Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Den Swimmeret systemet Kräftor: En praktisk guide för Dissekering av Nerve Cord och extracellulära Inspelningar av Motor Mönster

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52109
Automatic Translation
1, 1, 1
1Emmy Noether Group, Institute of Zoology, University of Cologne

Abstract

Här visar vi dissektion av kräftor buken nerv sladd. Beredningen består de två sista bröstkorg ganglier (T4, T5) och kedjan av buken ganglierna (A1 till A6). Denna kedja av ganglierna innefattar den del av det centrala nervsystemet (CNS) som driver samordnad förflyttning av pleopods (swimmerets): det swimmeret systemet. Det är känt i över fem decennier som i kräftor varje swimmeret drivs av sin egen oberoende bildgenerator kärna som genererar rytmisk alternerande aktivitet 1-3. De motoriska nervceller som innerverar muskulaturen i varje swimmeret omfattar två anatomiskt och funktionellt distinkta populationer 4. En är ansvarig för upprullning (power stroke, PS) i swimmeret. Den andra driver utdragning (returslaget, RS) i swimmeret. Motor neuroner i swimmeret systemet har möjlighet att producera spontant en fiktiv motormönster, som är identiskt med det mönster registreras i vivo 1.

Syftet med denna rapport är att införa ett intressant och bekvämt modellsystem för att studera rytmgenere nätverk och samordning av oberoende mikrokretsar för elevernas praktiska laboratoriekurser. Protokollet tillhandahålls innehåller steg-för-steg-instruktioner för dissekering av kräftor s buken nerv sladd, sätter den isolerade kedjan av ganglier, desheathing ganglierna och registrera swimmerets fiktiva motormönster extracellulärt från isolerade nervsystemet.

Dessutom kan vi övervaka aktiviteten hos swimmeret nervceller inspelade intracellulärt från dendriter. Här också beskriver vi kortfattat dessa tekniker och ge några exempel. Vidare kan bedömas morfologi swimmeret nervceller med hjälp av olika färgningstekniker. Här ger vi exempel på intracellulära (genom jontofores) färgämnesfyllda nervceller och återfyllning av pooler av swimmeret motoriska nervceller. I vårt labbvi använder detta preparat att studera grundfunktioner fiktiv locomotion, effekten av sensorisk återkoppling på aktiviteten i CNS, och samordningen mellan mikrokretsar på en cellulär nivå.

Introduction

De swimmerets av kräftor tjäna en funktion i hållning kontrollen och slog rytmiskt när djuren simmar framåt, ventilera sina hålor eller honor lufta sina ägg 5, 6. De swimmerets av signalkräfta, Pacifastacus leniusculus, uppträder i par från den andra till den femte buken segmentet, med en lem på vardera sidan av buken 7. Det centrala nervsystemet producerar på egen rytmiska motor smattra som driver swimmeret rörelse i intakta djuret såväl som i den isolerade nerv sladd beredningen. När det inte finns någon sensorisk återkoppling eller fallande ingång närvarande den rytmiska motormönstret produceras kallas fiktiv locomotion 1, 2. I swimmeret systemet denna motor mönster skiljer sig inte i någon parameter från aktiviteten av swimmerets mäts i intakta djur.

Förflyttningen av varje swimmeret drivs av en mikrokrets som är placerad i och begränsat till en corresponding hemiganglion 1 -. 3 I varje mikrokrets finns en bildgenerator kärna som innefattar fem identifierade icke spiknings interneuronen. De kan funktionellt karakteriseras som antingen Inhibitor of Power Stroke (IPS) eller hämmare av Return Stroke (IRS) 8. Dessa IPS och IRS interneuronen inte endogena oscillatorer, snarare deras alternerande aktiviteten drivs av ömsesidig inhibition 9. Eftersom dessa interneuronen hämmar swimmeret motoriska nervceller direkt, är den alternerande PS-RS rörelse genererade 10. Locomotion dock inte bara kräva generering av verksamheten, men också samordning av olika oberoende mikrokretsar. I swimmeret systemet sådan samordning upprättas av den samordnande mikrokrets som säkerställer att lemmar är aktiva vid rätt tidpunkter. Denna mikrokrets är byggd av tre identifierade nervceller i varje segment 11-15.

Detta protokoll föreskriver the första gången en steg-för-steg-dissektion guide att isolera kedjan av ganglier (T4 till A6, figur 1). Vi visar hur till stift den isolerade buken nerv sladd och desheathe varje ganglion. I detta isolerade nervsystemet förberedelser, de nervceller som ansvarar för swimmeret rörelse är redo för användning i elektrofysiologiska och morfologiska experiment. Den andra delen av detta protokoll visar huvuddragen i den swimmeret motormönstret. Detta inkluderar en steg-för-steg-guide till extracellulärt rekord aktiviteten av swimmeret motoriska nervceller. Axoner av RS motoriska nervceller skjuta ut genom den främre grenen av nerven N1, medan axoner av PS motoriska nervceller skjuta ut genom den bakre grenen av samma nerv (fig 1) 4. Därför kan spelas in sin verksamhet från dessa grenar med differentialstiftelektroder.

Figur 1
Figur 1: Isolerad nervsystemet från bröstkorg ganglion 4 (T4) till buken ganglion 6 (A6) och ett schematiskt diagram av det T4:. Bröstkorg ganglion 4; T5: bröstkorg ganglion 5; A1, A2 ... A6 buken ganglion 1, buken ganglion 2 ... buken ganglion 6; N1: nerv N1; N2: nerv N2; N3: nerv N3; PS: power-takt; RS: retur-stroke. Riktnings förkortningar: A = anterior; P = posterior.

Denna dissektion förfarande och elektrofysiologiska tekniken demonstreras är praktiskt för studenter och kan komplettera elev praktiska kurser i fysiologi. Det isolerade kedja av ganglier har använts i ett antal experiment för att studera nervsystemets funktion, samordning, eller modulering av swimmeret mikrokretsar 6 liksom neuronal kontroll av adaptivt beteende i locomotion 16, 17. Det kräftor swimmeret Systemet tillhandahåller således en enorm mängd intressant undervisning eller tregnar möjligheter som alla börjar med dissektion av den ventrala nerv sladd av kräftor och extracellulärt inspelning av den fiktiva motormönstret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna dissektion förfarande i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv av den 22: a september 2010 (2010/63 / EU).

1. Förberedelse

  1. Skaffa kräftor, Pacifastacus leniusculus (Dana), av båda könen ≥8 cm i storlek. Se till att djuren är vital och buken och buken lemmar är intakta.
  2. Var noga med att inspektera ryggskölden och att denna nagelband är hård och stel. Pre- och postmolt djur har en mjuk ryggsköld och är inte lämpliga för experiment eftersom under ömsat processen många parametrar förändras (t.ex. minskning i rörelseaktivitet).
  3. Montera alla verktyg och material som används under dissektion, pinning och desheathing av nerv sladd som visas i figur 2 och som anges i tillägg tillhandahålls.

Figur 2
Figur 2:

(1) stor hink fylld med is; (2) kräftor saltlösning; (3) koksalt dispenser; (4) dissektion mikroskop; (5) dissektion skålen; (6) starka sax; (7) pincett (8) våren sax; (9) petriskål fodrad med tydliga sylgard; (10) fäststift; (11) kall lampkälla.

2. Brutto Dissection

  1. Bedöva djur på is under 15 - 20 min. Utför den första delen av brutto dissektion vid ett labb bänk nära diskhon eftersom det innehåller en blodtappning steg och provet måste sköljas regelbundet med kräftor saltlösning under förfarandet.
  2. Håll djuret ventrala sidan uppåt och använda starka sax för att klippa båda klorna på sina baser nära bröstkorgen (Figur 3-1). Ta vänster och höger uropod (Figur 3-2).
  3. Placera djuret ventrala sidan uppåt i dissektion skålen fodrad med svart sylgard. Elevate cephalothorax genom insättning is under och stift buken vid den mellersta stjärtfenan (Figur 4A).
  4. Fyll saltbehållaren helt med ~ 60 ml kyld kräftor saltlösning. BEGJUTA kräftor med kall saltlösning genom klo öppningen (Figur 4B). Överskott saltlösning kommer rinna av genom nedskärningarna vid uropods. Täck kräftor med is under exsanguination
  5. Halshugga djuret med en enda tvären bara posteriort djurets ögon som använder starka sax (Figur 5A). Ta bort alla promenader benen nära basen lederna såsom anges i figur 5B.
  6. Isolera buken med de sista bröstkorg segment från resten av cephalothoraxen. Gör ett första skär på samma nivå som de andra walking benen (thoraxsegment 3) genom att föra in spetsen på saxen i öppningen av den andra gång benet och skär till den motsatta sidan. (Figur 6A-1).
  7. Utöka denna första snittet till båda sidor genom than cephalothorax (Figur 6A-2).
  8. Vänd djuret öppen för att göra några av de inre organen synliga. Skjut framstående matsmältningskörteln (Figur 6B-3) till den främre delen av provet och använda pincett för att ta bort de reproduktiva organ från bukhålan.
  9. Ta den främre delen av cephalothorax (figur 6C). Använd sido nedskärningar för att ta bort sido delar av ryggskölden, som täcker gälarna, på båda sidor om den återstående thorax (figur 6D-4). Ta gälarna och skölj provet med kall saltlösning.
  10. Fortsätt dissektion med ett snitt genom hela längden av den sternala plattan såsom indikeras i fig 6E-5. Gör denna nedskärning på maximala sidolägen mellan pleuron och swimmerets (Figur 6E röda markeringar). Fortsätt på den andra sidan med en samma snitt. Skölj provet med kall saltlösning.
  11. Utför återstående dissektion under ett dissection mikroskop. Placera kräftor mage ventrala sidan uppåt i dissektion skålen fodrad med svart sylgard och fylld med kräftor saltlösning så att den täcker exemplaret.
    OBS: Följande steg (2,12-4,8) innehåller riktningsanvisningar som gäller för högerhänta praktiker. I följande steg (2,12-6,8) är det viktigt att ersätta kräftor saltlösning i jämna mellanrum, varje 20-30 min med kall saltlösning, för att hålla nervsystemet friskt.
  12. Fäst provet med insektsnålar posteriort vid den mellersta stjärtfenan och anteriort vid resterna av ryggskölden. Placera provet så att den mellersta stjärtfenan pekar åt vänster och är parallell med bordets kant.
  13. Använd grova pincett i vänster hand för att greppa genom en gång benöppning (figur 7A) och dra preparatet öppna (figur 7B vit pil). Identifiera de stora två dorsala flexor muskelsträngar (figur 7B-1 och C-1) och minska sina ventralabasis som visas i figur 7B.
  14. Identifiera sternala artären (Figur 7C-2), som härstammar från rygg (hjärtat) till ventrala, vid 4: e bröstkorg segment. Denna artär ligger precis ovanför nerven sladden (Figur 7C-3), innan den skjuter under nerven sladden, som bildar den ventrala artären.
  15. Transekt sternala artären. Som visas i figur 7C, lyfter artären först, enligt ett blad av saxen, och bara skära när ventralt belägna nerv sladd syns.
  16. Fäst rygg flexor musklerna anteriorly (till höger). Detta bör göras i maximalt utsträckt läge med pinnar så att de inte kommer att blockera vision och provet förblir sträckt. När ryggmuskel strängarna är fasta (Figur 8-1), den första buken ganglierna, A1 och A2, med tillhörande nerver N1, N2 och N3 är synliga (Figur 8).
  17. Använd pincett i vänster hand för att ta tag i specimen vid en öppning av vandringsbenen. Under hela följande dissektion steg dra försiktigt för att hålla provet öppna.
  18. Transekt nerverna N3 på den mest avlägsna position från nerven sladden. (Figur 8-3).
  19. Skär flexormuskler nära den ventrala apodeme såsom visas i fig 8-4. Se till att inte skada nerven sladden eller nerver N2.
  20. Upprepa stegen 2.18 och 2.19 för nerverna N3 och flexor musklerna i de återstående buken ganglierna A2 till A5.
  21. Vid det sista buken ganglion, A6, klippa rygg flexor musklerna från ventrala apodeme och provet bör se ut som visas i figur 9.
  22. Skär sternala plattan posteriort nerver A6 (Figur 9-1) och hålla den ventrala delen (Figur 9-2). Kasta ryggdelen med flexor musklerna (Figur 9-3). Fäst sternala plattan anteriort med stift genom öppningarna i walking ben,och posteriort till A6.

3. Fin Dissection

  1. Placera provet under mikroskop med den främre delen riktad bort och den bakre delen mot borden "kant.
  2. Använd pincett som visas i figur 10A för att avlägsna de mest anteriora delarna av cephalothoracic sterna.
    OBS: bröstkorg ganglier och tillhörande nerver täcks delvis av benet muskulaturen och cephalothoracic sterna. Den cephalothoracic sterna bildar ett skelett som separerar de i sidled belägna hålrummen i de gående ben från varandra och från den mediala hålighet i vilken den ventrala nerven sladden bosatt.
  3. Skär musklerna mellan de återstående exoskeletal strukturer som anges i figur 10B -1 och B2. Använd pincett för att ta tag i och lyfta den främre änden av den ventrala nerv sladd (Figur 10C).
    OBS: Den nerv sladd kommer att skadas i processen så undvik att plocka upp nerve sladden flera gånger.
  4. Skär bröstkorg nerver i sidled medan du lyfter nervsladden (Figur 10C-3). Förvara dessa nerver vid lämplig längd för fastlåsning. Avlägsna pressas en del av kedjan av ganglierna, som plockades upp med pincett, genom att skära bort all vävnad anterior till T4 (Figur 10C-4).
  5. Placera objektet med den främre delen till vänster och fokusera på A1. Skär nerver N1 och N2 i A1 vid en lämplig längd (max. 1 cm) för att klämma fast dem.
  6. Fokus på A2 och identifiera nerverna N1, N2 och N3 i detta segment (Figur 11). Nerverna N1 i buken ganglierna A2-A5 uppe mellan två sternala cuticular infoldings i varje segment (Figur 11A-1) och omfattas av muskulatur. Gör ett snitt längs bakre sternal cuticular infolding. Starta vid den laterala kanten av buken och vidare mot mittlinjen, såsom visas i figur 11A.
  7. Om målet N1 fortfarande vikröd med vävnad som visas i figur 11B (röd pil), skär tvärs muskelknippet, men den här gången anterior både sternala cuticular infoldings och nerven N1 (Figur 11B-2).
  8. Skär nerv N1 så distalt som möjligt (Figur 11C-3). Nerv N1 är fullt synliga och den främre och bakre gren kan identifieras (Figur 11C).
  9. Gå vidare till den kontranerv N1 och först klippa musklerna längs bakre sternal cuticular infolding, start medialt, nära ganglion (Figur 11D). Om nerven är fortfarande täckt av vävnad, skär tvärs över muskelknippet, men den här gången anterior både sternala cuticular infoldings och nerven N1, liknande figur 11B-2. Skär nerven N1 så distalt som möjligt.
  10. Skär nerver N2 av denna ganglion till en lämplig längd (ca. 0,5 cm) för fastlåsning.
  11. Upprepa steg från 3,7 till 3,11 för nerverna A3-A5.
  12. Skär nerves av ganglion A6 så distalt som möjligt (Figur 12A). Använd pincett för att ta flera nerver av A6 för att lyfta denna ganglion och börja isolera kedjan ganglier från sternala plattan.
  13. Samtidigt som man lyfter nerven sladden, dra den försiktigt i främre riktning som visas i figur 12B (vit pil). Som de enskilda ganglier lyfts bort den ventrala artären som kan fästas på den ventrala sidan av nerv sladd (Figur 12C). Fortsätt denna (försiktigt) Dra-cut sekvens tills nerven sladden är helt isolerade.
  14. Överför isolerade kedjan av ganglier till en petriskål fodrad med tydlig Sylgard och fylld med kräftor saltlösning (Figur 12D).

4. Nålning Nerve Cord i petriskålen

OBS: Använd små stift skurna ur rostfritt stål (se tillägg) till stift nerven sladden. Peka bara nerven slutar med pincett och inte squeeze de konnektiv eller ganglier.

  1. Nåla kedjan av ganglier i en rak linje, samtidigt som ett lätt stretch.
  2. Ordna nerven sladden i petriskålen med ryggsidan uppåt (figur 13, svart linje). Den ventrala sidan av ganglierna kan identifieras genom sin konvexitet; ryggsidan är platt. Nåla de bröstkorg nerver åt sidorna. Fortsätt med nerver A6, stretching nerven sladden längs sin längdaxel.
  3. Stift nerver av A1 vid en 90 ° vinkel i förhållande till den nerv sladd.
  4. Gå vidare till A2 och stift nerver N2 vid en vinkel av 35-45 ° i förhållande till den nerv sladd (Figur 1A).
  5. Separera nerverna N1 i sina främre och bakre grenar innan pinning som visas i figur 14. Använd två par fina pincett för att plocka upp med en pincett den främre och den andra den bakre grenen av nerv N1. Var noga med att plocka bara de mest distala ändens av nervgrenar. Dra nu dem noga isär.
  6. Pin den främre grenen av nerven N1 vid en 90 ° vinkel i förhållande till den nerv sladd (Figur 1A). Nåla den bakre grenen av nerv N1 mellan den främre N1 gren och nerven N2.
  7. Upprepa steg 4,4-4,6 för nerverna ganglier A3-A5. Medan fixera nerven sladden stretch den i längd samt tvärgående riktningar.

5. Desheathing ganglierna

  1. Placera beredningen på ett sådant sätt att försöksledaren händer alltid vilar på en stabil plan för att undvika skakning. För att desheath de ganglierna belysa nerven sladden underifrån.
  2. Fokus på någon buken ganglion A1 till A5. Använd fina våren sax för att göra ett litet sido snitt genom ganglion slida, posteriort om ganglion och mellan nerverna N2 och N3 (Figur 15A röd pil).
  3. Plocka upp ganglion fodralet med mycket fINE pincett och skär tvärs över manteln ovanför konnektiv, såsom anges i figur 15A-1. Se till att inte klämma eller skära nerven sladden med saxen.
  4. Fortfarande håller och lyfta ganglion slida med pincett fortsätter att skära den längs sido gränser ganglion (Figur 15B-2 och -3). Avlägsna manteln. Alternativt stift den till båda sidor av konnektiv på ett sådant sätt att den är fast men nerven sladden inte kläms.
  5. Upprepa steg 5,2-5,4 för alla buken ganglierna A1 till A5.
  6. Desheathe bröst ganglierna och ganglion A6 på ett liknande sätt. För att desheathe A6 start anterior till ganglion och vidare i bakre riktning. Nåla ganglion mantel av A6 till den bakre änden av kedjan av ganglierna.

6. Extracellulärt Inspelningar från Motor nervceller

  1. Montera alla verktyg och material som används för extracellulära inspelningar visas in Figur 16B och som anges i tilläggen. En översikt av inspelningen installationen visas i figur 16A. Starta all elektronisk utrustning som används i detta experiment (figur 16C), så att förstärkarna kan värmas upp i minst 30 minuter före inspelningen. Slå på datorn och starta inspelningsprogram.
  2. Placera kedjan av ganglierna på mikroskopbordet och belysa underifrån. Sätt i inspelnings elektroden i Sylgard nära målet nerv och referenselektroden vid en position i närheten, men lateralt till ganglierna (figur 17A och B). Böj målet nerv runt inspelningen elektroden (Figur 17C).
  3. Sträck nerven något, för att säkerställa kontakt mellan elektroden och nerv och stift den åt sidan (F igure 17D). Fäst elektrodkablarna till mikroskopbordet använder modellera, så de stannar i önskat läge.
  4. Använd enspruta fylld med vaselin och en 20 gauge nål (med rundad spets) (Figur 17E-3) för att isolera målet nerven från bad lösningen. Första sandskädda lite vaselin på sylgard runt inspelningen elektroden. Resultatet är ett lager av vaselin som täcker Sylgard i närheten av den registrerande elektroden (Figur 17E-4). Se till att inte direkt sandskädda på nerven och undvika luftbubblor i detta skikt.
  5. Täta inspelningen elektroden med vaselin från alla sidor upp till ytnivån av saltlösning (Figur 17F).
  6. Upprepa denna procedur för alla målgrupper nerver vars verksamhet bör följas.
  7. Starta inspelningen. Använd en kontinuerlig eller gap fritt förvärvsläge och en samplingshastighet på 5 kHz. Ställ den extracellulära förstärkaren till följande parametrar; vinna till 1.000 (förstärker signalen 1000 gånger, vara noga med att inkludera denna förstärkning parameter i inställningarna förvärvs programvara) enda bandpassfilter intervallet 300 Hz (låg cut) till 2.000 Hz (hög cut).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med de samtidiga extracellulära inspelningar från RS och PS, motoriska nervceller i en ganglion, den alternerande aktiviteten hos dessa motorneuron pooler, kan övervakas (Figur 18), som representerar den fiktiva locomotion mönstret.

Figur 18
Figur 18: Schematisk bild av en ganglion och placering av differential nålelektrod Extracellulär inspelning av RS motoriska nervceller (övre kurvan) och PS motoriska nervceller (lägre spår)..

Den extracellulära PS aktivitet ipsilaterala PS 2 till PS 5 motoriska nervceller belyser intressanta aspekter av intersegmental samordning i swimmeret systemet (figur 19A).

Först aktiviteten börjar alltid med en PS brast i A5 (Figur 19A, 4: e spår) och excitation vågen propagerar i den främre riktningen (<strong> Figur 19A, grön linje). För det andra, den period (som är den tid som mäts från början av en skur till uppkomsten av nästa skur) i varje segment är konstant (Figur 19A, cyan pil). Detta är sant, så länge informationsflödet från ett ganglion till nästa är intakt och de experimentella förhållandena inte förändras.

I olika preparat eller under olika experimentella förhållanden perioder och brast löptider kan variera kraftigt: från perioder av 0,25-1 sek. För att jämföra dessa parametrar mellan olika preparat, måste de normaliseras och visas i en fas histogram (Figur 19B). Detta avslöjar den tredje intressant aspekt av motor mönster: fas-lag mellan segmenten, den intersegmental fördröjningen, förblir konstant och oberoende av frekvensen av rytmen.

För att beräkna en fas histogram, följande mätningar och beräkningar är necessary:

Först, har en referens spår som skall väljas. Vanligtvis använder vi PS spår av de mest bakre ganglion (t.ex. PS 5) som referens (som tid 0) för en fas histogram över swimmeret rytmen inspelad över flera segment (Figur 19A) .Tryck sedan, mät perioden (i ms ) av rytmen från början av en PS 5 skur (tid 0, figur 19A, orange streckad linje) till början av nästa PS 5 skur (Figur 19A, cyan pil) .Within denna cykel, mäta latenser (i ms ) mellan starten av PS 5 brast (tid 0) och start (burst debut, figur 19A och B, apelsin pilar) och slutet (offset Figur 19A och B, violett pilar) i PS brast i varje annan ganglierna . Därför att beräkna fasen debut och offset för varje skur latenser divideras med samtidig perioden. Dessa mätningar kommer att resultera i numerisk values ​​mellan 0 och 1. Slutligen plotta dessa värden i en fas histogram som visas i figur 19B.

Den resulte fas histogram (Figur 19B) innehåller information om arbetscykeln för PS brast i varje segment. Och intersegmental fas-lag på ~ 0,25 mellan grann segment syns tydligt.

Figur 19
Figur 19: (A) Schematisk bild av elektrodplacering och extracellulärt inspelning av ipsilaterala PS 5 till PS 2. (B) Mätningar och beräkningar som behövs för fas histogram. Fasen histogrammet beräknades från tio på varandra följande skurar (n = 10) visar intersegmental fasfördröjningen av ~ 0,25.

För mer avancerade praktiker, kan intracellulära inspelningar med skarpa microelectrodes från dendriter av motoriska nervceller vara användbara. De membranpotentialerindividuell intracellulärt inspelade PS motoriska nervceller visar i fas svängningar med extracellulärt inspelade aktiviteten hos alla PS motoriska nervceller i samma hemiganglion (Figur 20, grå paneler). Alternativt kan spelas in RS motoriska nervceller eller interneuronen intracellulärt på samma sätt (data visas ej).

Figur 20
Figur 20:. Schematisk bild av elektrodplacering Membran potential en intracellulärt inspelade PS motorneuron (övre kurvan) oscillerar i fas (grå paneler) med PS-aktivitet extracellulärt registreras (nedre kurvan).

För identifiering av intracellulärt inspelade nervceller (interneuroner eller motoriska nervceller), kan cellerna vara färgämne fylld med vassa mikroelektroder och jontofores (se diskussion). I Figur 21, två intracellulärt färgämne fyllda PS motoriska nervceller visas. Deras ventral somataär belägna posteriort till basen av nerven N1. De primära neurite projekt anteriort (Figur 21B-2) och grenar inom Lateral neuropil (Figur 21A och B-3); axonet projekt genom den bakre grenen av nerv N1 till swimmeret muskulaturen (Figur 21B-4).

Figur 21
Figur 21: (A) Schematisk bild av en buken ganglion (B) Två intracellulärt färgade PS motoriska nervceller.. (1) somata; (2) primära neuriter; (3) dendritiska förgrening i sido neuropil; (4) axoner projektet genom den bakre grenen av nerven N1; Bar = 100 pm.

För mindre avancerade praktiker, eller de som vill studera morfologi buken ganglion, återfyllning från PS och RS motorneuron pooler via nerv N1, är en intressant övning. I fig 22, RS och PS motoriska nervceller i en hemiganglion färgades med Co 2+ (RS) och Ni 2+ joner (PS), respektive. Somata av PS motoriska nervceller ligger posteriort basen av nerv N1 (Figur 22-1). Alla somata av RS motoriska nervceller ligger anterior till basen av nerven N1 (Figur 22-2).

Figur 22
Figur 22: återfyllning från den främre (orange, Co 2+) och bakre (blå, Ni 2+) gren av nerv N1 (1) somata av PS motoriska nervceller;. (2) somata av RS motoriska nervceller. Bar = 100 pm.

Figur 3
Figur 3: Borttagning klorna (1) och uropods (2). Röda linjer (1) och (2) indikerar positioner av nedskärningar. Bar = 5 cm.


Figur 4:. (A) Djuret nålas ventrala sida upp och fixeras vid den mellersta stjärtfenan (B) Kräftorna är tömdes på blod genom klo öppningen med kall saltlösning. Bars = 5 cm.

Figur 5
Figur 5: (A) Halshuggning och (B) avlägsnande av gångbenen. Röda linjer indikerar positioner av nedskärningar. Bars = 1 cm.

Figur 6
Figur 6: (A, B, C och D) Avlägsnande av den främre och de laterala delarna av cephalothoraxen. E. Öppnande av buken längs den laterala sidan.Röda linjer (1), (2), (4), och (5) anger positioner för skärsår. (3) Digestive körteln. Röda pilar pekar på redan öppnat bukhålan. Bars = 1 cm.

Figur 7
Figur 7: (A) Provet gripit vid en öppning av vandringsbenen (röda pilar) (B) Den dorsala muskelsträngar (1) är transected medan provet öppnas.. Vita pilen visar i vilken riktning den sternala plattan dras. (C) Översikt av bukhålan med bröstartären (2) och nerv sladd (3).

Figur 8
Figur 8: Tvär bild av kräftor buken med fast rygg muskel trådar (1) och bröstartären (2); Röda linjer (3) och (4) indikerar positioner av nedskärningar. Barer= 5 mm.

Figur 9
Figur 9: Dorsal och ventrala delar av buken är separerade från varandra (1) Röd linje visar position snitt.. Sternala plattan (2) med ventrala nerv sladd; ryggdelen av buken (3).

Figur 10
Figur 10:.. (A) Placering av pincett för att ta bort den främre cephalothoracic sterna (B) Röda linjer (1) och (2) ange var att klippa musklerna mellan de återstående cephalothoracic sterna (C) De bröstkorg nerver transected på de röda linjer (3) för att isolera den thorax ganglierna från den omgivande vävnaden. Röd linje (4) indikerar snittet mellan T3 och T4. Bars = 5 mm.


Figur 11: (A och B) Vy över bröstplattan på A2. Nerven N1 isoleras från vävnaden med ett snitt längs den posteriora sternala cuticular invikning (1) och främre till både sternala cuticular infoldings (B 2). (C) Högre förstoring av regionen kring A2, med den isolerade nerven N1. ( D) Isolering av nerv N1 på kontralaterala sidan med liknande nedskärningar. Röda linjer (2) och (3) indikerar positioner av nedskärningar; (1) främre och bakre sternala cuticular infoldings; Bars = 5 mm.

Figur 12
Figur 12: (A och B) A6 isoleras från vävnaden och nerven sladden kan lyftas vid nerver A6 (C). (D) Isolerad nerv sladd överförs i en petriskål fodrad med tydliga sylgard och fylld med saltlösning. Röda linjer indikerar positioner av nedskärningar. Bars = 5 mm.

Figur 13
Figur 13: Lateral bild av en ganglion Namnet på rygg och ventrala sidan (svart linje) i nerv sladden.. Bar = 5 mm

Figur 14
Figur 14: Den främre grenen av nerven N1 separeras från den bakre grenen Bar = 5 mm..

Figur 15
Figur 15: Anvisningar för desheathing av en buken ganglion (A) Position för första litet snitt genom manteln av konnektiv (röd pil), placerade i sidled och bakre till ganglion. Den efterföljande snitt genom manteln ovanför bind markeras med den röda linjen (1). (B) Röda linjer (1) och (2) markerar nedskärningarna längs sido gränser ganglion. Manteln kan efteråt dras från ganglion. Bars = 1 mm.

Figur 16
Figur 16:. (A) Översikt över inspelningsinställningar (B) Material och verktyg som behövs för extracellulära inspelningar. C. Nödvändig utrustning för elektrofysiologiska inspelning. (1) kallt lampa källa; (2) Faradays bur; (3) stereomikroskop; (4) air-bord; (5) mikroskop bord; (6) spegel; (7) differentialstiftselektroder; (8) spruta fylld med petroleumgelé; (9) modellera; (10) pincett; (11) bortskaffande flytande avfall; (12) digitizer; (13) extracellulärt förstärkare; (14) dator, utrustad med inspelningsprogrammet och bildskärm.

Figur 17
Figur 17: (A och B) Position för inspelning (1) och referens (2) stift elektrod. (C och D) Den bakre grenen av nerven N1 är böj runt inspelningen elektroden. E. bas (4) av den registrerande elektroden är isolerad med vaselin. F. Den kompletta inspelningen elektroden är isolerad med vaselin från badet lösningen. (3) spruta fylld med vaselin. Bars = 2 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anatomi kräftor och deras buken ganglierna har beskrivits tidigare 5, 18, ​​19, 20 och det rekommenderas att bekanta sig med dem innan dissekering för att undvika kapning viktiga nerver.

Det är viktigt att hålla beredningen vid temperaturer under 23 ° C för att förhindra nedbrytning av isolerade nerv sladd. Detta kan åstadkommas enkelt genom ersättning av badlösningen varje 20-30 min med kall kräftor saltlösning. Under dessa omständigheter kedjan ganglierna kan användas för elektrofysiologiska experiment för upp till 12 timmar.

Ibland swimmeret motoriska nervceller är inaktiva och visar ingen spontan bristning aktivitet. Den kolinerga agonisten karbakol används för att framkalla bristning aktivitet i dessa preparat. Löses i kallt kräftor saltlösning, bad tillämpningar av 1-3 jiM karbakol är tillräcklig för att aktivera swimmeret rytm 21.

ove_content "> Den fiktiva förflyttning och särskilt samordning av armar och ben som registrerats i detta system ger en hel del information om de cellulära egenskaper rytmisk aktivitet och samordning. I detta system de neuronala komponenter 8-10 av de lokala mikrokretsar identifieras och dessutom samordnande nätverk är känd i cellulär detalj 11,14,15. Resultaten dras från experimenten utförda med extracellulära inspelningar, tillåter redan förutsägelser för matematiska modeller och för roboticists.

Alla swimmeret nervceller visar dendritiska förgrening inom Lateral neuropil och kan intracellulärt registreras från dessa dendriter. I fig 20, är en intracellulär inspelning av en PS motor neuron visas. För detta en skarp mikroelektrod (se tillägg) fylld med en M KAc + 0,1 M KCl (elektrodresistans mellan 35-45 Mohm) placeras ovanför Lateral neuropil. De oscillerande membranpotentialer som wkan registreras ELL spikar från dendriter av PS och RS motoriska nervceller när elektroden sätts in nära basen av nerven N1.

Att färga individuella neuroner (t.ex. motoriska neuroner) intracellulärt såsom visas i figur 21, måste den kraftiga mikroelektroden dessutom vara fyllt med fluorescerande färgämne (t.ex., en% dextran Texas Red, se tillägg) upplöst i 1 M KAc + 0,1 M KCl. För att fylla motoriska nervceller intracellulärt genom jontofores, polariserande pulser av 1 nA med en löptid på 250 ms vid 2 Hz tillämpas i minst 10 minuter. För positivt laddade färgämnen använder depolariserande pulser och för negativt laddade färgämnen använder hyperpolarizing pulser. Längre fyllningar resulterar i en starkare märkt neuron. För visualisering nerven sladden bör fastställas, uttorkad, och monterade 22.

En metod för att färga en pool av motomeuroner är att använda återfyllning från nerv N1 (figur 22) 4, 23. Placera en väl vaselin runt bakre gren av nerv N1 att återfyllning den pool av PS motoriska nervceller. Att färga den pool av RS motoriska nervceller en väl placeras på den främre grenen av nerv N1. Den kräftor saltlösning i brunnen ersätts av DDH 2 O. Skär sedan denna nerv inuti väl och låt den stå 15 minuter i DDH 2 O vid rumstemperatur (RT). Därefter byter DDH 2 O i brunnarna med antingen 5% CoCl2 - eller 5% NiCl2 - lösning (löst i DDH 2 O) och nära brunnar med vaselin. Provet måste inkuberas under minst 15 h vid 4 ° C. Öppna brunnarna, ta bort färgen och skölj provet 3 gånger med saltlösning. Fällning av Ni2 + eller Co2 + joner med 10 droppar Dithiooxamid (mättad lösning löst i 100% EtOH) för varje 10 ml kräftor koksaltlösning i Petri-skålen, under huven för 20 min vid RT. Ni2 + - joner kommer att fällas till blått Ni (SCH) och Co 2+

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi tackar Jos Burgert för att hjälpa till med några av siffrorna. Vi är tacksamma för Ingo Selbach (och gruppen "Edelkrebsprojekt NRW") för hans ansträngningar att leverera labbet med försöksdjur. Vi tackar Anna C. Schneider för korrekturläsning första versionerna av manuskriptet. Denna forskning stöds av en Emmy Noether DFG bidrag SM 206 / 3-1 och en startbidrag vid universitetet i Köln för kvinnliga lärare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-channel extracellular amplifier: MA 102  Amplifier Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany
air-table Technical Manufacturing Corporation
(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA		 63-534
Axon Digidata 1440A Digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA DD1440A
big bucket 
Clampex & Clampfit pClamp 10, recording and analysis software Molecular Devices Design, Union City, CA pClamps 10 Standard
cold lamp source with flexible light guide (fiber optic bundle)  Euromex microscopes holland, Arnhem, BD LE.5211 & LE.5235
computer and monitor equipped with recording software
container and pipette for liquid waste 
crayfish saline  contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. 
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) fluorescent dye, lysine fixable Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany D3328
dissection dish  (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone
faraday cage
fixing pins
forceps (biology, Dumont #5) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11252-20
forceps (biology, Dumont #55) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11255-20
forceps (electronic, Dumont #5) Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11251-20
intracellular electrode Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament Sutter Instruments, Novato, CA BF100-50-10
Leica S8 Apo StereoZoom Dissection Microscope                       Zoom 1x - 8x Leica, Germany 10446298
microscope table
mirror to illuminate preparation from below
modeling clay
Olympus SZ61 Dissection Microscope                       Zoom 0.67x - 4.5x Olympus, Germany
petri dish  94 x 16 mm; lined with clear silicone Greiner bio-one, Germany 633180
ring scissors ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm Fine Science Tools (FST), Germany 14054-13
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm Fine Science Tools (FST), Germany 15024-10 or          15000-08
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm Fine Science Tools (FST), Germany 91500-09 or           15396-00
sylgard 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
  2. Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).
  3. Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
  4. Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
  5. Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
  6. Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
  7. Huxley, T. H. The crayfish: An introduction to the study of zoology. , MIT Press. Cambridge, MA. (1980).
  8. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
  9. Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
  10. Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
  11. Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
  12. Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
  13. Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
  14. Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
  15. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
  16. Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
  17. Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
  18. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
  19. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
  20. Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
  21. Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
  22. Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts - Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
  23. Altman, J. S., Tyrer, N. M. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. Strausfeld, N. J., Miller, T. A. , Springer. New York, NY. 373-402 (1980).

Tags

Neurobiologi kräftdjur dissektion extracellulärt inspelning fiktiva locomotion motoriska nervceller locomotion
Den Swimmeret systemet Kräftor: En praktisk guide för Dissekering av Nerve Cord och extracellulära Inspelningar av Motor Mönster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seichter, H. A., Blumenthal, F.,… More

Seichter, H. A., Blumenthal, F., Smarandache-Wellmann, C. R. The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern. J. Vis. Exp. (93), e52109, doi:10.3791/52109 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter