Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Den Swimmeret System af Crayfish: En praktisk vejledning til dissektion af Nerve Cord og Ekstracellulære optagelser af Motor Mønster

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52109
Automatic Translation
1, 1, 1
1Emmy Noether Group, Institute of Zoology, University of Cologne

Abstract

Her demonstrere vi dissektion af krebs abdominal nerve ledning. Fremstillingen omfatter de sidste to thorax ganglier (T4, T5) og kæden af ​​abdominal ganglier (A1 til A6). Denne kæde af ganglier omfatter den del af det centrale nervesystem (CNS), som driver en koordineret bevægelse af pleopods (swimmerets): Den swimmeret system. Det er kendt i over fem årtier, at hver swimmeret i krebs er drevet af sin egen uafhængige mønstergenererende kerne, der genererer rytmisk skiftende aktivitet 1-3. De motoriske neuroner innerverer muskulatur hver swimmeret omfatter to anatomisk og funktionelt adskilte populationer 4. Den ene er ansvarlig for tilbagetrækning (power slagtilfælde, PS) i swimmeret. Den anden driver forhaling (returslag, RS) i swimmeret. Motoriske neuroner i swimmeret systemet er i stand til at producere spontant en fiktiv motor mønster, som er identisk med mønsteret registreret in vivo 1.

Formålet med denne rapport er at indføre en interessant og praktisk modelsystem til undersøgelse rytme genererende netværk og koordinering af uafhængige mikrokredsløb for elevernes praktiske laboratoriekurser. Den angivne protokol indeholder trin-for-trin instruktioner til dissektion af krebs er abdominale nerve ledning, pinning af de isolerede kæde af ganglier, desheathing ganglier og registrering af swimmerets fiktive motor mønster ekstracellulært fra den isolerede nervesystem.

Derudover kan vi overvåge aktiviteten af ​​swimmeret neuroner optaget intracellulært fra dendritter. Her beskriver også kort disse teknikker og give nogle eksempler. Endvidere kan morfologi swimmeret neuroner vurderes ved hjælp af forskellige farvningsteknikker. Her giver vi eksempler på intracellulært (ved iontoforese) farvestof fyldt neuroner og backfills af puljer af swimmeret motoriske neuroner. I vores laboratoriumvi bruger dette præparat til at studere basisfunktioner fiktive bevægelse, virkningen af ​​sensorisk tilbagemelding på aktiviteten af ​​CNS, og koordineringen mellem mikrokredsløb på et cellulært niveau.

Introduction

De swimmerets af krebs tjener en funktion i kropsholdning kontrol og slog rytmisk når dyrene svømme fremad, ventilere deres huler eller hunner lufte deres æg 5, 6. De swimmerets af signalet krebs, Pacifastacus leniusculus, optræder parvis fra den anden til den femte abdominal segment, med et ben på hver side af underlivet 7. Det centrale nervesystem producerer sin egen den rytmiske motor trommen som driver swimmeret bevægelse i intakt dyr samt i den isolerede præparation nerve ledningen. Når der ikke er sensorisk feedback eller faldende input til stede den rytmiske motor mønster produceret kaldes fiktiv bevægelse 1, 2. I swimmeret systemet denne motor mønster adskiller sig ikke i nogen parameter fra aktiviteten af swimmerets målt i intakte dyr.

Bevægelsen af ​​hver swimmeret drives af et mikrokredsløb, der er placeret i og begrænset til én Corresponding hemiganglion 1 -. 3 I hvert mikrokredsløb der er et mønster generere kerne, der består af fem identificerede ikke spiking interneuroner. De kan funktionelt karakteriseres som værende enten hæmmer af Power Stroke (IPS) eller hæmmer af Return Stroke (IRS) 8. Disse IPS og IRS interneuroner er ikke endogene oscillatorer, snarere deres vekslende aktivitet er drevet af gensidig hæmning 9. Fordi disse interneuroner hæmme swimmeret motorneuroner direkte er alternerende PS-RS bevægelse genereret 10. Locomotion dog ikke blot nødvendigt at fremskaffe aktivitet, men også koordinering af de forskellige uafhængige mikrokredsløb. I swimmeret systemet sådan samordning er etableret ved den koordinerende mikrokredsløb, som sikrer, at lemmer er aktive på korrekte tidspunkter. Denne mikrokredsløb er bygget af tre identificerede neuroner i hvert segment 11-15.

Denne protokol vedrører the første gang en trin-for-trin dissektion guide at isolere kæden af ganglier (T4 til A6, figur 1). Vi viser, hvordan at pin det isolerede abdominal nerve ledning og desheathe hver ganglion. I denne isolerede præparation nervesystem, de neuroner, der er ansvarlige for swimmeret bevægelse er klar til brug i elektrofysiologiske og morfologiske eksperimenter. Den anden del af denne protokol viser hovedtrækkene i den swimmeret motor mønster. Dette omfatter en trin-for-trin guide til ekstracellulært rekord aktiviteten af ​​swimmeret motoriske neuroner. Axoner af RS motoriske neuroner projektet gennem den forreste gren af nerve N1, mens axoner af PS motoriske neuroner projektet gennem den bageste gren af den samme nerve (Figur 1) 4. Derfor deres aktivitet kan optages fra disse filialer med differentierede pin elektroder.

Figur 1
Figur 1: Isoleret nervesystem fra thorax ganglion 4 (T4) til abdominal ganglion 6 (A6) og et skematisk diagram af det T4:. Thorax ganglion 4; T5: thorax ganglion 5; A1, A2 ... A6 abdominal ganglion 1, abdominal ganglion 2 ... abdominal ganglion 6; N1: nerve N1; N2: nerve N2; N3: nerve N3; PS: power-takts; RS: return-slagtilfælde. Retningsbestemte forkortelser: A = anterior; P = posterior.

Denne dissektion procedure og elektrofysiologiske teknik demonstreret er bekvemt for studerende og eventuelt supplere de studerendes praktiske kurser i fysiologi. Det isolerede kæde af ganglier er blevet anvendt i en række forsøg for at studere nervesystems funktion, koordinering eller modulering af swimmeret mikrokredsløb 6 samt neuronal kontrol af adaptive adfærd i bevægelse 16, 17. Krebsehaler swimmeret system giver således en enorm mængde interessante undervisning eller tregner muligheder, som alle begynder med dissektion af den ventrale nerve ledning af krebs og ekstracellulær registrering af fiktive motor mønster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne dissektion procedure er i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers direktiv af 22. September 2010 (2010/63 / EU).

1. Forberedelse

  1. Opnå krebs, Pacifastacus leniusculus (Dana), af begge køn ≥8 cm i størrelse. Sørg for, at dyrene er af afgørende betydning, og maven og abdominale lemmer er intakte.
  2. Vær omhyggelig med at inspicere rygskjoldet og at denne neglebånd er hård og stiv. Præ- og postmolt dyr har en blød skjoldet og er ikke egnet til forsøg, fordi der under molting processen mange parametre ændres (fx fald i lokomotorisk aktivitet).
  3. Saml alle redskaber og materialer, der anvendes i løbet af dissektion, pinning og desheathing af nerve ledning vist i figur 2 og opført i tillæggene forudsat.

Figur 2
Figur 2:

(1) stor spand fyldt med is; (2) krebs saltvand; (3) saltvand dispenser; (4) dissektion mikroskop; (5) dissektion skål; (6) stærke saks; (7) tang (8) foråret saks; (9) petriskål foret med klar Sylgard; (10) fastsættelse stifter; (11) kold lampe kilde.

2. Gross Dissektion

  1. Bedøver dyr på is i 15-20 min. Udfør den første del af brutto dissektion på en lab bænk nær vasken, da det indeholder en afblødning skridt og prøven skal regelmæssigt skylles med krebs saltvand under proceduren.
  2. Hold dyr ventrale side op og bruge stærke saks til at klippe begge kløer på deres baser nær thorax (Figur 3-1). Fjern venstre og højre uropod (Figur 3-2).
  3. Placer dyret ventrale side op i dissektion fad foret med sort Sylgard. Elevate cephalothorax ved at indsætte is nedenunder og pin maven på svømmeviftens midterstykke (figur 4A).
  4. Fyld saltvand dispenser med ~ 60 ml kølet krebs saltvand. Perfundere krebs med koldt saltvand gennem klo åbning (figur 4B). Overskydende saltvand vil dræne ud gennem nedskæringer på de uropods. Dæk krebs med is under afblødning
  5. Halshugge dyret med en enkelt tværgående skåret lige posteriort for dyrets øjne ved hjælp af stærke saks (figur 5A). Fjern alle walking ben nær bunden leddene som vist i figur 5B.
  6. Isoler maven med de sidste thorax segmenter fra resten af ​​cephalothorax. Foretag en første snit på niveau med den anden walking ben (thorax segment 3) ved indsættelse af spidsen af ​​saksen i åbningen af ​​den anden walking ben og skæring til den modsatte side. (Figur 6A-1).
  7. Udvide denne første snit på begge sider gennem than cephalothorax (figur 6A-2).
  8. Flip dyret åben for at gøre nogle af de indre organer synlige. Skub fremtrædende fordøjelsessystemet kirtel (figur 6B-3) til forreste del af prøven og bruge pincet til at fjerne de reproduktive organer fra bughulen.
  9. Fjern den forreste del af cephalothorax (figur 6C). Brug laterale snit til at fjerne de laterale dele af skjoldet, som dækker gællerne, på begge sider af den resterende thorax (Figur 6D-4). Fjern gællerne og skyl prøven med koldt saltvand.
  10. Fortsæt dissektion med et snit gennem hele længden af brystbenet plade som vist i figur 6E-5. Gør denne nedskæring på maksimal laterale positioner mellem pleuron og swimmerets (figur 6E røde markeringer). Fortsæt på den anden side med et samme snit. Skyl prøven med koldt saltvand.
  11. Udfør de resterende dissektion under en dissection mikroskop. Placer krebs underliv ventrale side op i dissektion fad foret med sort Sylgard og fyldt med krebs saltvand så det dækker prøven.
    BEMÆRK: Følgende trin (2,12-4,8) indeholder retningsbestemte instruktioner, der gælder for højrehåndede eksperimentatorer. I de følgende trin (2,12-6,8) er det vigtigt at erstatte krebs saltvand i regelmæssige intervaller, hver 20-30 min med koldt saltvand, for at holde nervesystemet sundt.
  12. Fastgør prøven med insekt ben posteriort på svømmeviftens midterstykke og fortil på resterne af rygskjoldet. Placer prøven så svømmeviftens midterstykke punkter til venstre og er parallel med bordets kant.
  13. Brug grove pincet i venstre hånd til at få fat i gennem en walking ben åbning (figur 7A) og træk den model åbne (Figur 7B hvid pil). Identificere de store to dorsale flexor muskel strenge (figur 7B-1 og C-1) og skære deres ventralebasis som vist i figur 7B.
  14. Identificer brystbenet arterie (Figur 7C-2), som nedstammer fra dorsale (hjertet) til ventrale, på det 4 th thorax segment. Denne arterie ligger lige over nerve ledning (Figur 7C-3), før den projekter under nerve ledning, der danner den ventrale arterie.
  15. Transekt den sternal arterie. Som demonstreret i figur 7C, løft arterien først, ved hjælp af en klinge af saksen, og kun skære når ventralt beliggende nerve ledning er synlig.
  16. Fastgør dorsale flexor muskler fortil (til højre). Dette bør ske i maksimal strakt position med ben, så de ikke vil blokere vision og prøven forbliver strakt. Når rygmuskel strenge er fastgjort (figur 8-1), den første abdominale ganglier, A1 og A2, med tilhørende nerver N1, N2 og N3 er synlige (figur 8).
  17. Brug pincet i venstre hånd til at få fat i specImen ved en åbning af de walking ben. I den følgende dissektion skridt træk forsigtigt at holde prøven åbne.
  18. Transekt nerverne N3 ved den fjerneste position fra nerve ledningen. (Figur 8-3).
  19. Skær bøjemuskler tæt på ventrale apodeme som vist i figur 8-4. Pas på ikke at beskadige nerven ledningen eller nerverne N2.
  20. Gentag trin 2.18 og 2.19 for nerver N3 og flexor muskler i den resterende abdominal ganglier A2 til A5.
  21. På det sidste abdominal ganglion, A6, skære dorsale flexor muskler fra den ventrale apodeme og prøven skal se ud som vist i figur 9.
  22. Skær brystbenet plade posterior til nerverne af A6 (Figur 9-1) og holde den ventrale del (Figur 9-2). Kassér den dorsale del med flexor muskler (Figur 9-3). Fastgør brystbenet plade fortil med stifter gennem åbningerne i de walking ben,og bagtil til A6.

3. Fin Dissektion

  1. Placer prøven under mikroskop med den forreste del ledes væk og den bageste del mod tabellerne 'kant.
  2. Brug pincet som vist i figur 10A til at fjerne de mest forreste dele af cephalothoracic sterna.
    BEMÆRK: thorax ganglier og tilhørende nerver er delvist dækket af benet muskulatur og cephalothoracic Sterna. Den cephalothoracic sterna danner et skelet, der adskiller de sideværts placeret hulrum walking benene fra hinanden og fra den mediale hulrum, hvori den ventrale nerve ledningen er placeret.
  3. Skær musklerne mellem de tilbageværende exoskeletal strukturer som angivet i figur 10B -1 og B2. Brug pincet til at gribe og løfte den forreste ende af den ventrale nerve ledning (figur 10C).
    BEMÆRK: nerve ledning bliver beskadiget i processen, så undgå at løfte Nerve ledningen flere gange.
  4. Skær thorax nerver sideværts, mens du løfter nerven ledningen (figur 10C-3). Hold disse nerver på passende længde til pinning. Fjern presset del af kæden af ganglier, som blev samlet op med en pincet, ved at skære væk alle væv anterior til T4 (figur 10C-4).
  5. Prøven anbringes med den forreste del til venstre og fokusere på A1. Skær nerver N1 og N2 i A1 på en passende længde (max. 1 cm) for pinning dem ud.
  6. Fokus på A2 og identificere de nerver N1, N2 og N3 af dette segment (figur 11). Nerverne N1 for abdominal ganglier A2-A5 opholde mellem to sternale kutikulære infoldings i hvert segment (figur 11A-1) og er omfattet af muskulaturen. Lav et snit langs den bageste brystbenet kutikulære infolding. Start ved den laterale rand af maven og fortsætte mod midterlinjen som vist i figur 11A.
  7. Hvis målet N1 stadig coverød med væv som vist i figur 11B (rød pil), på tværs musklen bundt, men denne gang anterior både sternale kutikulære infoldings og nerve N1 (Figur 11B-2).
  8. Skær nerve N1 distalt som muligt (figur 11C-3). Nerve N1 er fuldt synlige og den forreste og bageste gren kan identificeres (figur 11C).
  9. Fortsæt til den kontralaterale nerve N1 og først skære musklerne langs den bageste brystbenet kutikulære infolding, startende medialt, nær ganglion (Figur 11D). Hvis nerve stadig er dækket af væv på tværs musklen bundt, men denne gang anterior både sternale kutikulære infoldings og nerve N1, svarende til fig 11B-2. Skær nerve N1 så distalt som muligt.
  10. Skær nerver N2 denne ganglion til en passende længde (ca.. 0,5 cm) for pinning.
  11. Gentag trin 3,7-3,11 for nerverne i A3-A5.
  12. Skær NERves af ganglion A6 distalt som muligt (figur 12A). Brug pincet til at få fat i flere nerver af A6 til at løfte denne ganglion og begynde at isolere kæden af ​​ganglier fra brystbenet plade.
  13. Mens løfte nerve ledningen, trække det forsigtigt i den forreste retning som vist i figur 12B (hvid pil). Da de enkelte ganglier løftes, fjerne den ventrale arterie, der kan fastgøres til den ventrale side af nerve ledningen (figur 12C). Fortsæt denne (blidt) Pull-cut sekvens indtil nerve ledningen er helt isoleret.
  14. Overfør isoleret kæde af ganglier til en petriskål foret med klar Sylgard og fyldt med Krebs saltvand (figur 12D).

4. Fastgørelse Nerve ledningen i petriskålen

BEMÆRK: Brug små ben skåret af tråd af rustfrit stål (se tillæg) til ben nerve ledningen. Tryk kun nerven slutter med pincet og ikke squeezè connectives eller ganglier.

  1. Pin kæden af ​​ganglier i en lige linje, mens anvendelse blid stræk.
  2. Arranger nerve ledning i petriskålen med den dorsale side opad (figur 13, sort linje). Den ventrale side af ganglier kan identificeres ved sin konveksitet; den dorsale side er flad. Pin de thorax nerver til siderne. Fortsæt med nerver af A6, strække nerve ledningen langs sin længdeakse.
  3. Stiften ud nerverne af A1 i en 90 ° vinkel i forhold til nerve ledningen.
  4. Fortsæt til A2 og pin nerver N2 i en vinkel på 35-45 ° i forhold til nerve ledningen (figur 1A).
  5. Adskil nerverne N1 i deres forreste og bageste grene inden pinning som demonstreret i figur 14. Brug to par fine tænger til at samle op med et par pincet forreste og den anden den bageste gren af nerve N1. Pas at vælge kun de mest distale endes af nerve filialer. Nu trække dem forsigtigt fra hinanden.
  6. Pin forreste gren af nerve N1 i en 90 ° vinkel i forhold til nerve ledningen (figur 1A). Pin den bageste gren af ​​nerve N1 mellem forreste N1 gren og nerven N2.
  7. Gentag trin 4,4-4,6 for nerverne af ganglier A3-A5. Mens fiksere nerve ledningen stræk det i længderetningen, samt tværgående retninger.

5. Desheathing ganglier

  1. Placer præparatet på en sådan måde, at forsøgslederen hænder er altid hviler på et stabilt fly for at undgå rystelser. For at desheath ganglier belyse nerve ledningen nedefra.
  2. Fokus på enhver abdominal ganglion A1 til A5. Brug fine foråret saks til at gøre en lille lateral snit gennem ganglion kappe, posteriort for ganglion og mellem nerverne N2 og N3 (figur 15A rød pil).
  3. Løft ganglion kappe ved hjælp af meget fIne pincet og skæres tværs over kappen over connectives, som angivet i figur 15A-1. Pas på ikke at klemme eller skære nerven ledningen med saksen.
  4. Stadig holde og løfte ganglion kappe med pincet fortsat skære det langs de laterale grænser ganglion (Figur 15B-2 og -3). Fjern hylsteret. Alternativt pin det til begge sider af connectives på en sådan måde, at det er fast, men nerven ledningen ikke klemmes.
  5. Gentag trin 5,2-5,4 for alle abdominal ganglier A1 til A5.
  6. Desheathe brysthulen ganglier og ganglion A6 på en lignende måde. For at desheathe A6 starte anterior til ganglion og fortsætte i posterior retning. Pin ganglion kappe af A6 til den bageste ende af kæden af ​​ganglier.

6. Ekstracellulær Optagelser fra motorneuroner

  1. Saml alle redskaber og materialer, der anvendes til ekstracellulære optagelser vist in Figur 16B og opført i kosttilskud. En oversigt over opsætningen optagelsen er vist i figur 16A. Start alt elektronisk udstyr, der anvendes i dette forsøg (figur 16C), så forstærkerne kan varme op i mindst 30 minutter før optagelsen. Tænd for computeren, og start optagelse software.
  2. Placer kæde af ganglier på mikroskopet bordet og belyse nedefra. Sæt optagelsen elektroden i Sylgard tæt på målet nerve og referenceelektrode ved en position i nærheden, men lateral til ganglier (figur 17A og B). Bøj target nerve omkring elektrode (figur 17C).
  3. Stræk nerve lidt, for at sikre kontakt mellem elektroden og nerve og pin det til siden (F igur 17D). Fastgør elektrode kabler til mikroskopet tabel ved hjælp af modellervoks, så de bliver i den ønskede position.
  4. Brug ensprøjte fyldt med vaseline og en 20 gauge nål (med afrundet spids) (figur 17E-3) at isolere target nerve fra badopløsningen. Først ising nogle vaseline på Sylgard omkring optagelsen elektrode. Resultatet er et lag af vaseline dækker Sylgard i nærheden af optagelsen elektrode (figur 17E-4). Pas på ikke at direkte ising på nerve og undgå luftbobler i dette lag.
  5. Forsegl elektrode med vaseline fra alle sider op til overfladen af saltvand (figur 17F).
  6. Gentag denne procedure for alle mål-nerver, hvis aktivitet skal overvåges.
  7. Start optagelse. Brug en kontinuerlig eller mellemrum fri erhvervelse mode og en samplingfrekvens på 5 kHz. Indstil ekstracellulære forstærker til følgende parametre; vinde til 1000 (forstærker signalet 1.000 gange, sørge for at medtage denne forstærkning parameter i købet softwareindstillinger) enda båndpasfilter fra 300 Hz (lav cut) til 2.000 Hz (høj cut).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med de samtidige ekstracellulære optagelser fra RS og PS, motoriske neuroner i et ganglion, vekslende aktivitet af disse motor neuron puljer, kan overvåges (figur 18), der repræsenterer den fiktive bevægelse mønster.

Figur 18
Figur 18: Skematisk af en ganglion og placering af differentieret pin elektrode Ekstracellulær registrering af RS motoriske neuroner (øverste spor) og PS motoriske neuroner (lavere spor)..

Den ekstracellulære PS aktivitet ipsilateral PS 2 til PS 5 motoriske neuroner fremhæver interessante aspekter af intersegmental koordination i swimmeret (figur 19A).

Først aktiviteten altid starter med en PS burst i A5 (figur 19A, 4 th spor) og excitation bølge udbreder i den forreste retning (<strong> Figur 19A, grøn linje). Det andet tidsrum (som er tiden målt fra starten af en burst til begyndelsen af den næste burst) i hvert segment forbliver konstant (figur 19A, cyan pil). Dette er sandt, så længe informationsstrømmen fra en ganglion til den næste er intakt, og de eksperimentelle betingelser ændres ikke.

I forskellige præparater eller under forskellige eksperimentelle betingelser de perioder og brast varighed kan variere betydeligt: ​​fra perioder på 0,25 til 1 sek. For at kunne sammenligne disse parametre mellem forskellige præparater, de har brug for at blive normaliseret og tegnes i en fase histogram (figur 19B). Dette afslører den tredje interessant aspekt af motoren mønster: fase forskydning mellem segmenter intersegmental forsinkelse forbliver konstant og uafhængig af frekvensen af ​​rytmen.

For at beregne en fase histogram, følgende målinger og beregninger er necessary:

Først en reference spor skal vælges. Normalt bruger vi PS spor af de bageste ganglion (f.eks PS 5) som reference (bliver tid 0) for en fase histogram af swimmeret rytme indspillet over flere segmenter (figur 19A) .Derefter, måle periode (i ms ) af rytmen fra begyndelsen af et PS 5 burst (tid 0, figur 19A, orange stiplet linje) til begyndelsen af den næste PS 5 burst (figur 19A, cyan pil) .Within denne cyklus måler latenstider (i ms ) mellem starten af PS 5 burst (tid 0) og start (burst indtræden, figur 19A og B, appelsin pile) og slutningen (offset Figur 19A og B, violet pile) af PS briste i hver af de andre ganglier . Derfor at beregne fase indtræden og offset for hver sprænge latenstider divideres med den samtidige periode. Disse målinger vil resultere i numerisk values ​​mellem 0 og 1. Endelig plotte disse værdier i en fase histogram som vist i figur 19B.

Den resulterende fase histogram (figur 19B) indeholder oplysninger om arbejdscyklus af PS brast i hvert segment. Og intersegmental fase-lag på ~ 0,25 mellem nabosegmenter er klart synlig.

Figur 19
Figur 19: (A) Skematisk af elektrodeplacering og ekstracellulær registrering af ipsilaterale PS 5 til PS 2. (B) Målinger og beregninger, der er nødvendige for fase histogram. Fasen histogram beregnet ud fra ti på hinanden følgende stød (n = 10) viser intersegmental fase forsinkelse ~ 0,25.

For mere avancerede eksperimentatorer kan intracellulære optagelser med skarpe mikroelektroder fra dendritter af motoriske neuroner være nyttige. Potentialer Membranprøverneindividuelle intracellulært indspillede PS motoriske neuroner viser i fase svingninger med ekstracellulært registreret aktivitet af alle PS motoriske neuroner i samme hemiganglion (Figur 20, grå paneler). Alternativt kan optages RS motorneuroner eller interneuroner intracellulært på samme måde (data ikke vist).

Figur 20
Figur 20:. Skematisk af elektrodeplacering membranpotentiale en intracellulært registreret PS motor neuron (øverste spor) svinger i fase (grå paneler) med ekstracellulært registreret PS aktivitet (lavere spor).

Til identifikation af intracellulært optaget neuroner (interneuroner eller motoriske neuroner) kan celler farvestof fyldt ved hjælp af skarpe mikroelektroder og iontoforese (se diskussion). I figur 21 er der vist to intracellulært farvestof fyldt PS motoriske neuroner. Deres ventral Somataer placeret posteriort for bunden af ​​nerve N1. De primære neurit projekter fortil (Figur 21B-2) og filialer inden for Lateral neuropil (figur 21A og B-3); Axon projekter gennem den bageste gren af nerve N1 til swimmeret muskulatur (Figur 21B-4).

Figur 21
Figur 21: (A) Skematisk af en abdominal ganglion (B) To intracellulært farvede PS motoriske neuroner.. (1) Somata; (2) primære neuritter; (3) dendritisk forgrening i den laterale neuropil; (4) axoner projektet gennem den bageste gren af ​​nerve N1; Bar = 100 um.

For mindre avancerede eksperimentatorer, eller dem, der ønsker at studere morfologi af den abdominale ganglion, backfills fra PS og RS motor neuron puljer via nerve N1, er en interessant øvelse. I figur 22, RS og PS motoriske neuroner i en hemiganglion blev farvet med Co 2+ (RS) og Ni2 + -ioner (PS), hhv. Somata af PS motoriske neuroner er placeret posteriort for bunden af nerve N1 (figur 22-1). Alle somata RS motoriske neuroner er placeret anterior til bunden af nerven N1 (figur 22-2).

Figur 22
Figur 22: Backfills fra den forreste (orange, Co 2+) og posterior (blå, Ni 2+) gren af nerve N1 (1) Somata PS-motoriske neuroner;. (2) somata RS motoriske neuroner. Bar = 100 um.

Figur 3
Figur 3: Fjernelse kløerne (1) og uropods (2). Røde linjer (1) og (2) angiver positioner af nedskæringer. Bar = 5 cm.


Figur 4:. (A) Dyret fastgjort ventrale side op og fastsat til svømmeviftens midterstykke (B) Den krebs er afblødt gennem klo åbning med koldt saltvand. Barer = 5 cm.

Figur 5
Figur 5: (A) halshugning og (B) fjernelse af walking ben. Røde linjer angiver positioner af udskæringer. Barer = 1 cm.

Figur 6
Figur 6: (A, B, C og D) fjernelse af den forreste og laterale dele af cephalothorax. E. Åbning af maven langs den laterale side.Røde linier (1), (2), (4) og (5) angiver positionerne af udskæringer. (3) Digestive kirtel. Røde pile peger på allerede åbnet bughulen. Barer = 1 cm.

Figur 7
Figur 7: (A) Prøven greb ved en åbning af de walking ben (røde pile) (B) Den rygmuskel tråde (1) er gennemskæres mens prøven åbnes.. Hvid pil viser retningen, i hvilken sternal plade trækkes. (C) Oversigt over bughulen med brystbenet arterie (2) og nerve ledning (3).

Figur 8
Figur 8: tværsnitsbillede af krebs maven med fast rygmuskel tråde (1) og sternal arterie (2); Røde linjer (3) og (4) angiver positioner af nedskæringer. Barer= 5 mm.

Figur 9
Figur 9: Dorsal og ventrale dele af maven er adskilt fra hinanden (1) Red linje angiver placeringen af snit.. Sternal plade (2) med ventral nerve ledning; dorsal del af abdomen (3).

Figur 10
Figur 10:.. (A) positioner af pincet til at fjerne den forreste cephalothoracic sterna (B) røde linjer (1) og (2) angiver, hvor at skære musklerne mellem de resterende cephalothoracic sterna (C) thorax nerver er gennemskæres på De røde linjer (3) at isolere den thorakale ganglier fra det omgivende væv. Rød linie (4) angiver snittet mellem T3 og T4. Barer = 5 mm.


Figur 11: (A og B) Visning af brystbenet plade ved A2. Nerven N1 isoleres fra vævet med et snit langs den bageste sternal kutikulære infolding (1) og forreste både sternale kutikulære infoldings (B 2). (C) Højere forstørrelse af regionen omkring A2, med det isolerede nerve N1. ( D) Isolation af nerve N1 på den kontralaterale side med lignende stykker. Røde linjer (2) og (3) angiver positioner af nedskæringer; (1) forreste og bageste sternale kutikulære infoldings; Barer = 5 mm.

Figur 12
Figur 12: (A og B) A6 isoleres fra væv og nerve ledningen kan løftes på nerverne af A6 (C). (D) Isoleret nerve ledning overføres til en petriskål foret med klar Sylgard og fyldt med saltvand. Røde linjer angiver positioner af udskæringer. Barer = 5 mm.

Figur 13
Figur 13: sidebillede af en ganglion Identifikation af den dorsale og ventrale side (sort linie) af nerven ledningen.. Bar = 5 mm

Figur 14
Figur 14: Den forreste gren af nerve N1 er adskilt fra den bageste gren Bar = 5 mm..

Figur 15
Figur 15: Vejledning til desheathing af en abdominal ganglion (A) Placering af den første lille snit gennem kappen af connectives (rød pil), som er tilføjet laterale og posteriore til ganglion. Den efterfølgende snit gennem kappen over bindevæv er markeret med den røde linje (1). (B) Røde linier (1) og (2) at mærke nedskæringerne langs sidelinjen grænser ganglion. Kappen kan efterfølgende blive trukket fra ganglion. Barer = 1 mm.

Figur 16
Figur 16:. (A) Oversigt over opsætningen optagelse (B) Materialer og værktøjer, der ekstracellulære optagelser. C. Udstyr nødvendige for elektrofysiologiske optagelse. (1) kold lampe kilde; (2) Faradays bur; (3) stereomikroskop; (4) air-bord; (5) mikroskop bordet; (6) spejlet; (7) forskellen pin elektroder; (8) sprøjte fyldt med oliegelé; (9) modellervoks; (10) pincet; (11) bortskaffelse flydende affald; (12) digitizer; (13) ekstracellulære forstærker; (14) computer, der er udstyret med optagelse software og skærm.

Figur 17
Figur 17: (A og B) Position af optagelse (1) og reference (2) PIN-elektrode. (C og D) Den bageste gren af nerven N1 er bøje omkring optagelsen elektroden. E. bunden (4) af optagelsen elektrode er isoleret med vaseline. F. Den fuldstændige optagelse elektrode er isoleret med vaseline fra badopløsningen. (3) sprøjte fyldt med vaseline. Barer = 2 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anatomi krebs og deres abdominal ganglier er blevet beskrevet tidligere 5, 18, ​​19, 20, og det anbefales at blive fortrolig med dem før dissektion for at undgå skæring vigtige nerver.

Det er afgørende at holde præparatet ved temperaturer under 23 ° C for at forhindre nedbrydning af det isolerede nerve ledningen. Dette kan opnås nemt ved erstatning af badopløsningen hver 20-30 min med koldt krebs saltvand. Under disse omstændigheder kan bruges kæden af ​​ganglier for elektrofysiologiske forsøg i op til 12 timer.

Sommetider swimmeret motoriske neuroner er inaktive og viser ingen spontan sprængning aktivitet. Den cholinerge agonist carbachol anvendes til at inducere sprængning aktivitet i disse præparater. Opløses i koldt krebs saltvand, bad anvendelser af 1-3 uM carbachol er tilstrækkelige til at aktivere swimmeret rytme 21.

ove_content "> Den fiktive bevægelse og især koordineringen af lemmerne er optaget i dette system giver en masse information om de cellulære egenskaber rytmisk aktivitet og koordinering. I dette system de neuronale komponenter 8-10 af de lokale mikrokredsløb identificeres og derudover koordinerende netværk er kendt i cellulær detalje 11,14,15. Resultaterne er draget på forsøg udført med ekstracellulære optagelser, tillade allerede forudsigelser for matematiske modeller og for robotforskerne.

Alle swimmeret neuroner viser dendritiske forgrening i Lateral neuropil og kan intracellulært optaget fra disse dendritter. I figur 20 er en intracellulær optagelse af en PS motor neuron vist. Til dette en skarp mikroelektrode (se tillæg) fyldt med 1 M KAc + 0,1 M KCI (modstand elektrode mellem 35-45 MOhm) er placeret over Lateral neuropil. Den oscillerende membranpotentialer som Well pigge fra dendritter PS RS motorneuroner kan registreres, når elektroden er indsat nær bunden af ​​nerve N1.

At farve enkelte neuroner (f.eks motoriske neuroner) intracellulært som vist i figur 21, skal den skarpe mikroelektrode blive yderligere fyldt med fluorescerende farvestof (fx 1% dextran Texas Red, se tillæg) opløst i 1 M KAc + 0,1 M KCI. For at fylde motorneuroner intracellulært ved iontoforese, polariserende pulser af 1 nA med en varighed på 250 ms ved 2 Hz anvendes i mindst 10 min. For positivt ladede farvestoffer bruger depolariserende impulser og negativt ladede farvestoffer bruger hyperpolarisering impulser. Længere fylder resulterer i en stærkere mærket neuron. For visualisering nerven ledningen skal fastsættes, dehydrerede, og monteret 22.

En metode til at plette en pulje af motorneuroner er at bruge backfills fra nerve N1 (figur 22) 4, 23. Placer en brønd af vaseline omkring den bageste gren af ​​nerve N1 at efterfylde puljen af ​​PS motoriske neuroner. Til farvning puljen af ​​RS motorneuroner en brønd er placeret på den forreste gren af ​​nerve N1. Den krebs saltvand i brønden erstattes med Hedeselskabet 2 O. Derefter skæres denne nerve inde i godt og lad det stå 15 minutter i Hedeselskabet 2 O ved stuetemperatur (RT). Derefter erstatte Hedeselskabet 2 O i brøndene med enten 5% CoCI2 - eller 5% NiCl2 - opløsning (opløst i Hedeselskabet 2 O) og tætte brønde med vaseline. Prøven skal inkuberes i mindst 15 timer ved 4 ° C. Åbn brøndene fjerne farvestoffet og skyl prøven 3 gange med saltvand. Udfælde Ni 2+ eller Co2 + -ioner med 10 dråber Dithiooxamid (mættet opløsning opløst i 100% EtOH) for hver 10 ml krebs saltvand i Petri-skålen under hætten i 20 minutter ved stuetemperatur. Ni 2+ - ioner vil udfældes til blå Ni (SCH) og Co2 +

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Jos Burgert for at hjælpe med nogle af tallene. Vi er taknemmelige for Ingo Selbach (og gruppen "Edelkrebsprojekt NRW") for hans bestræbelser på at levere laboratoriet med forsøgsdyr. Vi takker Anna C. Schneider for korrekturlæsning første versioner af manuskriptet. Denne forskning blev støttet af en Emmy Noether DFG tilskud SM 206 / 3-1 og en start tilskud på universitetet i Köln for kvindelig fakultet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-channel extracellular amplifier: MA 102  Amplifier Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany
air-table Technical Manufacturing Corporation
(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA		 63-534
Axon Digidata 1440A Digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA DD1440A
big bucket 
Clampex & Clampfit pClamp 10, recording and analysis software Molecular Devices Design, Union City, CA pClamps 10 Standard
cold lamp source with flexible light guide (fiber optic bundle)  Euromex microscopes holland, Arnhem, BD LE.5211 & LE.5235
computer and monitor equipped with recording software
container and pipette for liquid waste 
crayfish saline  contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. 
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) fluorescent dye, lysine fixable Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany D3328
dissection dish  (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone
faraday cage
fixing pins
forceps (biology, Dumont #5) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11252-20
forceps (biology, Dumont #55) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11255-20
forceps (electronic, Dumont #5) Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11251-20
intracellular electrode Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament Sutter Instruments, Novato, CA BF100-50-10
Leica S8 Apo StereoZoom Dissection Microscope                       Zoom 1x - 8x Leica, Germany 10446298
microscope table
mirror to illuminate preparation from below
modeling clay
Olympus SZ61 Dissection Microscope                       Zoom 0.67x - 4.5x Olympus, Germany
petri dish  94 x 16 mm; lined with clear silicone Greiner bio-one, Germany 633180
ring scissors ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm Fine Science Tools (FST), Germany 14054-13
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm Fine Science Tools (FST), Germany 15024-10 or          15000-08
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm Fine Science Tools (FST), Germany 91500-09 or           15396-00
sylgard 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
  2. Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).
  3. Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
  4. Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
  5. Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
  6. Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
  7. Huxley, T. H. The crayfish: An introduction to the study of zoology. , MIT Press. Cambridge, MA. (1980).
  8. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
  9. Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
  10. Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
  11. Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
  12. Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
  13. Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
  14. Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
  15. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
  16. Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
  17. Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
  18. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
  19. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
  20. Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
  21. Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
  22. Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts - Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
  23. Altman, J. S., Tyrer, N. M. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. Strausfeld, N. J., Miller, T. A. , Springer. New York, NY. 373-402 (1980).

Tags

Neurobiologisk krebsdyr dissektion ekstracellulær optagelse fiktiv bevægelse motoriske neuroner bevægelse
Den Swimmeret System af Crayfish: En praktisk vejledning til dissektion af Nerve Cord og Ekstracellulære optagelser af Motor Mønster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seichter, H. A., Blumenthal, F.,… More

Seichter, H. A., Blumenthal, F., Smarandache-Wellmann, C. R. The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern. J. Vis. Exp. (93), e52109, doi:10.3791/52109 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter