाले अन्य bioassays के लिए आधार बनेगी. aposymbiotic (symbiont मुक्त) नेमाटोड का उत्पादन अक्सर सहजीवन का अध्ययन करने के लिए एक में गहराई और बहुमुखी दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण है. इसप्रोटोकॉल एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा आवश्यकता नहीं है और मानक प्रयोगशाला के उपकरण के साथ समय की एक छोटी राशि में पूरा किया जा सकता है. भंडारण में उनकी उत्तरजीविता इस्तेमाल किया प्रजातियों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, हालांकि इस तरह से उत्पादित नेमाटोड, अपेक्षाकृत मजबूत कर रहे हैं. इस प्रस्तुति में विस्तृत तकनीक पी शेयर की प्रयोगशाला, एरिजोना विश्वविद्यालय (Tucson, AZ, संयुक्त राज्य अमरीका) द्वारा विभिन्न लेखकों द्वारा वर्णित और परिष्कृत उन के अनुरूप हैं. इन तकनीकों में कीट प्रबंधन प्रयोजनों के लिए इन जीवों का बड़े पैमाने पर उत्पादन में किया जाता है कि तकनीक के शरीर से अलग कर रहे हैं.
Introduction
Entomopathogenic नेमाटोड (EPN) Steinernema और Heterorhabditis एसपीपी. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) और उनके बैक्टीरियल symbionts, Xenorhabdus और Photorhabdus एसपीपी (Enterobacteriaceae) स्थलीय पशु सूक्ष्म जीव सहजीवी संबंधों 2-4,6,10,19. Xenorhabdus और Photorhabdus एसपीपी की एक आकस्मिक मॉडल माना जाता है. भी संक्रामक किशोर (आई जे) या 3 चरण किशोर 8,10,13 संक्रामक रूप में जाना जाता नेमाटोड का केवल मुक्त रहने वाले चरण की आंत में symbionts, के रूप में harbored रहे हैं. जीवाणु-निमेटोड जोड़ी कीड़े की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए रोगजनक है और सफलतापूर्वक जैविक नियंत्रण और एकीकृत कीट प्रबंधन कार्यक्रम दुनिया भर में 6,8 में लागू किया गया है.
इस के साथ साथ हम vivo में और अक्सर प्रयोगशाला परिस्थितियों में EPN के पालन के लिए प्रयोग कर रहे हैं कि इन विट्रो तकनीकों में से एक चयन दिखा. मैंएन विवो तरीकों नेमाटोड के पालन के लिए एक कीट मेजबान मनन. आमतौर पर, विभिन्न कीट आदेश (यानी लेपिडोप्टेरा, Coleoptera, Diptera, आदि.) के अपरिपक्व चरणों उपयुक्त मेजबान माना जाता है. तरीकों आमतौर पर प्रयोगशाला में निमेटोड संस्कृतियों के रखरखाव के लिए माना जाता है में विवो. नेमाटोड का बड़े पैमाने पर उत्पादन पर जब इस विधि उपयुक्त नहीं हो सकता. कीट मेजबान की बड़ी मात्रा में अधिक समय और कीट पालन से संबंधित अतिरिक्त लागत की मांग इस उद्देश्य के लिए आवश्यक हो सकता है.
Entomopathogenic नेमाटोड भी कई मीडिया पर इन विट्रो में संवर्धित किया जा सकता है. अध्ययन के लक्ष्य पर निर्भर करता है, इन विट्रो विधियों में मीडिया में सहजीवी जीवाणु के समावेश पर विचार कर सकते हैं या. इस प्रस्तुति में, हम EPN के प्रचार के लिए दो अधिक इस्तेमाल किया विधियों का वर्णन. मीडिया की सामग्री सहजीवी जीवाणु एक के लिए पोषक तत्वों का एक स्रोत प्रदानएन डी नेमाटोड के लिए एक sterol स्रोत. इन विट्रो विधियों एक कीट मेजबान बिना लाभ EPN के पालन की पेशकश.
उपयुक्त कीट मेजबान उपलब्ध नहीं हैं जब मूल रूप से विकसित इन विट्रो मीडिया के कई EPN के गुणन के लिए इस्तेमाल किया गया. हालांकि, पिछले कुछ वर्षों में, इन विट्रो पालन के तरीकों में व्यापक रूप से EPN और उनके सहजीवी जीवाणु 17,19 के बीच पारस्परिक संबंधों को समझने के लिए लक्ष्य अनुसंधान में कार्यरत हो गए हैं.
इस प्रस्तुति में विस्तृत तकनीक शेयर प्रयोगशाला, एरिजोना (टक्सन, AZ, संयुक्त राज्य अमरीका) विश्वविद्यालय द्वारा विभिन्न लेखकों द्वारा वर्णित और परिष्कृत उन के अनुरूप हैं. इन तकनीकों में कीट प्रबंधन प्रयोजनों के लिए इन जीवों का बड़े पैमाने पर उत्पादन में किया जाता है कि तकनीक के शरीर से अलग कर रहे हैं.
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Protocol
उनके Symboitic बैक्टीरिया के साथ Entomopathogenic नेमाटोड का 1 में विवो पालन
- एक 100 x 15 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश पलटना और डिश के ढक्कन में फिल्टर पेपर (90 मिमी) की दो डिस्क जगह है.
- समान रूप से फिल्टर पेपर पर (1,000-2,000 आई जे / एमएल के एक एकाग्रता में) आई जे (संक्रामक किशोरों) पानी निलंबन के 1 मिलीलीटर वितरित.
नोट: आई जे एस सतह निष्फल होने की जरूरत नहीं है. - डिश अधिक waxmoth गैलेरिया मेल्लोनेल्ला की 10 पिछले instar लार्वा जोड़ें. लक्ष्य लगभग 100-200 आई जे एस / लार्वा प्रदान करना है.
- पेट्री डिश (चित्रा 1) के नीचे के साथ ढक्कन कवर और पेट्री डिश लेबल. निम्नलिखित जानकारी का उल्लेख: निमेटोड प्रजाति का नाम (यदि ज्ञात); कोड / पदनाम अलग; तिथि संक्रमण जाल स्थापित किया गया था.
- एक शिथिल मोहरबंद प्लास्टिक बैग के अंदर पकवान प्लेस (नमी संरक्षण के लिए) और या तो कमरे के तापमान पर या 20-25 डिग्री सेल्सियस के बीच एक मशीन में अंधेरे में रख. दैनिक व्यंजन जाँचें
नोट: यह मिट्टी में प्राकृतिक संक्रमण की स्थिति mimics के रूप में अंधेरे, निमेटोड संक्रमण की सुविधा. - 3-5 दिनों के बाद, एक संशोधित व्हाइट जाल से 7 निमेटोड संक्रमण के लक्षण के साथ शवों को हटा दें.
नोट: शवों दुर्गन्धित गंध, इस संवर्धन सफल नहीं रहा था और / या संदूषण था कि वहाँ एक संकेत हो सकता है. नेमाटोड और कीड़ों का एक नया बैच के साथ एक नए संक्रमण कक्ष सेट करें.
उनके सहजीवी जीवाणु के साथ Entomopathogenic नेमाटोड के 2 इन विट्रो पालन
- जिगर गुर्दे अग्रवाल विधि 9,19
- छोटे टुकड़ों (2 सेमी 3 या छोटे) में जिगर और गुर्दे की जल्द और सोडियम क्लोराइड, अगर साथ एक ब्लेंडर में डाल दिया है और पानी की 300 मिलीलीटर और मांस एक तरल गूदा, गाढ़ा पेस्ट या प्यूरी हो जाता है जब तक मिश्रण. फिर, एक 1 एल Erlenmeyer फ्लास्क मिश्रण हस्तांतरण.
- ब्लेंडर पोत को पानी के अंतिम 200 मिलीलीटर जोड़ें और में किसी भी शेष मीडिया छाननाErlenmeyer फ्लास्क. 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए आटोक्लेव. की अनुमति autoclaving के बाद अगर गिरने से पहले छूने के लिए शांत करने के लिए.
नोट: इस माध्यम मांस का हिस्सा हो जाता है, क्योंकि मध्यम से pipetting की सिफारिश नहीं है. - हाथ सरगर्मी या बीच Erlenmeyer फ्लास्क घूमता एक अधिक समरूप मीडिया के लिए pours जबकि 5 (या 6) सेमी पेट्री डिश पर अगर की ~ 20 मिलीलीटर डालो. जब तक जरूरत अगर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर करना और दुकान व्यंजन करने की अनुमति दें
नोट: मांस की पेट्री डिश में डाल किसी भी बड़ी मात्रा को तोड़ने के लिए एक लौ निष्फल धातु रंग का प्रयोग करें.
- लिपिड अग्रवाल विधि 9,19
- पोषक शोरबा, अगर और खमीर निकालने साथ मिश्रण से लिपिड अगर मध्यम तैयार है और एक 2 एल Erlenmeyer कुप्पी में मिश्रण डालना. 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एच 2 हे और 2 MgCl • 6 2 हे और आटोक्लेव आसुत जोड़ें.
- मक्का तेल और कॉर्न सिरप मिश्रण की बाँझ मिश्रण जोड़ें और समान रूप से तेल की बूंदों को फैलाने के लिए अक्सर हलचल या सख्ती चक्कर आने और.
- एक 5 (या 6) सेमी पेट्री डिश पर ~ 20 मिलीलीटर अगर डालो और जब तक जरूरत अगर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर करना और दुकान व्यंजनों के लिए अनुमति देते हैं.
- स्ट्रीक लिपिड अगर प्लेट पर सहजीवी जीवाणु वांछित और 24-48 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं.
नोट: रातोंरात (12-16 घंटा) लेग उपसंस्कृति के 100-200 μl बिखरा हुआ है. - दिन के बाद, लगभग 0.4 मिलीलीटर सतह निष्फल निमेटोड निलंबन (अंडे या संक्रामक किशोरों) के जोड़ और अंधेरे में या 22 ± 3 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में कमरे के तापमान पर प्लेटें सेते हैं.
नोट: यह निमेटोड विकास के लिए प्रतिकूल है कि एक अत्यधिक गीला वातावरण बना सकते हैं के रूप में निमेटोड निलंबन से अधिक 0.4 मिलीलीटर न जोड़ें. - दैनिक संस्कृतियों मॉनिटर. संस्कृतियों के बारे में 12 दिन (चित्रा 2) में आई जे एस की एक नई पीढ़ी का उत्पादन करना चाहिए.
- नेमाटोड एक संशोधित व्हाइट फंसाने के लिए पकवान (चित्रा 3 ए) की तरफ रेंगने देखा जाता है जब अगर साथ नीचे पकवान स्थानांतरण आई जे एस (3B चित्रा) फसल के लिए (Orozco एट अल. 12 देखें). मीडिया के प्रदूषण को कम करने के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत यह कदम प्रदर्शन.
- उद्भव पर संशोधित व्हाइट जाल से आई जे एस लीजिए और किसी भी माध्यम मलबे को हटाने के लिए आई जे निलंबन कुल्ला. स्टोर (एक ठंडे तापमान इनक्यूबेटर या ठंडे कमरे में) 10 डिग्री सेल्सियस पर निष्फल आसुत जल में आई जे या यदि आवश्यक हो तो तुरंत उपयोग करें.
नोट: अध्ययन के लक्ष्य पर निर्भर करता है, या तो symbiont-उपनिवेश या aposymbiotic नेमाटोड साथ प्लेटों बीज.
3 इन विट्रो Aposymbiotic के पालन (Symbiont मुक्त) Entomopathogenic नेमाटोड
- 10-20 जी संक्रमित वांछित निमेटोड प्रजातियों के आई जे एस के साथ मेल्लोनेल्ला लार्वा (खंड 1 देखें). 3 या 4 दिनों के बाद (इस समय आई जे एस परिपक्व होना चाहिए थापहली पीढ़ी के वयस्कों के लिए) के शवों को इकट्ठा.
नोट: परिपक्वता और प्रजातियों के हिसाब से बदलती अंडे की एक पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए आवश्यक महिलाओं की संख्या के लिए समय. अधिक जी को संक्रमित मेल्लोनेल्ला यदि आवश्यक हो तो लार्वा और के रूप में जल्दी वे सही विकास के चरण में हैं आकलन है कि 48 घंटे के बाद संक्रमण के रूप में विच्छेदन शुरू. - नमकीन घोल (M9 बफर 18) के साथ एक पेट्री डिश में व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक शव रखें. एक ठीक टिप संदंश के साथ अपने सिर खींच कर एक शव काटना.
- (अधिमानतः एल आकार) एक ठीक सुई के साथ महिलाओं (अंदर अंडे के साथ) कम से कम 20 गर्भवती लीजिए और M9 बफर (चित्रा -4 ए) के 10 मिलीलीटर युक्त एक घड़ी गिलास में उन्हें जगह है.
- निम्नलिखित सामग्री पर विचार करके एक axenizing समाधान तैयार: पानी आसुत 6.75 मिलीग्राम, 1.25 मिलीग्राम 5 एन NaOH, और 2.25 मिलीग्राम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ब्लीच समाधान 3% हाइपोक्लोराइट को पतला.
नोट: NaOH एक समाधान दस्ताने, काले चश्मे बुनियादी और सुरक्षात्मक उपयुक्त अन्य हैकपड़े पहना जाना चाहिए.
नोट: ब्लीच प्रकाश में degrades के रूप में, ताजा axenizing समाधान हर समय तैयार करें. Axenizing समाधान के कई बैच तैयार है और कई घड़ी चश्मा में अंडे की सतह नसबंदी और कटाई करते हैं. - M9 बफर बफर समाधान के साथ घड़ी गिलास भरने और एक विंदुक के साथ बफर चूसने के साथ महिलाओं के कम से कम तीन बार कुल्ला. महिलाओं घड़ी गिलास में रहना सुनिश्चित करें. इस कदम दो बार दोहराएँ.
- तुरंत axenizing समाधान जोड़ने और महिलाओं को 10-15 मिनट से अधिक नहीं के लिए इस समाधान में बने रहने की अनुमति देते हैं. (Axenizing समाधान के लिए प्रतिरोधी रहे हैं) अंडे बरकरार रहेगा, जबकि बिखर शुरुआत निमेटोड ऊतकों को ध्यान से देखें.
- मैन्युअल एक सुई या एक स्केलपेल (चित्रा 4 बी, सी) के साथ उन्हें काटने से, प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए महिला निकायों को बाधित. , 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में उन्हें pipetting किसी भी अघुलित ऊतक जोड़ने से बचने के द्वारा अंडे निकालें.
नोट: मी के रूप में प्रयोग करेंकिसी भी microcentrifuge ट्यूबों के रूप में आवश्यक अंडे इकट्ठा करने के लिए और अंडे की व्यवहार्यता axenizing समाधान के लिए जोखिम की एक लम्बी अवधि में कमी होगी, के रूप में जल्दी से काम करते हैं. - "उच्च गति सेटिंग" की मदद से 15 सेकंड के लिए भंवर ट्यूब आगे अंडे से जुड़ी निमेटोड ऊतकों को हटाने के लिए. एक भंवर में उपलब्ध नहीं है, तो वैकल्पिक रूप से, ऊपर pipet और समाधान के लिए कई बार नीचे.
- लगभग 18,000 छ 2 मिनट के लिए centrifugation द्वारा गोली अंडे. अंडे पर्याप्त गोली नहीं करते हैं गति बढ़ाएँ. Axenizing समाधान निकालें और 1 मिनट के लिए 900 XG पर बाँझ आसुत जल और अपकेंद्रित्र के साथ एक बार और microcentrifuge ट्यूब भरकर दो बार कुल्ला.
- पिछले धोने के बाद, बाँझ आसुत जल के 300-500 μl में अंडे resuspend और एक बाँझ 3 सेमी पेट्री डिश या निष्फल घड़ी गिलास में उन्हें जगह है. अंडे अब सतह निष्फल रहे हैं कि याद रखें, ताकि अंडे की पवित्रता बनाए रखने के लिए बाँझ pipettes और / या pippetter सुझावों और पानी का उपयोग करें.
- वे (चित्रा 4D) बरकरार हैं पुष्टि करने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप (30-50X बढ़ाई) के तहत अंडे की जांच करने और जिगर गुर्दे अगर साथ एक 5 सेमी प्लेट को हस्तांतरण (अनुभाग 2.1 देखें)
नोट: यह अगर जरूरत से ज्यादा गीला कर देगा के रूप में प्लेटों पर अंडा निलंबन के 400 से अधिक μl न जोड़ें. - उचित जानकारी के साथ लेबल प्लेटों और 28 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में ईमानदार उन्हें दुकान. अंडे के अंडे सेने स्पष्ट रातोंरात होना चाहिए.
नोट: जल डिश के ढक्कन पर गाढ़ा हो सकता है, लेकिन यह 1 या 2 दिन के बाद लुप्त हो जाएगा. इस समय, अगर की नमी बनाए रखने और उसके सूखने से बचने के लिए प्लास्टिक की थैली में पकवान. - समय समय बर्तन को ध्यान से देखें और कवक या जीवाणु संक्रमण के लक्षण बताते हैं कि किसी भी व्यंजन त्यागें. आई जे एस पेट्री डिश की दीवार पलायन देखा जाता है एक बार, ढक्कन को हटा दें और एक संशोधित व्हाइट जाल से 12 अगर साथ नीचे पकवान हस्तांतरण. Modifie में पकवान स्थानांतरित जब बाँझ शर्तों पर विचारडी व्हाइट जाल उजागर मीडिया के संक्रमण से बचने के लिए.
- जरूरत के रूप में व्हाइट जाल और फसल आई जे निगरानी जारी रखें.
नोट: Aposymbiotic नेमाटोड कई दिनों और हफ्तों के लिए व्हाइट जाल के पानी में विस्थापित करने के लिए जारी रहेगा.
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Representative Results
इन विवो पालन विधि निमेटोड विकास और प्रजनन के लिए मेजबान के रूप में जीवित कीड़े का उपयोग करता है. संक्रमण कक्षों कीड़े आई जे एस उजागर करने के लिए एक कारगर तरीका है. यह किसी अन्य के लिए एक कीट मेजबान से बैक्टीरियल symbionts वैक्टर कि नेमाटोड 'जीवन चक्र में ही मंच है. 1 एक संक्रमण कक्ष के साथ ही इस कक्ष के निर्माण के लिए आवश्यक सामग्री के लिए स्थापित पता चलता है. इन विट्रो पालन के तरीकों की अनुमति EPN एक कीट मेजबान के बिना विकसित करने के लिए, लेकिन यह भी aposymbiotic (symbiont मुक्त) नेमाटोड के पालन के लिए लागू कर रहे हैं. 2 चित्रा अलग निमेटोड चरणों के साथ एक लिपिड अगर थाली से पता चलता है. लिपिड अगर प्लेट भी जैविक प्रजातियों अवधारणा पर आधारित निमेटोड पहचान सत्यापित करने के लिए आवश्यक हैं जो पार संकरण परीक्षण में माना जा सकता है. जिगर गुर्दे अगर विधि मूल Poinar और थॉमस (1966) 14 से वर्णित किया गया था. इस विधि नेमाटोड परिपक्व और reproduc करने की अनुमति देता हैएक कीट मेजबान बिना ई और उनके सहजीवी जीवाणु बिना पीछे नेमाटोड के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी aposymbiotic नेमाटोड उत्पादन). इस पद्धति का एक नुकसान यह अवांछित बैक्टीरिया या कवक विकसित करने के लिए. चित्रा 3 ए आई जे एस थाली के किनारे पर रेंगने साथ जिगर गुर्दे अगर प्लेटों से पता चलता है की अनुमति, क्योंकि उनके अमीर प्रकृति के संक्रमण होने का खतरा है. इस स्तर पर पेट्री डिश के नीचे के हिस्से एक संशोधित व्हाइट फंसाने के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है. चित्रा 3 बी आई जे एस संतान की कटाई के लिए एक संशोधित व्हाइट जाल में Steinernema नेमाटोड के साथ एक जिगर गुर्दे की थाली को दर्शाता है. 4A चित्रा गर्भवती के साथ एक घड़ी का शीशा दिखाता है पहले उनके axenization को Steinernema महिलाओं. 4B चित्रा एक विदारक सुई के साथ महिलाओं के विघटन को प्रदर्शित करता है. चित्रा 4C axenizing समाधान में महिलाओं बाधित पता चलता है. चित्रा 4D निमेटोड Steinernem की एक अक्षुण्ण अंडे से पता चलता हैएक carpocapsae.
EPN के vivo पालन के लिए एक संक्रमण कक्ष की संख्या 1 सेट अप. शीर्ष पंक्ति एक 5 सेमी पेट्री डिश और फिल्टर पेपर से पता चलता है. नीचे पंक्ति एक 10 सेमी पेट्री डिश और फिल्टर पेपर को प्रदर्शित करता है. कीट लार्वा की सूचना संख्या प्रत्येक संक्रमण कक्ष में जोड़ा.
EPN की इन विट्रो पालन के लिए चित्रा 2 लिपिड अगर विधि. छवि वयस्क नेमाटोड मध्यम पर विकसित करने के साथ एक पकवान की एक बंद हुआ (20x बढ़ाई) से पता चलता है.
चित्रा 3 जिगर गुर्दे अगर प्लेट. बाईं ओर छवि एक नेमाटोड के सफल विकास के साथ एक पकवान से पता चलता है. पकवान की ओर रेंगने नेमाटोड नोटिस. छवि बी आई जे नेमाटोड की कटाई के लिए एक संशोधित व्हाइट जाल में रखा एक जिगर गुर्दे अगर थाली से पता चलता है.
Axenizing में गर्भवती महिलाओं के साथ चित्रा 4 घड़ी गिलास समाधान. छवि एक axenizing समाधान में गर्भवती महिलाओं को दर्शाता है. छवि बी एक विदारक सुई के साथ महिलाओं के पीस से पता चलता है. छवि सी प्रदर्शित करता है महिलाओं बाधित. छवि डी निमेटोड Steinernema carpocapsae की एक अक्षुण्ण अंडे से पता चलता है.
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Discussion
एक उपयुक्त मेजबान का उपयोग EPN की विवो पालन में सफल के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है. आमतौर पर, दोनों steinernematids और heterorhabditids पुन: पेश कर सकते हैं और सफलतापूर्वक अधिक से अधिक मोम कीट, गैलेरिया मेल्लोनेल्ला (लेपिडोप्टेरा: Pyralidae) के लार्वा में उनके जीवन चक्र पूरा करें. हालांकि, अलग परिवारों और / या आदेश से अन्य कीड़ों की प्रजाति माना जा सकता है. वर्तमान में वर्णित निमेटोड प्रजातियों में से कुछ एक विशेष कीट की मेजबानी के लिए विशिष्टता है जाना जाता है. उदाहरण के लिए, एस kushidai और एस scarabaei lepidopteran लार्वा को बहुत उग्र नहीं हैं, और इस तरह प्रयोगशाला में सफल पालन के लिए scarab बीटल लार्वा (Scarabaeidae) के रूप में coleopteran लार्वा की जरूरत है. एक अन्य प्रजातियों, एस scapterisci, इस तरह के क्रिकेट या तिल क्रिकेट रूप orthopteran कीड़े पसंद करती हैं.
एक उपयुक्त मेजबान उपलब्ध नहीं है या प्रयोगात्मक स्थिति यह आवश्यकता होती है, जब इन विट्रो तरीकों ईपी के पालन के लिए नियोजित किया जा सकता है जबएन इन विधियों नेमाटोड और उनके बैक्टीरियल symbionts के लिए पोषक तत्वों की एक समृद्ध स्रोत प्रदान करते हैं कि मीडिया का उपयोग करें. इस प्रस्तुति में हम साथ या उनके सहजीवी जीवाणु के बिना सफल विकास और EPN के प्रजनन के लिए उपयोग किया जा सकता है कि अगर (जिगर गुर्दे और लिपिड) के दो प्रकार का वर्णन किया.
उपयोगकर्ता जिगर गुर्दे अगर एक अमीर मीडिया है और इसलिए आसानी से दूषित है कि बारे में पता होना चाहिए. बाँझ तकनीक प्रक्रिया के सभी चरणों के दौरान axenized अंडे और टीका प्लेटें दोनों से निपटने में सिफारिश की है. बैक्टीरिया या कवक के साथ दूषित कर रहे हैं कि प्लेट्स तुरंत खारिज किया जाना चाहिए.
Aposymbiotic Steinernema आई जे एस पालन जब वे Xenorhabdus बैक्टीरिया बंदरगाह सकता है, देखभाल, ठीक से महिला निमेटोड ऊतकों lyse करने के लिए लिया जाना चाहिए. इसके अलावा, आई जे वास्तव में सहजीवी जीवाणु के लिए स्वतंत्र हैं कि मान्य करने के लिए, हम एक हाथ से आयोजित Moto साथ लेग में हौसले से काटा आई जे एस का एक नमूना पीसने की सिफारिश(Heungens एट अल. 2002) के अनुसार 7 मूसल आर संचालित और NBTA मीडिया 1 पर निलंबन थाली. बैक्टीरिया कालोनियों (रातोंरात ऊष्मायन के बाद) पाया जाता है, तो यह एक गरीब axenization तकनीक का एक संकेत है या प्रदूषण का परिणाम भी हो जाएगा.
aposymbiotic Steinernema नेमाटोड का पालन भी प्रक्रियाओं और प्रयोगों की एक विस्तृत सरणी में माना जा सकता है कि एक तकनीक है. पाठकों कई पीढ़ियों पर symbionts बिना पालन Steinernema नेमाटोड के प्रभाव पीढ़ी से अधिक बार निमेटोड फिटनेस और अस्तित्व पर असर पड़ सकता है कि बारे में पता होना चाहिए. कुछ अध्ययनों से प्राकृतिक प्रणालियों 5,11,15-17 में उनके बाँधना की जरूरत का सुझाव. हालांकि, इन अध्ययनों प्रजातियों में से एक सीमित संख्या पर किया गया है और आगे की खोज की जरूरत है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों शेयर प्रयोगशाला के अतीत के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं: मिंग मिन ली, कॅथ्रीन Plichta, विक्टोरिया मिरांडा थॉम्पसन और सैम Kyu किम इन प्रोटोकॉल से कई के सुधार के लिए उनके योगदान के लिए. यह काम सपा शेयर करने के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान IOS-0840932 और IOS-0724978 के हिस्से में वित्त पोषित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For In vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast extract, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H2O, 890 ml | |||
References
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
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- Boemare, N. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. Entomopathogenic Nematology. Gaugler, R. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
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