Abstract
在这里，我们证明小龙虾腹部神经索的解剖。该制剂包含的最后两个胸神经节（T4，T5）和腹腔神经节的链（A1到A6）。这种链节包括中枢神经系统（CNS），其驱动所述腹肢（游泳足）的协调运动的部分：游泳足系统。它是已知的，在小龙虾每个游泳足由它自己的独立模式生成内核生成节奏交替活动1-3从动超过五十年。运动神经元支配每个游泳足的肌肉组织包括两个解剖学和功能上不同的人群4。一个是负责对游泳足的缩回（动力行程，PS）。其他驱动游泳足的前伸（回击，RS）。所述游泳足系统的运动神经元都能够自发产生假想马达模式，这是相同的记录在体内图案1。
本报告的目的是介绍一个有趣和方便的模型系统研究的节奏生成网络和协调学生的实践课程，实验室独立的微电路。所提供的协议包括一步一步的说明小龙虾的腹神经索的解剖，神经节钉扎的孤立链，desheathing的神经节，并从隔离神经系统记录游泳足虚构的运动模式细胞外。
此外，我们还可以监视从树突细胞内记录的游泳足的神经元的活性。在这里，我们还简要介绍这些技术，并提供了一些例子。此外，游泳足神经元的形态，可以使用各种染色技术进行评估。在这里，我们提供的细胞内（通过离子电渗疗法）染料填充神经元和游泳足运动神经元的池的回填的例子。在我们的实验室我们使用这种制剂来研究微电路之间假想运动，感觉反馈对CNS的活性的效果，和协调的基本功能在细胞水平上。
Introduction
小龙虾的游泳足发球局中姿态控制功能，并有节奏地敲打当动物往前游，通风的洞穴或女性充气鸡蛋5，6，信号小龙虾， 螯leniusculus的游泳足，是成对出现的，从第二到第五腹段，用一肢上腹部7的每一侧。对中枢神经系统产生自身的节律马达图案驱动在完整的动物，以及在分离的神经索制备的游泳足运动。当没有感官反馈或降序输入本公司生产的节奏马达模式被称为假想运动1,2，在游泳足系统该电动机模式中不从在完整动物测得的游泳足的活性的任何参数不同。
每个游泳足的运动是通过将位于和限制为一个c-微电路驱动orresponding hemiganglion 1 - 3在每个微电路是有规律生成内核包括五个确定非扣球的interneurons。它们可以在功能特征为两种动力冲程抑制剂（IPS）或回击抑制剂（IRS）8。这些IPS和IRS的interneurons不是内生的振荡器，而他们的交流活动是由交互抑制9驱动。由于这些的interneurons直接抑制游泳足运动神经元，交替的PS-RS机芯生成10。运动然而，这不仅需要活动的产生，同时也协调不同的独立微电路。在游泳足系统，这种协调是通过协调微电路可确保四肢活跃在正确的时间建立。此微电路由三个识别神经元中的每个段11-15构建的。
该协议规定，日Ë首次一步一步夹层导向分离神经节（T4至A6， 图1）的链。我们展示了如何针隔离腹部神经索和desheathe每节。在这种孤立的神经系统的准备，负责游泳足的运动神经元是准备在电生理及形态学实验。此协议的第二部分展示了游泳足运动模式的主要特点。这包括了一步一步的指导，细胞外记录的游泳足的运动神经元的活动。 RS运动神经元的轴突通过神经N1的前支伸出，而PS的运动神经元的轴突通过同一神经的后支（ 图1）突出4。因此它们的活性可以从这些分支具有差分针电极进行记录。
图1：隔离从胸神经节4（T 4），以腹神经节6（A6）和它 T4 的示意图神经系统：胸神经节4; T5：胸神经节5; A1，A2 ...... A6腹神经节1，腹神经节2 ...腹神经节6; N1：神经N1; N2：神经N2; N3：神经N3; PS：电源冲程; RS：返回行程。定向缩写： A =前; P =后路。
这解剖程序和电技术展示是方便本科生和可能的生理补充学生实践课程。神经节的分离链已被用在大量的实验以研究神经系统的功能，协调性，或游泳足微电路6的调制以及在运动16,17适应性行为的神经元控制，小龙虾游泳足系统因此提供了一个巨大的量有趣的教学或T下雨，所有开始与小龙虾和假想马达图案的细胞外记录的腹神经索的解剖机会。
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Protocol
这解剖过程是按照22欧洲共同体理事会指令次 2010年9月（2010年/ 63 / EU）。
1.准备
- 小龙虾获得男女≥8厘米大小的， 螯leniusculus（德纳）。确保动物是至关重要的，腹部和四肢腹部都完好无损。
- 小心检查甲壳而这个角质层又粗又硬。前和postmolt动物具有柔软甲壳和不适合的实验，因为在蜕皮过程中的许多参数改变（ 例如，减少在运动活性）。
- 组装解剖过程中使用的所有工具和材料，钉扎和神经索的desheathing 图2中示出并在所提供的补充剂列出。
（1）大水桶装满冰块; （2）小龙虾盐水; （3）盐水分配器; （4）解剖显微镜; （5）夹层菜; （6）强大的剪刀; （7）镊子（8）弹簧剪刀; （9）培养皿内衬明确SYLGARD; （10）固定销; （11）冷灯源。 2.总解剖 3.精细解剖 4.管脚的神经索到培养皿 注：使用小针切不锈钢线材（见补充）引脚神经线。触摸只能用产钳结束神经，不SQUEEZe本连接词或神经节。 5. Desheathing神经节 6.外记录，从运动神经元
图2：
注：以下步骤（2.12-4.8）包含适用于右手实验者的方向指示。在下面的步骤（2.12-6.8）它用冷盐水代替小龙虾盐水在规则的间隔，每次20-30分钟，以保持对神经系统的健康是非常重要的。
注：胸神经节和相关的神经得到部分弥补了腿部肌肉和cephalothoracic燕。所述cephalothoracic腹板形成骨架分隔行走腿的侧向位于空腔彼此并从中间腔，其中腹神经索驻留。
注：神经线将在此过程中被损坏，以便避免拿起NERVË线多次。
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Representative Results
与从RS和PS，1神经节的运动神经元的同时外记录，这些运动神经元池的交替活性，可以监测（ 图18）中，表示假想运动图案。
图18：示意图1节和差分引脚电极的放置 RS运动神经元的细胞外记录（上部曲线）和PS运动神经元（下迹线）。
同侧PS 2〜PS 5运动神经元的胞 外PS活动突出了节间的协调，在游泳足系统（ 图19A），有趣的方面。
首先，活动总是与A5（ 图19A， 第 4 次的迹线）是PS脉冲串开始，并在前部方向上的激励波传播（<STRONG>图19A，绿线）。第二，在期间（也就是从一个脉冲串的开始测量到发病的下一个脉冲串的时间）在各段保持恒定（ 图19A，青色箭头）。这是真实的，只要从一个神经节到下一个信息流是完整的，并在实验条件不会改变。
在不同的制剂或不同的实验条件下的期间和脉冲串持续时间可以变化基本上：从0.25周期为1秒。为了不同制剂之间比较这些参数，它们需要被归一化并且绘制在相直方图（ 图19B）。这揭示了马达图案的第三有趣的方面：段之间的相位滞后，在段间延迟，保持不变和独立的节奏的频率。
来计算相位的直方图，以下的测量和计算是necessary：
首先，将参考曲线必须选择。通常我们使用最后神经节的聚苯乙烯微量（ 例如 ，PS 5）作为基准（即时间为0），用于在多个段（ 图19A）。然后记录在游泳足节奏，测量的周期的相位的直方图（以毫秒为）从一个PS 5突发（时间0开头的节奏， 图19A，橙色点线）到下一个的PS 5突发（ 图19A，青色箭头）.Within此周期的开始，测量延迟（以毫秒为）在PS 5突发（时间0）和起始（突发发作， 图19A和B，橙色箭头）和结束的开始之间（偏移图19A和B，紫罗兰箭头）的PS突发中的每个其他神经节。因此，为了计算相位发作和偏移对每个脉冲串的延时是由并行段划分。这些测量将导致数字V0和1之间alues 最后，在一个相位的直方图， 如图19B绘制这些值。
所得相位的直方图（ 图19B）包含有关对PS的脉冲串在每个段中的占空比信息。和0.25的〜相邻段之间的节间相位滞后是清晰可见。
图19：（A）电极放置和同侧的PS 5至所需的相位的直方图的PS 2（B）中的测量和计算的细胞外记录的示意图。从连续10脉冲串（N = 10）中计算出的相位的直方图显示了〜0.25的节间的相位延迟。
对于更高级的实验者，细胞内的录音与运动神经元的树突急剧微电极可以是有用的。该膜电位个别的细胞内记录的PS的运动神经元显示出同相振荡与外记录活动同一hemiganglion的所有的PS的运动神经元（ 图20中 ，灰色图）。可替换地，RS运动神经元或的interneurons可以在细胞内以相同的方式记录的（数据未示出）。
图20：电极位置的示意图的一个细胞内记录的PS运动神经元（上跟踪）的膜电位振荡阶段（灰色面板）与细胞外记录的PS活动（下迹线）。
对于识别细胞内记录的神经元（或的interneurons运动神经元）的，细胞可使用锋利的微电极和电离子透入（见讨论）染料填充。在图21中 ，2细胞内染料填充PS的运动神经元被示出。其腹胞体位于后方的神经N1的基极。初级神经突的项目前方（ 图21B-2）和分支横向神经纤维（ 图21A和B-3）之内;通过神经N1的后支到游泳足肌肉（ 图21B-4）中轴突的项目。
图21：腹部神经节（A）原理图（B）两种细胞内染色PS运动神经元。 （1）胞体; （2）初级突起; （3）树枝状分枝在横向神经毡; （4）轴突通过神经N1的后支的项目;栏= 100微米。
对于欠发达的实验者，或谁想要学习腹神经节的形态，从通过神经N1的PS和RS运动神经元池回填，是一个有趣的练习。在图2中2中，RS和1 hemiganglion PS的运动神经元染色用Co 2+（RS）和Ni 2+离子（PS），分别。胞体的PS的运动神经元位于后方的神经N1（ 图22-1）的基极。的RS的运动神经元的所有胞体均位于前向神经N1（ 图22-2）的基极。
图22：从回填前（橙色， 钴离子），后（蓝，镍离子 ）N1神经分支 （1）PS运动神经元胞体; （2）胞体RS运动神经元。栏= 100微米。
图3：去除所述爪（1）和腹足（2）。红线（1）和（2）表明削减头寸。棒= 5厘米。
图4：（A）的动物被钉扎腹侧和固定在尾节（B）中的小龙虾通过爪开口用冷盐水放血。棒= 5厘米。
图5：（A）斩首和（B）去除腿走路的。红色线条表示削减岗位。酒吧= 1厘米。
图6：（A，B，C和D）去除的前部和头胸部的横向部件。沿外侧腹部E.开幕。红线（1），（2），（4），（5）表示削减岗位。 （3）消化腺。红色箭头指向已经打开腹腔。酒吧= 1厘米。
图7：（A）将试样抓起在行走的腿（红色箭头）的开口（B）的背侧肌肉股线（1）的同时，检体被打开横切。白色箭头示出了在其中胸骨板被拉出的方向。腹腔（C）的概述与胸骨动脉（2）和神经索（3）。
图8：小龙虾腹部固定背肌肉股（1）横向视图和胸骨动脉（2）;红线（3）和（4）表示削减岗位。酒吧= 5毫米。
图9：背和腹部的腹侧部分彼此分离 （1）红色线表示切割的位置。胸骨板（2）与腹神经索;背腹部（3）的一部分。
图10：（A）中的镊子的位置以去除前cephalothoracic胸骨（B）的红色线（1）和（2）指示在何处切断剩余cephalothoracic胸骨之间的肌肉（C）的胸神经被横断处红色线（3），以隔离从周围组织的胸神经节。红线（4）表示T3和T4之间的切口。酒吧= 5毫米。
图11：（A和B）查看胸骨板在A2的。神经N1被从所述组织中分离出与沿后胸骨表皮内折（1）和前两者胸骨表皮infoldings（B 2）的切口（C）的高倍围绕A2中的区域，与分离的神经N1。（ D）隔离在对侧类似的削减神经N1的。红线（2）和（3）表示削减职位; （1）前，后胸骨表皮infoldings;酒吧= 5毫米。
图12：（A 和B）的A6从组织中分离和神经索可在A6的神经解除（℃）。 。（D）的分离的神经索转移到培养皿中衬有明确SYLGARD 和填充有生理盐水。红色线条表示削减岗位。酒吧= 5毫米。
图13：1节识别的神经索的背，腹侧（黑线） 的横向视图 。巴=5毫米
图14：神经N1是从后支栏=5毫米分离的前支 。
图15：方向为第一小切口的腹部神经节（A）通过连接词（红色箭头）的护套位置的desheathing，放在外侧和后侧的神经节。通过连通上述套管内的后续切割的标志是红线（1）（B）红色线（1）和（2）标记沿着神经节的横向边界的切割。护套可以事后从神经节拉动。酒吧总数= 1毫米。
图16：录音设置（一）概述（二）材料和所需的细胞外记录的工具。 C.设备所必需的电生理记录。 （1）冷灯源; （2）法拉第笼; （3）体视显微镜; （4）气表; （5）显微镜表; （6）镜; （7）差分引脚电极; （8）注射器填充有石油果冻; （9）橡皮泥; （10）镊子; （11）液体废物处理; （12）数字化; （13）外的放大器; （14）电脑，配备了录音软件和显示器。
图17：（A和B）记录（1），参考（2）脚电极的位置。 （C和D）的神经的后支N1为弯曲所述记录电极周围。记录电极E的底座（4）分离为具有凡士林。 F的完整记录电极分离为具有从浴溶液凡士林。 （3）注射器填充有凡士林。酒吧= 2毫米。
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Discussion
小龙虾的解剖和它们的腹神经节以前已经描述5，18，19，20和建议之前夹层熟悉它们，以避免的重要神经切割。
关键是要保持的制备在温度低于23℃，以防止分离的神经索的降解。这可以容易地通过更换浴液每20-30分钟用冷小龙虾盐水来实现。在这些情况下，可用于电生理实验长达12小时神经节的链。
有时候，游泳足运动神经元处于非活动状态，并显示没有自发的爆发活动。胆碱能激动剂卡巴用于诱导爆破活动在这些制剂中。溶于冷小龙虾盐水，1-3微米卡巴浴的应用是足够的，以激活游泳足节奏21。
ove_content“>假想运动，并记录在该系统中四肢特别的协调提供了很多关于节律活动和协调的细胞性质的信息。在这个系统中的神经元组件的局部微电路8-10被识别并且另外的协调的网络被称为蜂窝详细11,14,15。从与细胞外记录进行的实验得出的结果，已经让预测的数学模型和机器人专家。所有游泳足的神经元显示出横向神经纤维内树枝状分枝，并且可以从这些树突细胞内被记录下来。在图20中 ，示出了PS的运动神经元的细胞内记录。对于这种尖锐的微电极（见补充剂）填充用1M醋酸钾+ 0.1M的氯化钾（35之间电极电阻 - 45MΩ）置于上方侧向神经纤维。振动膜电位为W从PS和RS运动神经元的树突ELL尖峰可当电极插入神经N1的根部附近进行记录。
染色单个神经元（ 例如，运动神经元）在细胞内， 如图21所示 ，锋利微电极必须另外填充有荧光染料（ 例如，1％的葡聚糖德克萨斯红，见补充剂）溶解在1M醋酸钾+ 0.1M的氯化钾。到细胞内填充的运动神经元通过离子电渗，偏光1 nA的脉冲250毫秒2 Hz的持续时间被施加至少10分钟。对正电荷的染料使用去极化脉冲和用于带负电荷的染料使用超极化脉冲。再填充导致更强的标记神经元。对于可视化的神经线必须固定，脱水，并安装22。
一种方法进行染色的运动神经元的一个池是使用回填从神经N1（ 图22）4，23。放置在神经周围N1的后支凡士林的阱回填的PS的运动神经元的池。染色的RS电动机的池神经元以及被放置在神经N1的前支。在井的小龙虾盐水换成双蒸2 O.然后切这根神经井里，让它15分钟的DDH 2 O的在室温（RT）。或5％的NiCl 2 - -溶液（溶解在双蒸2 O）和关闭井凡士林此后，无论是用5％ 氯化钴取代DDH 2 O 的孔中。样品需要在4℃进行温育至少15小时。开的孔，去除染料并用盐水冲洗样品3次。沉淀出的Ni 2+或Co 2+离子与10滴Dithiooxamid在培养皿每10毫升小龙虾的盐水（溶解在100％EtOH中的饱和溶液），罩20分钟，在室温下。镍离子 -离子会沉淀蓝镍（SCH）和Co 2+
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Acknowledgments
我们感谢乔斯Burgert帮助有一些数字。我们感谢英戈SELBACH（和组“Edelkrebsprojekt北威州”），为他的努力提供实验室与实验动物。我们感谢安娜·C·施奈德校对书稿的第一个版本。这项研究是由埃米诺特DFG授予SM 206 / 3-1和科隆大学女教师启动资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel extracellular amplifier: MA 102 | Amplifier | Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany | |
| air-table | Technical Manufacturing Corporation (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA |
63-534 | |
| Axon Digidata 1440A | Digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA | DD1440A |
| big bucket | |||
| Clampex & Clampfit | pClamp 10, recording and analysis software | Molecular Devices Design, Union City, CA | pClamps 10 Standard |
| cold lamp source | with flexible light guide (fiber optic bundle) | Euromex microscopes holland, Arnhem, BD | LE.5211 & LE.5235 |
| computer and monitor | equipped with recording software | ||
| container and pipette for liquid waste | |||
| crayfish saline | contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. | ||
| dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) | fluorescent dye, lysine fixable | Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | D3328 |
| dissection dish | (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone | ||
| faraday cage | |||
| fixing pins | |||
| forceps (biology, Dumont #5) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11252-20 |
| forceps (biology, Dumont #55) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11255-20 |
| forceps (electronic, Dumont #5) | Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11251-20 |
| intracellular electrode | Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament | Sutter Instruments, Novato, CA | BF100-50-10 |
| Leica S8 Apo StereoZoom | Dissection Microscope Zoom 1x - 8x | Leica, Germany | 10446298 |
| microscope table | |||
| mirror | to illuminate preparation from below | ||
| modeling clay | |||
| Olympus SZ61 | Dissection Microscope Zoom 0.67x - 4.5x | Olympus, Germany | |
| petri dish | 94 x 16 mm; lined with clear silicone | Greiner bio-one, Germany | 633180 |
| ring scissors | ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 14054-13 |
| spring scissors or alternative: Vannas spring scissors | cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 15024-10 or 15000-08 |
| student Vannas spring scissors or alternative: Moria Spring Scissors | cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 91500-09 or 15396-00 |
| sylgard | 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon | Dow Corning, Midland, MI, USA | |
| syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip |
References
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