Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

De Swimmeret Systeem van rivierkreeftjes: Een praktische gids voor de dissectie van de Nerve Koord en extracellulaire Opnamen van de Motor van het Patroon

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52109
Automatic Translation
1, 1, 1
1Emmy Noether Group, Institute of Zoology, University of Cologne

Abstract

Hier laten we zien de ontleding van de rivierkreeft buik zenuwkoord. Het preparaat de laatste twee thoracale ganglia (T4, T5) en de keten van abdominale ganglia (A1 tot A6). Deze keten ganglia omvat het deel van het centrale zenuwstelsel (CZS) dat gecoördineerde voortbeweging van de pleopods (swimmerets) aandrijft: het swimmeret systeem. Het staat bekend om meer dan vijf decennia dat in rivierkreeft elke swimmeret wordt aangedreven door zijn eigen onafhankelijke patroon genereren kernel die ritmische afwisselende activiteit 1-3 genereert. De motorische neuronen innerveren de spieren van elk swimmeret bestaan ​​uit twee anatomisch en functioneel verschillende bevolkingsgroepen 4. Men is verantwoordelijk voor het terugtrekken (arbeidsslag, PS) van de swimmeret. De andere drijft de protractie (terugslag, RS) van de swimmeret. Motorneuronen van het swimmeret systeem kunnen spontaan een fictief motor patroon, dat identiek is aan het patroon gevonden in vivo 1.

Het doel van dit rapport is om een ​​interessante en handige model systeem in te voeren voor het bestuderen van ritme genereren netwerken en coördinatie van onafhankelijke microschakelingen praktische practica studenten '. Het protocol voorwaarde bevat stap-voor-stap instructies voor de dissectie van abdominale zenuwkoord de rivierkreeft's, pinning van de geïsoleerde keten van ganglia, desheathing de ganglia en het opnemen van de swimmerets fictieve motor patroon extracellulair uit de geïsoleerde zenuwstelsel.

Bovendien kunnen we de activiteit van neuronen swimmeret intracellulair opgenomen van dendrieten volgen. Hier hebben we ook een korte beschrijving van deze technieken en bieden een aantal voorbeelden. Verder kan de morfologie van neuronen swimmeret beoordeeld worden met verschillende kleuringen. Hier geven we voorbeelden van intracellulaire (door iontoforese) kleurstof gevuld neuronen en backfills zwembaden van swimmeret motorische neuronen. In ons labwe deze preparaat basisfuncties fictieve beweging, het effect van sensorische feedback op de activiteit van het CZS en coördinatie tussen microschakelingen bestuderen op cellulair niveau.

Introduction

De swimmerets van rivierkreeft serveren een functie in de houding controle en sloeg ritmisch wanneer de dieren zwemmen naar voren, ventileren hun holen of vrouwtjes beluchten hun eieren 5, 6. De swimmerets van de rivierkreeft, Pacifastacus leniusculus, komen in paren van de tweede naar de vijfde abdominale segment, één ledemaat aan elke kant van het abdomen 7. Het centrale zenuwstelsel produceert op zichzelf de ritmische motor babbel die swimmeret beweging in het intacte dier en in de geïsoleerde zenuwkoord bereiding aandrijft. Als er geen zintuiglijke feedback of aflopende ingang aanwezige ritmisch motor patroon geproduceerd wordt fictief voortbeweging 1, 2. In het swimmeret systeem is deze motor patroon in niets parameter van de activiteit van de swimmerets gemeten in het intacte dier.

De beweging van elke swimmeret wordt aangedreven door een microcircuit dat zich in en beperkt tot een corresponding hemiganglion 1 -. 3 In elke microschakelings- er een patroon te genereren kernel die vijf geïdentificeerde niet stekelige interneuronen bestaat. Ze kunnen functioneel worden gekarakteriseerd als zijnde ofwel Inhibitor van Power Stroke (IPS) of Inhibitor van Return Stroke (IRS) 8. Deze IPS en IRS interneuronen zijn niet endogeen oscillatoren, in plaats van hun afwisselende activiteit wordt gedreven door wederzijdse inhibitie 9. Omdat deze interneuronen remmen de swimmeret motorische neuronen rechtstreeks, wordt de afwisselende PS-RS beweging gegenereerd 10. Locomotion echter niet alleen vereist het genereren van de activiteit, maar ook de coördinatie van de verschillende onafhankelijke microschakelingen. In het swimmeret systeem zoals coördinatie door de coördinerende microschakeling die ervoor zorgt dat ledematen actief zijn correct momenten. Dit microcircuit is gebouwd door drie geïdentificeerde neuronen in elk segment 11-15.

Dit protocol voorziet in the eerst stap voor stap dissectie gids voor de keten ganglia (T4 A6, figuur 1) te isoleren. We laten zien hoe u de geïsoleerde abdominale zenuwkoord pin en desheathe elk ganglion. In deze geïsoleerde preparaat zenuwstelsel, de neuronen belast swimmeret beweging zijn gebruiksklaar in elektrofysiologische en morfologische experimenten. Het tweede deel van dit protocol toont de belangrijkste kenmerken van de swimmeret motor patroon. Dit omvat een stap-voor-stap handleiding voor het extracellulair staat de activiteit van swimmeret motorische neuronen. Axonen van RS motorische neuronen projecteren via de voorste tak van zenuw N1, terwijl axonen van PS motorische neuronen projecteren via de achterste tak van dezelfde zenuw (figuur 1) 4. Derhalve hun activiteit kan worden opgenomen van deze takken met differentiële pinelektrodes.

Figuur 1
Figuur 1: Geïsoleerde zenuwstelsel van thoracale ganglion 4 (T4) van de buik ganglion 6 (A6) en een schematisch diagram van het T4. Thoracale ganglion 4; T5: thoracale ganglion 5; A1, A2 ... A6 buik ganglion 1, abdominale ganglion 2 ... buik ganglion 6; N1: zenuw N1; N2: zenuw N2; N3: zenuw N3; PS: power-slag; RS: return-takt. Directionele afkortingen: A = anterior; P = posterior.

Deze dissectie procedure en de elektrofysiologische techniek gedemonstreerd zijn handig voor studenten en kunnen studenten praktische cursussen aanvullen in de fysiologie. De geïsoleerde keten ganglia is gebruikt in een aantal experimenten zenuwstelsel functie coördinatie of modulatie van swimmeret microcircuits 6 en neuronale controle van adaptief gedrag in beweging 16, 17 bestuderen. De rivierkreeft swimmeret biedt dus een enorme hoeveelheid interessante onderwijs of tregende het kansen die allemaal beginnen met de dissectie van de ventrale zenuw koord van rivierkreeft en extracellulaire van de fictieve motor patroon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deze dissectie procedure is in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen Richtlijn van de Raad van 22 september 2010 (2010/63 / EU).

1. Voorbereiding

  1. Verkrijgen rivierkreeft, Pacifastacus leniusculus (Dana), van beide geslachten ≥8 cm groot. Zorg ervoor dat de dieren zijn van vitaal belang en de buik en de buik ledematen intact zijn.
  2. Zorg ervoor dat het schild te inspecteren en dat dit cuticula is hard en stijf. Pre- en postmolt dieren een zachte schaal en zijn niet geschikt voor experimenten omdat tijdens de rui proces vele parameters (bijvoorbeeld afname van locomotorische activiteit).
  3. Verzamel alle gereedschappen en materialen die worden gebruikt tijdens de dissectie, pinning en desheathing van de zenuw koord weergegeven in figuur 2 en in de supplementen verstrekt vermeld.

Figuur 2
Figuur 2:

(1) grote emmer gevuld met ijs; (2) rivierkreeft zoutoplossing; (3) zoutoplossing dispenser; (4) dissectie microscoop; (5) dissectie gerecht; (6) sterke scharen; (7) pincet (8) lente schaar; (9) petrischaal bekleed met duidelijke Sylgard; (10) bevestigingspennen; (11) koude bron lamp.

2. Bruto Dissection

  1. Verdoven dier op het ijs voor 15 - 20 min. Het uitvoeren van het eerste deel van het bruto dissectie op een lab bankje bij de gootsteen omdat hij een verbloeding stap en het monster moet regelmatig worden gespoeld met rivierkreeftjes zoutoplossing tijdens de procedure.
  2. Houd dier ventrale zijde naar boven en gebruik sterke schaar om beide klauwen snijden op hun bases in de buurt van de thorax (Figuur 3-1). Verwijder links en rechts Uropode (Afbeelding 3-2).
  3. Leg het dier ventrale zijde naar boven in de dissectie schotel bekleed met zwarte Sylgard. Elevate kopborststuk door het invoegen van het ijs eronder en speld de buik op de telson (Figuur 4A).
  4. Vul het zoute dispenser met ~ 60 ml gekoelde rivierkreeft zoutoplossing. Perfuse rivierkreeft met koude zoutoplossing door de klauw opening (Figuur 4B). Overtollige zout zal afdruipen door de bezuinigingen op de uropods. Bedek rivierkreeft met ijs tijdens exsanguinatie
  5. Onthoofden het dier met een enkelvoudige transversale gesneden juist achter het dier ogen met behulp van een sterke schaar (Figuur 5A). Verwijderen lopen benen nabij de basis gewrichten zoals in figuur 5B.
  6. Isoleer de buik met de laatste thoracale segmenten van de rest van het kopborststuk. Voeg een eerste snede ter hoogte van de tweede benen lopen (thoracale segment 3) door de punt van de schaar in de opening van de tweede lopende poot en snijden aan de andere kant. (Figuur 6A-1).
  7. Verleng deze eerste snede aan beide zijden door tHij cephalothorax (Figuur 6A-2).
  8. Draai het dier open sommige van de interne organen zichtbaar te maken. Duw de prominente spijsverteringsklier (figuur 6B-3) aan het voorste gedeelte van het monster en een tang om de reproductieve organen van de buikholte verwijderen.
  9. Verwijder het voorste deel van het kopborststuk (figuur 6C). Gebruik lateraal bezuinigingen op de zijdelen van de schaal, die de kieuwen te verwijderen, aan beide zijden van de resterende thorax (figuur 6D-4). Verwijder de kieuwen en spoel het monster met koude zoutoplossing.
  10. Verdere dissectie met een snede door de gehele lengte van de sternale plaat zoals in figuur 6E-5. Maak deze bezuiniging op maximale laterale posities tussen Pleuron en swimmerets (Figuur 6E rode markeringen). Ga aan de andere kant met een zelfde cut. Spoel het monster met koude zoutoplossing.
  11. Het uitvoeren van de resterende dissectie onder een dissection microscoop. Plaats buik ventrale zijde van de rivierkreeft's in de dissectie schotel bekleed met zwarte Sylgard en gevuld met rivierkreeftjes zoutoplossing zodat het dekt het monster.
    OPMERKING: De volgende stappen (2,12-4,8) bevatten directionele instructies die gelden voor rechtshandig onderzoekers. In de volgende stappen (2,12-6,8) is het belangrijk rivierkreeft zoutoplossing vervangen regelmatig elke 20-30 min met koude zoutoplossing, het zenuwstelsel gezond.
  12. Fix het exemplaar met insect pinnen posterieur aan het telson en naar voren bij de resten van de schaal. Plaats het monster zodat het telson naar links wijst en parallel aan de rand van de tafel.
  13. Gebruik grof tang in de linker hand door een wandelende been opening (Figuur 7A) te pakken en trek het model geopend (Figuur 7B witte pijl). Identificeer de grote twee dorsale flexor spier strengen (Figuur 7B-1 en C-1) en snijd hun ventralebasis zoals getoond in Figuur 7B.
  14. Identificeer de sternale slagader (figuur 7C-2), die afstamt van dorsale (het hart) ventrale op de 4e thoracale segment. Deze slagader ligt recht boven de zenuw koord (figuur 7C-3), voordat deze projecten onder de zenuw koord, de vorming van de ventrale slagader.
  15. Doorsnijden het borstbeen slagader. Zoals aangetoond in figuur 7C, til de slagader eerste, met behulp van een blad van de schaar, en alleen knippen als de ventraal gelegen zenuwkoord zichtbaar is.
  16. Bevestig de dorsale flexoren voren (aan de rechterkant). Dit dient te gebeuren in maximaal gestrekte positie met pinnen, zodat ze niet de visie zal blokkeren en het monster blijft gespannen. Wanneer de dorsale spier strengen bevestigd (figuur 8.1), de eerste abdominale ganglia, A1 en A2, met bijbehorende zenuwen N1, N2 en N3 zichtbaar (figuur 8).
  17. Gebruik een tang in de linkerhand naar de spec te grijpenimen op een opening van de benen lopen. Gedurende de volgende dissectie stappen trekt voorzichtig met het model open te houden.
  18. Doorsnijden van de zenuwen N3 op de meest afgelegen positie van de zenuw koord. (Figuur 8-3).
  19. Snijd de flexor spieren nabij de ventrale apodeme zoals in figuur 8.4. Verzorgen de zenuw snoer of de zenuwen N2 niet te beschadigen.
  20. Herhaal de stappen 2.18 en 2.19 van de zenuwen N3 en de flexor spieren van de resterende abdominale ganglia A2 tot A5.
  21. Op de laatste buik ganglion, A6, snijd het dorsale flexor spieren van de ventrale apodeme en het monster moeten kijken zoals getoond in figuur 9.
  22. Snijd het borstbeen plaat posterior aan de zenuwen van de A6 (Figuur 9-1) en houd het ventrale deel (Figuur 9-2). Gooi het dorsale gedeelte met buigspieren (Figuur 9-3). Fix het borstbeen plaat naar voren met pinnen door de openingen van de benen lopen,en posterieur tot A6.

3. Fijne Dissection

  1. Plaats het monster onder de microscoop met het voorste deel weg gericht en het achterste deel naar de rand van de tafel '.
  2. Een tang zoals getoond in figuur 10A om de voorste delen van de cephalothoracic sterna verwijderen.
    OPMERKING: De thoracale ganglia en de bijbehorende zenuwen worden deels gedekt door het been spieren en cephalothoracic sterna. De cephalothoracic sterna vormen een skelet dat de zijdelings gelegen holtes van de benen lopen van elkaar scheidt en de mediale holte waarin de ventrale zenuw koord bevindt.
  3. Snijd de spieren tussen de resterende exoskeletal structuren zoals aangegeven in Figuur 10B -1 en B2. Gebruik een tang om te grijpen en til de voorste einde van de ventrale zenuw koord (Figuur 10C).
    OPMERKING: De zenuw koord zal worden beschadigd in het proces dus vermijd het oppakken van de nerve koord meerdere keren.
  4. Snijd de thoracale zenuwen zijdelings terwijl het opheffen van de zenuw koord (Figuur 10C-3). Houd deze zenuwen op geschikte lengte voor pinning. Verwijder de kneep van de keten ganglia, die werd opgenomen met forceps, door het wegsnijden van alle weefsel anterior T4 (figuur 10C-4).
  5. Plaats het monster met het voorste gedeelte links en focus op A1. Snijd de zenuwen N1 en N2 van de A1 op een geschikte lengte (max. 1 cm) voor pinning ze uit.
  6. Focus op A2 en identificeren van de zenuwen N1, N2 en N3 van dit segment (figuur 11). De zenuwen N1 van abdominale ganglia A2-A5 tussen twee sternale cuticulair infoldings wonen in elk segment (figuur 11A-1) en zijn gedekt door spiermassa. Maak een snede langs de achterste borstbeen cuticulair binnen vouwen. Begin bij de laterale rand van de buik en ga naar de middellijn zoals weergegeven in figuur 11A.
  7. Als het doel N1 is nog inhamrood met weefsel zoals getoond in figuur 11B (rode pijl), dwars door de spier bundel, maar deze keer juist voor zowel sternale cuticulaire infoldings en ​​de zenuw N1 (figuur 11B-2).
  8. Snijd zenuw N1 zo distaal mogelijk (Figuur 11C-3). Nerve N1 volledig zichtbaar en de voorste en achterste tak kan worden geïdentificeerd (Figuur 11C).
  9. Ga verder naar de contralaterale zenuw N1 en snijd eerst de spieren langs de achterste borstbeen cuticulair binnen vouwen, mediaal beginnen, in de buurt van het ganglion (Figuur 11D). Als de zenuw is nog altijd in weefsel, dwars door de spier bundel, maar deze keer juist voor zowel sternale cuticulaire infoldings en ​​de zenuw N1, overeenkomstig figuur 11B-2. Snijd de zenuw N1 zo distaal mogelijk.
  10. Snijd de zenuwen N2 van deze ganglion op een geschikte lengte (ong. 0,5 cm) voor pinnen.
  11. Herhaal de stappen 3,7-3,11 voor de zenuwen van A3-A5.
  12. Snijd de NeRves van ganglion A6 zo distaal mogelijk (Figuur 12A). Gebruik een tang om meerdere zenuwen van A6 te grijpen om dit ganglion tillen en beginnen met het isoleren van de keten van ganglia van het borstbeen plaat.
  13. Terwijl het opheffen van de zenuw snoer, trek er zachtjes in de voorste richting zoals aangetoond in figuur 12B (witte pijl). Aangezien de afzonderlijke ganglia worden opgeheven, verwijdert de ventrale ader die kunnen worden verbonden aan de ventrale zijde van de zenuwkoord (Figuur 12C). Ga door met deze (zachtjes) Trek-cut volgorde totdat de zenuw koord is volledig geïsoleerd.
  14. Breng de geïsoleerde keten van ganglia naar een petrischaal bekleed met duidelijke Sylgard en gevuld met rivierkreeftjes zoutoplossing (Figuur 12D).

4. Pinning de Nerve Koord in de petrischaal

OPMERKING: Gebruik kleine pinnetjes gesneden uit roestvrij staaldraad (zie supplementen) om de zenuw koord pin. Raak alleen de zenuw eindigend met de tang en niet squeeze de connectieven of ganglia.

  1. Speld de keten van ganglia in een rechte lijn, terwijl de toepassing van zachte stretch.
  2. Schik de zenuw koord in de petrischaal met de rugzijde naar boven (Figuur 13, zwarte lijn). De ventrale zijde van de ganglia kan worden geïdentificeerd door zijn convexiteit; de dorsale zijde is vlak. Speld de thoracale zenuwen naar de zijkanten. Ga verder met de zenuwen van A6, het uitrekken van de zenuw koord langs zijn lengteas.
  3. Pin uit de zenuwen van de A1 bij een hoek van 90 ° ten opzichte van de zenuw koord.
  4. Ga verder met A2 en speld de zenuwen N2 onder een hoek van 35-45 ° ten opzichte van de zenuwkoord (Figuur 1A).
  5. Scheid de zenuwen N1 in de voorste en achterste takken voordat pinning zoals getoond in figuur 14. Met twee paar fijne tang te halen met een pincet de voorste en anderzijds de achterste tak van de zenuw N1. Zorg ervoor dat alleen de meest distale einde halens van de zenuw takken. Nu trek ze voorzichtig uit elkaar.
  6. Pin het voorste tak van de zenuw N1 bij 90 ° ten opzichte van de zenuwkoord (Figuur 1A). Speld de posterieure tak van zenuwen N1 tussen de anterior N1 tak en de zenuw N2.
  7. Herhaal de stappen 4,4-4,6 voor de zenuwen van ganglia A3-A5. Terwijl het fixeren van de zenuwkoord stretch in lengterichting als transversale richtingen.

5. Desheathing de Ganglia

  1. Plaats het preparaat zodanig dat de handen van de experimentator steeds rusten op een stabiele vliegtuig te schudden. Om desheath de ganglia verlichten de zenuw snoer van onderen.
  2. Focus op elke buik ganglion A1 tot A5. Gebruik fijne lente schaar om een kleine zijdelingse snede door het ganglion schede te maken, posterior naar het ganglion en tussen de zenuwen N2 en N3 (Figuur 15A rode pijl).
  3. Pak de ganglion omhulsel met behulp van zeer fine pincet en dwars dwars door de mantel boven de connectoren, zoals aangegeven in Figuur 15A-1. Zorg dat u niet te knijpen of snijd de zenuw koord met de schaar.
  4. Nog steeds houden en de opheffing van het ganglion schede met een tang blijven om het te snijden langs de laterale grenzen van het ganglion (Figuur 15B-2 en -3). Verwijder de mantel. Alternatief pin aan beide zijden van de connectoren zodanig dat het opgelost maar de zenuw snoer niet geperst.
  5. Herhaal stap 5,2-5,4 voor abdominale ganglia A1 tot A5.
  6. Desheathe de thoracale ganglia en de ganglion A6 op een vergelijkbare manier. Om A6 start anterior desheathe naar het ganglion en ga in de posterieure richting. Pin het ganglion omhulsel van A6 aan het achterste uiteinde van de keten ganglia.

6. Extracellulair Opnames van Motor Neuronen

  1. Verzamel alle gereedschappen en materialen die worden gebruikt voor het extracellulaire opnames getoond in figuur 16B en vermeld in de supplementen. Een overzicht van de opname setup is getoond in figuur 16A. Draai alle elektronische apparaten die in dit experiment (figuur 16C), waardoor de versterkers kan opwarmen gedurende ten minste 30 min voor opname. Zet de computer aan en start de opname software.
  2. Plaats de keten ganglia van de microscoop tafel en verlichten van beneden. Plaats het opnamemedium elektrode in de Sylgard dicht bij het ​​doel zenuw en de referentie-elektrode in de buurt positie, maar lateraal van de ganglia (Figuur 17A en B). Buig de doelgroep zenuw rond de registratie-elektrode (Figuur 17C).
  3. Strek de zenuw iets, om het contact tussen de elektrode en de zenuw te verzekeren en speld het aan de zijkant (F IGUUR 17D). Bevestig de elektrode kabels aan de microscoop tafel met behulp van boetseerklei, zodat ze blijven in de gewenste positie.
  4. Gebruik eeninjectiespuit gevuld met vaseline en een 20 gauge naald (met afgeronde tip) (Figuur 17E-3) om de beoogde zenuw van de badoplossing isoleren. Dep eerst wat vaseline op de Sylgard rond de registratie-elektrode. Het resultaat is een laag van vaseline die de Sylgard in de nabijheid van de registratie-elektrode (figuur 17E-4). Zorg dat er geen direct schar op de zenuw en vermijd luchtbellen in deze laag.
  5. Verzegel de registratie-elektrode vaseline van alle kanten naar het maaiveld van de zoutoplossing (figuur 17F).
  6. Herhaal deze procedure voor alle doelgroepen zenuwen waarvan de activiteit moeten worden gecontroleerd.
  7. Beginnen met opnemen. Gebruik een continue of kloof vrije overname modus en een sampling rate van 5 kHz. Stel de extracellulaire versterker de volgende parameters; krijgen tot 1.000 (versterkt het signaal 1.000 keer, zorg voor deze versterking parameter in de acquisitie software instellingen omvatten) eenda filterbreedte bereik van 300 Hz (laag uitgesneden) tot 2.000 Hz (high cut).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met de gelijktijdige extracellulaire opnames goede kant en PS motorneuronen van een ganglion, de afwisselende werking van deze motor neuron pools kunnen worden gevolgd (Figuur 18), die het fictieve motoriek patroon.

Figuur 18
Figuur 18: Schematische voorstelling van een ganglion en plaatsing van differentiële pin elektrode extracellulaire opname van RS motorische neuronen (bovenste trace) en PS motorische neuronen (onderste spoor)..

De extracellulaire PS activiteit van ipsilaterale PS 2 naar PS 5 motorische neuronen belicht interessante aspecten van intersegmentele coördinatie in het swimmeret systeem (Figuur 19A).

Ten eerste, de activiteit begint altijd met een PS burst A5 (figuur 19A, 4de sporen) en de excitatie voortplant in de anterieure richting (<strong> Figuur 19A, groene lijn). Tweede periode (dat is de tijd gemeten vanaf het begin van een burst tot het begin van de volgende burst) in elk segment blijft constant (Figuur 19A, cyaan pijl). Dit geldt zolang de informatiestroom van één ganglion naar de volgende intact en de experimentele omstandigheden niet veranderen.

In verschillende preparaten of onder verschillende experimentele omstandigheden de periodes en barstte duur kan sterk variëren: van periodes van 0,25 op 1 sec. Om deze parameters te vergelijken tussen verschillende preparaten moeten ze worden genormaliseerd en grafiek in een fase histogram (Figuur 19B). Hieruit blijkt de derde interessante aspect van de motor patroon: de fase-lag tussen segmenten, de intersegmentele vertraging constant en onafhankelijk van de frequentie van het ritme.

Om een ​​fase histogram te berekenen, de volgende metingen en berekeningen zijn necessary:

Eerst wordt een referentiesignaal worden gekozen. Meestal gebruiken we de PS spoor van de meest posterieure ganglion (bv PS 5) als referentie (zijnde tijd 0) voor een fase histogram van de swimmeret ritme opgenomen tussen verschillende segmenten (Figuur 19A) .Vervolgens, het meten van de tijd (in ms ) van het ritme van het begin van een PS-5 reeks (tijd 0, figuur 19A, oranje stippellijn) aan het begin van de volgende PS 5 burst (Figuur 19A, cyaan pijl) .Binnen deze cyclus, het meten van de latenties (in ms ) tussen het begin van de PS 5 burst (tijd 0) en het begin (burst begin figuur 19A en B, oranje pijlen) en einde (offset Figuur 19A en B, violet pijlen) van de PS barsten in alle andere ganglia . Daarom om de fase begin berekenen en compenseren voor elke barstte de latencies worden gedeeld door de gelijktijdige periode. Deze metingen resulteren in numerieke vaarden tussen 0 en 1. Tenslotte plot deze waarden in een fase histogram zoals getoond in figuur 19B.

De resulterende fase histogram (figuur 19B) bevat informatie over de duty cycle van de PS barsten in elk segment. En de intersegmentele fase-lag van ~ 0,25 tussen naburige segmenten is duidelijk zichtbaar.

Figuur 19
Figuur 19: (A) Schematische weergave van de plaatsing van de elektroden en extracellulaire van ipsilaterale PS 5 naar PS 2. (B) Metingen en berekeningen die nodig zijn voor de fase histogram. De fase histogram berekend uit tien opeenvolgende bursts (n = 10) toont de intersegmentele fasevertraging van ~ 0,25.

Voor meer gevorderde onderzoekers, kan intracellulaire opnames met scherpe micro-elektroden van de dendrieten van motorische neuronen nuttig zijn. De membraanpotentialenindividuele intracellulair opgenomen PS motorneuronen tonen in fase oscillaties met extracellulair geregistreerde activiteit van PS motorische neuronen van hetzelfde hemiganglion (Figuur 20, panelen grijs). Alternatief kan RS motorneuronen of interneuronen intracellulair worden op dezelfde wijze (gegevens niet getoond).

Figuur 20
Figuur 20:. Schema van plaatsing van de elektroden De membraanpotentiaal van een intracellulair opgenomen PS motor neuron (bovenste trace) oscilleert in fase (grijze panelen) met het extracellulair opgenomen PS activiteit (onderste spoor).

Voor de identificatie van intracellulair opgenomen neuronen (interneuronen of motorische neuronen), kunnen cellen worden kleurstof gevuld met behulp van scherpe micro-elektroden en iontoforese (zie bespreking). In figuur 21, twee intracellulaire kleurstof gevuld PS motorische neuronen worden getoond. Hun ventrale somataliggen posterior aan de basis van de zenuw N1. De primaire neurieten projecten voren (figuur 21B-2) en takken binnen het laterale neuropil (Figuur 21A en B-3); het axon van projecten via de achterste tak van de zenuw N1 naar de swimmeret musculatuur (Figuur 21B-4).

Figuur 21
Figuur 21: (A) Schematische voorstelling van een abdominale ganglion (B) Twee intracellulair lood PS motorische neuronen.. (1) somata; (2) primaire neurites; (3) dendritische vertakking in de laterale neuropil; (4) axonen project door de achterste tak van de zenuw N1; Bar = 100 urn.

Voor minder gevorderde onderzoekers, of degenen die willen de morfologie van de buik ganglion bestuderen, backfills van de PS en RS motor neuron zwembaden via de zenuw N1, zijn een interessante oefening. In figuur 22, de RS en PS motorische neuronen van één hemiganglion werden gekleurd met Co 2+ (RS) en Ni 2+ ionen (PS), respectievelijk. Somata PS motorische neuronen zich posterieur van de basis van de zenuw N1 (Figuur 22-1). Alle Somata RS motorische neuronen zich juist voor de basis van de zenuw N1 (Figuur 22-2).

Figuur 22
Figuur 22: Backfills van de anterieure (oranje, Co 2+) en posterior (blauw, Ni 2+) tak van de zenuw N1 (1) Somata van PS motorische neuronen;. (2) somata van RS motorische neuronen. Bar = 100 urn.

Figuur 3
Figuur 3: Het verwijderen van de klauwen (1) en uropods (2). Rode lijnen (1) en (2) geven posities van bezuinigingen. Bar = 5 cm.


Figuur 4:. (A) Het dier wordt gespeld ventrale zijde naar boven en vastgesteld op het telson (B) De rivierkreeft wordt bloed ontdaan door de klauw opening met koude zoutoplossing. Bars = 5 cm.

Figuur 5
Figuur 5: (A) Onthoofding en (B) het verwijderen van het lopen benen. Rode lijnen geven de posities van bezuinigingen. Bars = 1 cm.

Figuur 6
Figuur 6: (A, B, C en D) Verwijdering van de voorste en de zijdelen van het kopborststuk. E. Opening van de buik aan de laterale zijde.Rode lijnen (1), (2), (4) en (5) geven de posities van de delen. (3) spijsverteringsklier. Rode pijlen wijzen naar de reeds geopende buikholte. Bars = 1 cm.

Figuur 7
Figuur 7: (A) Het monster wordt gegrepen bij een opening van de benen lopen (rode pijlen) (B) De rugspier strengen (1) worden doorsneden, terwijl het monster wordt geopend.. Witte pijl geeft de richting waarin de sternale plaat getrokken. (C) Overzicht van de buikholte met sternale slagader (2) en zenuwkoord (3).

Figuur 8
Figuur 8: dwarsaanzicht van de rivierkreeft buik met vaste rugspier strengen (1) en sternale slagader (2); Rode lijnen (3) en (4) geven de posities van de delen. Bars= 5 mm.

Figuur 9
Figuur 9: dorsale en ventrale delen van de buik worden gescheiden van elkaar (1) Rode lijn geeft de positie van de snede.. Borstbeen plaat (2) met ventrale zenuw koord; dorsale deel van het abdomen (3).

Figuur 10
Figuur 10:.. (A) Posities van de tang om de voorste cephalothoracic sterna verwijderen (B) Rode lijnen (1) en (2) geven aan waar de spieren te snijden tussen de resterende cephalothoracic borstbeenderen (C) De thoracale zenuwen worden doorsneden op de rode lijnen (3) tot de thoracale ganglia van het omringende weefsel te isoleren. Rode lijn (4) geeft de snede tussen T3 en T4. Bars = 5 mm.


Figuur 11: (A en B) Uitzicht op het borstbeen plaat op A2. De zenuw N1 wordt geïsoleerd uit het weefsel met een snede langs de achterste sternale cuticulaire binnen vouwen (1) en voorste zowel sternale cuticulaire infoldings (B2). (C) Hogere vergroting van het gebied rond A2, de geïsoleerde zenuw N1. ( D) Isolatie van de zenuw N1 aan de contralaterale zijde met gelijke delen. Rode lijnen (2) en (3) geven posities van bezuinigingen; (1) voorste en achterste borstbeen cuticulair infoldings; Bars = 5 mm.

Figuur 12
Figuur 12: (A en B) A6 wordt geïsoleerd uit het weefsel en zenuw snoer kan worden opgetild op de zenuwen van A6 (C). (D) Geïsoleerde zenuwkoord wordt overgebracht in een petrischaal bekleed met duidelijke Sylgard en gevuld met zoutoplossing. Rode lijnen geven de posities van bezuinigingen. Bars = 5 mm.

Figuur 13
Figuur 13: Zij mening van een ganglion Identificatie van de dorsale en ventrale zijde (zwarte lijn) van de zenuw koord.. Balk = 5 mm

Figuur 14
Figuur 14: De voorste tak van de zenuw N1 is gescheiden van de achterste tak Bar = 5 mm..

Figuur 15
Figuur 15: Aanwijzingen voor desheathing van een abdominale ganglion (A) Positie van de eerste kleine snede door de schede van de connectieven (rode pijl), geplaatst laterale en achterste naar het ganglion. De daarop volgende snede door het omhulsel boven de verbindende wordt gekenmerkt door de rode lijn (1). (B) Rode lijnen (1) en (2) markeren de bezuinigingen langs de laterale grenzen van het ganglion. De katheter kan vervolgens worden getrokken uit het ganglion. Bars = 1 mm.

Figuur 16
Figuur 16:. (A) Overzicht van de opname setup (b) materialen en gereedschappen die nodig zijn voor de extracellulaire opnames. C. Materiaal benodigd elektrofysiologische opname. (1) bron lamp koud; (2) kooi van Faraday; (3) stereo microscoop; (4) air-tafel; (5) microscoop tafel; (6) spiegel; (7) differentiële pin elektroden; (8) injectiespuit gevuld met petroleumgelei; (9) boetseerklei; (10) forceps; (11) ter beschikking vloeibare afvalstoffen; (12) digitizer; (13) extracellulaire versterker; (14) computer, uitgerust met opname-software en monitor.

Figuur 17
Figuur 17: (A en B) Plaats van opname (1) en referentie (2) pin-elektrode. (C en D) De achterste tak van de zenuw N1 wordt gebogen rond de registratie-elektrode. E. De basis (4) van de registratie-elektrode is geïsoleerd met vaseline. F. De volledige registratie-elektrode wordt geïsoleerd met vaseline uit het bad oplossing. (3) Spuit gevuld met vaseline. Bars = 2 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De anatomie van rivierkreeft en hun buik ganglia is eerder beschreven 5, 18, ​​19, 20 en het wordt aanbevolen om vertrouwd te raken met hen voorafgaand geworden om de dissectie om het snijden van belangrijke zenuwen te voorkomen.

Het is cruciaal om het preparaat bij temperaturen onder 23 ° C houden om afbraak van het geïsoleerde zenuwkoord voorkomen. Dit kan gemakkelijk worden bereikt door vervanging van de badoplossing elke 20-30 min met koude rivierkreeft zoutoplossing. Onder deze omstandigheden de keten ganglia kan worden gebruikt voor elektrofysiologische experimenten tot 12 uur.

Soms swimmeret motorische neuronen zijn inactief en geen spontane barsten activiteit. De cholinergische agonist carbachol wordt gebruikt om barsten activiteit in deze preparaten induceren. Opgelost in koud rivierkreeft zoutoplossing, bad toepassingen van 1-3 uM carbachol zijn voldoende om de swimmeret ritme 21 activeren.

ove_content "> De fictieve motoriek en vooral de coördinatie van de ledematen die in dit systeem veel informatie over de cellulaire eigenschappen van ritmische activiteit en coördinatie. In dit systeem de neuronale elementen 10/08 van de lokale microcircuits worden geïdentificeerd en bovendien de coördineren van het netwerk is bekend in cellulaire detail 11,14,15. De conclusies die uit de experimenten uitgevoerd met extracellulaire opnames resultaten, zodat al voorspellingen voor wiskundige modellen en voor robotici.

Alle swimmeret neuronen tonen dendritische vertakking binnen de laterale neuropil en kan intracellulair worden opgenomen van deze dendrieten. In figuur 20 wordt een intracellulaire opname van een PS motor neuron getoond. Voor dit een scherpe micro-elektrode (zie supplementen) gevuld met 1 M KAc + 0,1 M KCl (elektrode weerstand tussen 35 - 45 MQ) boven de Lateral neuropil wordt geplaatst. De oscillerende membraanpotentialen als well pieken van de dendrieten van PS en RS motorneuronen kan worden geregistreerd wanneer de elektrode nabij de basis van zenuw N1 ingevoegd.

Om individuele neuronen (bijvoorbeeld motorische neuronen) vlekken intracellulair zoals getoond in figuur 21, moet de scherpe micro-elektrode worden opgevuld met fluorescerende kleurstof (bijvoorbeeld 1% dextraan Texas Red, zie supplementen) opgelost in 1 M KAc + 0,1 M KCl. Om motorneuronen intracellulair vullen door iontoforese, polariserende pulsen van 1 nA met een duur van 250 ms bij 2 Hz toegepast gedurende minstens 10 minuten. Voor positief geladen kleurstoffen gebruiken depolariserende peulvruchten en voor negatief geladen kleurstoffen gebruiken hyperpolariserende pulsen. Langere fills resulteren in een sterkere gelabeld neuron. Voor de visualisatie van de zenuw koord moet worden vastgesteld, uitgedroogd, en gemonteerd 22.

Een methode om een pool van motorneuronen vlek is backfills gebruik van de zenuw N1 (Figuur 22) 4, 23. Plaats een goed vaseline rond de achterste tak van de zenuw N1 naar het zwembad van PS motorische neuronen op te vullen. Om de pool van RS motor vlekken neuronen een goed op de voorste tak van de zenuw N1 geplaatst. De rivierkreeft zoutoplossing in de put wordt vervangen door DDH 2 O. Snijd vervolgens deze zenuw in de put en laat het gedurende 15 minuten in DDH 2 O bij kamertemperatuur (RT). Daarna vervang de DDH 2 O in de putten met ofwel 5% CoCl2 - of 5% NiCl2 - oplossing (opgelost in DDH 2 O) en dicht putten met vaseline. Het monster moet gedurende ten minste 15 uur bij 4 ° C. Open de putten, verwijder de kleurstof en spoel het monster 3 keer met een zoutoplossing. Neerslag de Ni2 + of Co2 + ionen met 10 druppels Dithiooxamid (verzadigde oplossing opgelost in 100% EtOH) per 10 ml rivierkreeft zoutoplossing in de Petri-schaal onder de kap 20 minuten bij kamertemperatuur. Ni 2+ - ionen zal neerslaan op blauwe Ni (SCH) en Co 2+

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wij bedanken Jos Burgert voor het helpen met een aantal van de cijfers. We zijn dankbaar voor Ingo Selbach (en de groep "Edelkrebsprojekt NRW") voor zijn inspanningen om het lab te voorzien van proefdieren. Wij danken Anna C. Schneider voor proeflezen eerste versies van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door een Emmy Noether DFG subsidie ​​SM 206 / 3-1 en een startup subsidie ​​van de Universiteit van Keulen voor vrouwelijke docenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-channel extracellular amplifier: MA 102  Amplifier Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany
air-table Technical Manufacturing Corporation
(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA		 63-534
Axon Digidata 1440A Digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA DD1440A
big bucket 
Clampex & Clampfit pClamp 10, recording and analysis software Molecular Devices Design, Union City, CA pClamps 10 Standard
cold lamp source with flexible light guide (fiber optic bundle)  Euromex microscopes holland, Arnhem, BD LE.5211 & LE.5235
computer and monitor equipped with recording software
container and pipette for liquid waste 
crayfish saline  contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. 
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) fluorescent dye, lysine fixable Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany D3328
dissection dish  (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone
faraday cage
fixing pins
forceps (biology, Dumont #5) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11252-20
forceps (biology, Dumont #55) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11255-20
forceps (electronic, Dumont #5) Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11251-20
intracellular electrode Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament Sutter Instruments, Novato, CA BF100-50-10
Leica S8 Apo StereoZoom Dissection Microscope                       Zoom 1x - 8x Leica, Germany 10446298
microscope table
mirror to illuminate preparation from below
modeling clay
Olympus SZ61 Dissection Microscope                       Zoom 0.67x - 4.5x Olympus, Germany
petri dish  94 x 16 mm; lined with clear silicone Greiner bio-one, Germany 633180
ring scissors ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm Fine Science Tools (FST), Germany 14054-13
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm Fine Science Tools (FST), Germany 15024-10 or          15000-08
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm Fine Science Tools (FST), Germany 91500-09 or           15396-00
sylgard 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
  2. Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).
  3. Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
  4. Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
  5. Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
  6. Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
  7. Huxley, T. H. The crayfish: An introduction to the study of zoology. , MIT Press. Cambridge, MA. (1980).
  8. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
  9. Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
  10. Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
  11. Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
  12. Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
  13. Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
  14. Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
  15. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
  16. Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
  17. Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
  18. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
  19. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
  20. Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
  21. Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
  22. Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts - Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
  23. Altman, J. S., Tyrer, N. M. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. Strausfeld, N. J., Miller, T. A. , Springer. New York, NY. 373-402 (1980).

Tags

Neurobiologie schaaldier dissectie extracellulaire fictieve motoriek motorische neuronen motoriek
De Swimmeret Systeem van rivierkreeftjes: Een praktische gids voor de dissectie van de Nerve Koord en extracellulaire Opnamen van de Motor van het Patroon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seichter, H. A., Blumenthal, F.,… More

Seichter, H. A., Blumenthal, F., Smarandache-Wellmann, C. R. The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern. J. Vis. Exp. (93), e52109, doi:10.3791/52109 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter