Abstract
यहाँ हम क्रेफ़िश पेट तंत्रिका कॉर्ड के विच्छेदन प्रदर्शित करता है। तैयारी पिछले दो वक्ष गैन्ग्लिया (टी -4, T5) और पेट गैन्ग्लिया की श्रृंखला (ए 6 को A1) शामिल हैं। Swimmeret प्रणाली: गैन्ग्लिया की यह श्रृंखला pleopods (swimmerets) के समन्वित हरकत कि ड्राइव केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का हिस्सा भी शामिल है। यह क्रेफ़िश में प्रत्येक swimmeret लयबद्ध बारी गतिविधि 1-3 उत्पन्न करता है कि अपने स्वयं के स्वतंत्र पैटर्न पैदा करने गिरी द्वारा संचालित है कि पांच दशक से अधिक के लिए जाना जाता है। मोटर न्यूरॉन्स प्रत्येक swimmeret की मांसलता anatomically और कार्यात्मक अलग आबादी चार दो समावेश innervating। एक swimmeret का त्याग (बिजली स्ट्रोक, पी एस) के लिए जिम्मेदार है। अन्य swimmeret के अतिकाल (वापसी स्ट्रोक, राज्यसभा) चलाता है। Swimmeret प्रणाली की मोटर न्यूरॉन्स अनायास विवो में दर्ज पैटर्न के समान है, जो एक कल्पित मोटर पैटर्न, उत्पादन करने में सक्षम हैं 1।
इस रिपोर्ट का उद्देश्य लय पैदा नेटवर्क और छात्रों को 'व्यावहारिक प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों के लिए स्वतंत्र microcircuits के समन्वय के अध्ययन के लिए एक दिलचस्प और सुविधाजनक मॉडल प्रणाली लागू है। उपलब्ध कराई प्रोटोकॉल, गैन्ग्लिया के पृथक श्रृंखला के लगाए गैन्ग्लिया desheathing और पृथक तंत्रिका तंत्र से extracellularly swimmerets कल्पित मोटर पैटर्न रिकॉर्डिंग, क्रेफ़िश के उदर तंत्रिका कॉर्ड के विच्छेदन के लिए कदम दर कदम निर्देश शामिल हैं।
इसके अतिरिक्त, हम डेन्ड्राइट से intracellularly दर्ज swimmeret न्यूरॉन्स की गतिविधियों की निगरानी कर सकते। यहाँ हम भी संक्षेप में इन तकनीकों का वर्णन है और कुछ उदाहरण देते हैं। इसके अलावा, swimmeret न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान विभिन्न धुंधला तकनीक का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। यहाँ हम डाई भरा न्यूरॉन्स और swimmeret मोटर न्यूरॉन्स के पूल के backfills (योणोगिनेसिस द्वारा) इंट्रासेल्युलर का उदाहरण देते हैं। हमारी प्रयोगशाला मेंहम एक सेलुलर स्तर पर microcircuits के बीच कल्पित हरकत, सीएनएस की गतिविधि पर संवेदी प्रतिक्रिया का प्रभाव है, और समन्वय के बुनियादी कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस तैयारी का उपयोग करें।
Introduction
क्रेफ़िश के swimmerets मुद्रा नियंत्रण में एक समारोह की सेवा और जानवरों के आगे तैर ताल जब हराया, उनके बिल या मादा अपने अंडे 5, 6 aerate हवादार। संकेत क्रेफ़िश, Pacifastacus leniusculus की swimmerets, पांचवें करने के लिए दूसरे से जोड़े में होते हैं पेट 7 के प्रत्येक पक्ष पर एक अंग के साथ पेट खंड,। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र बरकरार जानवर के रूप में अच्छी तरह से पृथक तंत्रिका कॉर्ड तैयारी में swimmeret आंदोलन चलाता है, जो अपनी ही लयबद्ध मोटर गपशप पर पैदा करता है। कोई संवेदी प्रतिक्रिया या उतरते इनपुट मौजूद है जब उत्पादित लयबद्ध मोटर पैटर्न कल्पित हरकत 1, 2 कहा जाता है। Swimmeret प्रणाली में इस मोटर पैटर्न बरकरार जानवर में मापा swimmerets की गतिविधि से किसी भी पैरामीटर में अलग नहीं है।
प्रत्येक swimmeret के आंदोलन में स्थित है और एक ग के लिए प्रतिबंधित किया गया है एक Microcircuit द्वारा संचालित हैhemiganglion 1 orresponding -। 3 प्रत्येक Microcircuit में पांच की पहचान की गैर spiking interneurons शामिल है कि एक पैटर्न पैदा करने गिरी है। वे कार्यात्मक होने के रूप में लक्षण वर्णन किया जा सकता है या तो पावर स्ट्रोक का अवरोध करनेवाला (आईपीएस) या वापसी स्ट्रोक का अवरोध करनेवाला (आईआरएस) 8। उनकी बारी गतिविधि पारस्परिक निषेध 9 से प्रेरित है बल्कि ये आईपीएस और आईआरएस interneurons, अंतर्जात oscillators के नहीं हैं। इन interneurons सीधे swimmeret मोटर न्यूरॉन्स रोकना है, इसलिए बारी पी एस-आरएस आंदोलन 10 उत्पन्न होता है। हरकत हालांकि, केवल भी अलग स्वतंत्र microcircuits के समन्वय गतिविधि की पीढ़ी की आवश्यकता होती है, लेकिन यह नहीं है। Swimmeret प्रणाली में इस तरह के समन्वय अंग सही समय पर सक्रिय हैं जो यह सुनिश्चित करता समन्वय Microcircuit द्वारा स्थापित है। इस Microcircuit प्रत्येक खंड 11-15 में तीन की पहचान की न्यूरॉन्स द्वारा बनाया गया है।
इस प्रोटोकॉल वीं के लिए प्रदान करता हैई पहली बार एक कदम-दर-कदम विच्छेदन गाइड गैन्ग्लिया (A6 के लिए टी -4, चित्रा 1) की श्रृंखला को अलग-थलग करने के लिए। हम अलग उदर तंत्रिका कॉर्ड पिन और प्रत्येक नाड़ीग्रन्थि desheathe करने के लिए कैसे दिखा। इस पृथक तंत्रिका तंत्र तैयार करने में, swimmeret आंदोलन के लिए जिम्मेदार न्यूरॉन्स electrophysiological और रूपात्मक प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए तैयार हैं। इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग swimmeret मोटर पैटर्न की मुख्य विशेषताओं को दर्शाता है। इस extracellularly रिकॉर्ड करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड swimmeret मोटर न्यूरॉन्स की गतिविधियों में शामिल हैं। आरएस मोटर न्यूरॉन्स के axons पुनश्च मोटर न्यूरॉन्स के axons एक ही तंत्रिका के पीछे शाखा के माध्यम से (चित्रा 1) परियोजना है, जबकि तंत्रिका एन 1 के पूर्वकाल शाखा के माध्यम से परियोजना 4। इसलिए उनकी गतिविधि अंतर पिन इलेक्ट्रोड के साथ इन शाखाओं से दर्ज किया जा सकता है।
चित्रा 1: पेट नाड़ीग्रन्थि 6 (ए 6) और यह टी -4 के एक योजनाबद्ध आरेख को वक्ष नाड़ीग्रन्थि 4 (टी -4) से पृथक तंत्रिका तंत्र:। वक्ष नाड़ीग्रन्थि 4; T5: वक्ष नाड़ीग्रन्थि 5; A1, A2 ... ए 6 पेट नाड़ीग्रन्थि 1, पेट नाड़ीग्रन्थि 2 ... पेट नाड़ीग्रन्थि 6; एन 1: तंत्रिका एन 1; एन 2: तंत्रिका एन 2; एन 3: तंत्रिका N3 के; पुनश्च: बिजली-स्ट्रोक; आरएस: वापसी स्ट्रोक। दिशात्मक लघुरूप: एक = पूर्वकाल; पी = पीछे।
इस विच्छेदन प्रक्रिया और प्रदर्शन किया electrophysiological तकनीक स्नातक छात्रों के लिए सुविधाजनक हैं और शरीर विज्ञान में छात्र व्यावहारिक पाठ्यक्रम पूरक हो सकता है। गैन्ग्लिया के पृथक श्रृंखला तंत्रिका तंत्र समारोह, समन्वय, या swimmeret microcircuits 6 के मॉडुलन के साथ ही हरकत में 16, 17 में अनुकूली व्यवहार की न्यूरोनल नियंत्रण का अध्ययन करने के प्रयोगों की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है। क्रेफ़िश swimmeret प्रणाली इस प्रकार एक विशाल राशि प्रदान करता है दिलचस्प शिक्षण या टी कीसभी क्रेफ़िश और कल्पित मोटर पद्धति का कोशिकी रिकॉर्डिंग के उदर तंत्रिका कॉर्ड के विच्छेदन के साथ शुरू अवसर जो बारिश हो रही है।
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Protocol
इस विच्छेदन प्रक्रिया यूरोपीय समुदाय परिषद के 22 में से निर्देशक एन डी सितम्बर 2010 (2010/63 / ईयू) के अनुसार है।
1. तैयारी
- आकार में ≥8 सेमी दोनों लिंगों के क्रेफ़िश, Pacifastacus leniusculus (दाना), प्राप्त करते हैं। जानवरों के लिए महत्वपूर्ण हैं और पेट और पेट अंगों बरकरार हैं कि सुनिश्चित करें।
- पृष्ठवर्म का निरीक्षण करने के ख्याल रखना और इस छल्ली कठिन और कठोर है। पूर्व और postmolt जानवरों एक नरम पृष्ठवर्म है और क्योंकि कई मापदंडों को बदलने molting प्रक्रिया के दौरान प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हैं (जैसे, हरकत गतिविधि में कमी)।
- विच्छेदन के दौरान सारे उपकरण और सामग्री इकट्ठा लगाए और तंत्रिका कॉर्ड के desheathing चित्रा 2 में दिखाया गया है और प्रदान की खुराक में सूचीबद्ध है।
(1) बर्फ से भरा बड़ी बाल्टी; (2) क्रेफ़िश खारा; (3) खारा मशीन; (4) विच्छेदन माइक्रोस्कोप; (5) विच्छेदन पकवान; (6) मजबूत कैंची; (7) संदंश (8) वसंत कैंची; स्पष्ट Sylgard से अटे (9) पेट्री डिश; (10) फिक्सिंग पिंस; (11) ठंड दीपक स्रोत है। 2. सकल विच्छेदन 3. ठीक विच्छेदन 4. पेट्री डिश में तंत्रिका कॉर्ड लगाए नोट: तंत्रिका कॉर्ड पिन करने के लिए (की खुराक देखें) स्टेनलेस स्टील के तार से कट छोटी पिन का उपयोग करें। संदंश के साथ समाप्त केवल तंत्रिका टच और squeez नहीं करतेसंयोजियों या गैन्ग्लिया ई। 5. गैन्ग्लिया Desheathing मोटर न्यूरॉन्स से 6. कोशिकी रिकॉर्डिंग 
चित्रा 2:
नोट: निम्न चरणों (2.12-4.8) सही हाथ प्रयोगकर्ताओं पर लागू होने वाली दिशात्मक निर्देश होते हैं। निम्नलिखित कदम (2.12-6.8) में यह ठंड नमक के साथ, नियमित अंतराल में हर 20-30 मिनट क्रेफ़िश खारा को बदलने के लिए स्वस्थ तंत्रिका तंत्र रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
नोट: वक्ष ganglia और जुड़े नसों आंशिक रूप से पैर मांसलता और cephalothoracic स्टर्ना द्वारा कवर कर रहे हैं। cephalothoracic स्टर्ना एक दूसरे से और उदर तंत्रिका कॉर्ड रहता है जिसमें औसत दर्जे का गुहा से चलने के पैरों के पार्श्व स्थित cavities को अलग करती है कि एक कंकाल के रूप में।
नोट: तंत्रिका कॉर्ड प्रक्रिया में क्षतिग्रस्त हो जाएगा ताकि nerv उठा से बचनेई की हड्डी कई बार।
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Representative Results
रुपये और पी एस, एक नाड़ीग्रन्थि की मोटर न्यूरॉन्स से एक साथ कोशिकी रिकॉर्डिंग के साथ, इन मोटर न्यूरॉन पूल की बारी गतिविधि, कल्पित हरकत पैटर्न का प्रतिनिधित्व करने, चित्रा (18) पर नजर रखी जा सकती है।
चित्रा 18: एक नाड़ीग्रन्थि और अंतर पिन इलेक्ट्रोड की नियुक्ति की योजनाबद्ध कोशिकी आरएस मोटर न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग (ऊपरी ट्रेस) और पी एस मोटर न्यूरॉन्स (कम ट्रेस)।।
पुनश्च 5 मोटर न्यूरॉन्स के लिए ipsilateral पीएस 2 की कोशिकी पुनश्च गतिविधि swimmeret प्रणाली (चित्रा 19A) में intersegmental समन्वय के दिलचस्प पहलुओं पर प्रकाश डाला गया।
प्रथम <, गतिविधि हमेशा A5 (चित्रा 19A, 4 वें ट्रेस) में एक पुनश्च फट के साथ शुरू होता है और उत्तेजना की लहर (पूर्वकाल दिशा में प्रसारितमजबूत> चित्रा 19A, ग्रीन लाइन)। दूसरा, प्रत्येक खंड में (अगले फट की शुरुआत के लिए एक फट के शुरू होने से मापा समय है) अवधि निरंतर (चित्रा 19A, सियान तीर) बनी हुई है। इस रूप में लंबे समय के लिए अगले एक नाड़ीग्रन्थि से सूचना प्रवाह बरकरार है और प्रयोगात्मक शर्तों को बदल नहीं है, के रूप में सच है।
विभिन्न तैयारियों में या विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के तहत उस समय और फट durations के काफी भिन्न हो सकते हैं: 0.25 की अवधि से 1 सेकंड के लिए। विभिन्न तैयारियों के बीच इन मानकों की तुलना करने के क्रम में, वे सामान्यीकृत और एक चरण हिस्टोग्राम (चित्रा 19B) में रेखांकन करने की आवश्यकता है। इस मोटर पैटर्न के तीसरे दिलचस्प पहलू यह पता चलता है: खंडों के बीच चरण-अंतराल, intersegmental देरी, निरंतर और ताल की आवृत्ति की स्वतंत्र रहता है।
एक चरण हिस्टोग्राम की गणना करने के लिए निम्न माप और गणना nece हैंssary:
सबसे पहले, एक संदर्भ का पता लगाने के लिए चुना जाना है। आमतौर पर हम एमएस में (उदाहरण के लिए, पी एस 5) एक संदर्भ के कई क्षेत्रों (चित्रा 19A) तो फिर भर में दर्ज swimmeret ताल, अवधि को मापने का एक चरण हिस्टोग्राम के लिए (समय शून्य जा रहा है) के रूप में (सबसे पीछे नाड़ीग्रन्थि के पीएस का पता लगाने का उपयोग ) एक पी एस 5 फट (0 समय की शुरुआत से ताल की, अगले पुनश्च 5 फट (चित्रा 19A, सियान तीर) .Within इस चक्र की शुरुआत करने के लिए चित्रा 19A, नारंगी बिंदीदार रेखा), एमएस में सुप्तावस्था (मापने पुनश्च अन्य गैन्ग्लिया में से प्रत्येक में फट) के पी एस 5 फट (समय 0) और प्रारंभ (फट शुरुआत, चित्रा 19A और बी, नारंगी तीर) और अंत की शुरुआत के बीच (), चित्रा 19A और बी बैंगनी तीर ऑफसेट । इसलिए चरण शुरुआत की गणना करने और प्रत्येक सुप्तावस्था समवर्ती अवधि द्वारा विभाजित हैं फट के लिए ऑफसेट करने के लिए। इन मापों सांख्यिक वी में परिणाम होगाचित्रा 19B के रूप में दिखाया 0 और 1 के बीच alues अंत में, एक चरण हिस्टोग्राम में इन मूल्यों को साजिश है।
जिसके परिणामस्वरूप चरण हिस्टोग्राम (चित्रा 19B) प्रत्येक खंड में फट पुनश्च का कर्तव्य चक्र के बारे में जानकारी शामिल हैं। और पड़ोसी क्षेत्रों के बीच 0.25 ~ की intersegmental चरण अंतराल स्पष्ट रूप से दिख रहा है।
चित्रा 19: (ए) इलेक्ट्रोड नियुक्ति और चरण हिस्टोग्राम के लिए आवश्यक पुनश्च 2. (बी) के माप और गणना करने के लिए ipsilateral पी एस 5 में से कोशिकी रिकॉर्डिंग के योजनाबद्ध। लगातार दस फटने (एन = 10) से गणना चरण हिस्टोग्राम ~ 0.25 intersegmental चरण में देरी से पता चलता है।
और अधिक उन्नत प्रयोगकर्ताओं के लिए, मोटर न्यूरॉन्स की डेन्ड्राइट से तेज microelectrodes के साथ intracellular रिकॉर्डिंग के लिए उपयोगी हो सकता है। झिल्ली क्षमताव्यक्ति की intracellularly दर्ज पुनश्च मोटर न्यूरॉन्स एक ही hemiganglion के सभी पुनश्च मोटर न्यूरॉन्स की extracellularly दर्ज की गतिविधि के साथ में चरण दोलनों (चित्रा 20, ग्रे पैनल) दिखा। वैकल्पिक रूप से, आरएस मोटर न्यूरॉन्स या interneurons उसी तरह से intracellularly दर्ज किया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया।
चित्रा 20:। इलेक्ट्रोड नियुक्ति के योजनाबद्ध एक intracellularly दर्ज पुनश्च मोटर न्यूरॉन (ऊपरी ट्रेस) की झिल्ली क्षमता extracellularly दर्ज पुनश्च गतिविधि (कम ट्रेस) के साथ चरण (ग्रे पैनल) में झूल रहे हैं।
Intracellularly दर्ज न्यूरॉन्स (interneurons या मोटर न्यूरॉन्स) की पहचान के लिए, कोशिकाओं तेज microelectrodes और योणोगिनेसिस (चर्चा देखें) का उपयोग कर भरा डाई हो सकता है। चित्रा 21 में दो intracellularly भरा डाई पी एस मोटर न्यूरॉन्स दिखाए जाते हैं। उनके उदर somataतंत्रिका एन 1 के आधार करने के पीछे स्थित हैं। लेटरल neuropil (चित्रा 21A और बी -3) के भीतर प्राथमिक neurite पूर्व से परियोजनाओं (चित्रा 21B-2) और शाखाओं; swimmeret मांसलता (चित्रा 21B-4) के लिए तंत्रिका एन 1 के पीछे शाखा के माध्यम से अक्षतंतु परियोजनाओं।
चित्रा 21: पेट नाड़ीग्रन्थि (ए) योजनाबद्ध (ख) दो intracellularly दाग पुनश्च मोटर न्यूरॉन्स।। (1) somata; (2) प्राथमिक neurites; पार्श्व neuropil में शाखाओं में बंटी (3) वृक्ष के समान; (4) तंत्रिका एन 1 के पीछे शाखा के माध्यम से परियोजना axons; बार = 100 माइक्रोन।
कम उन्नत प्रयोगकर्ताओं, या पेट नाड़ीग्रन्थि की आकृति विज्ञान का अध्ययन करना चाहते हैं, जो उन लोगों के लिए, तंत्रिका एन 1 के माध्यम से PS और आरएस मोटर न्यूरॉन पूल से backfills, एक रोचक प्रयोग कर रहे हैं। चित्रा 2 में2, रुपये और एक hemiganglion के पी एस मोटर न्यूरॉन्स क्रमशः सह 2 + (राज्यसभा) और नी 2 + आयनों (पीएस), के साथ दाग रहे थे। पुनश्च मोटर न्यूरॉन्स की somata तंत्रिका एन 1 (चित्रा 22-1) के आधार पर पीछे स्थित हैं। आरएस मोटर न्यूरॉन्स के सभी somata तंत्रिका एन 1 (चित्रा 22-2) के आधार पर पूर्वकाल स्थित हैं।
चित्रा 22: पूर्वकाल (नारंगी, सह 2 +) और पीछे (नीला, नी 2 +) तंत्रिका एन 1 की शाखा से Backfills (1) पुनश्च मोटर न्यूरॉन्स की somata;। आरएस मोटर न्यूरॉन्स की (2) somata। बार = 100 माइक्रोन।
चित्रा 3: हटाना पंजे (1) और uropods (2)। लाल लाइनों (1) और (2) में कटौती की स्थिति से संकेत मिलता है। बार = 5 सेमी।
चित्रा 4:। (ए) पशु Telson पर उदर पक्ष ऊपर टिकी है और तय हो गई है (बी) क्रेफ़िश ठंड नमक के साथ पंजा खोलने के माध्यम से exsanguinated है। बार्स = 5 सेमी।
चित्रा 5: (ए) कत्ल और चलने के पैरों के (बी) को हटाने की। लाल लाइनों में कटौती की स्थिति से संकेत मिलता है। बार्स = 1 सेमी।
चित्रा 6: (ए, बी, सी और डी) पूर्वकाल और cephalothorax के पार्श्व भागों का हटाया। पार्श्व पक्ष के साथ पेट की ई खोलना।लाल लाइनों (1), (2), (4), और (5) में कटौती की स्थिति से संकेत मिलता है। (3) पाचन ग्रंथि। लाल तीर पहले से ही खोला उदर गुहा को इंगित करें। बार्स = 1 सेमी।
चित्रा 7: (ए) नमूना चलने पैर (लाल तीर) के एक उद्घाटन के अवसर पर पकड़ा है नमूना खोला है, (ख) पृष्ठीय मांसपेशी किस्में (1) transected कर रहे हैं।। सफेद तीर sternal थाली खींच लिया है जिस दिशा में दर्शाया गया है। Sternal धमनी (2) और तंत्रिका कॉर्ड के साथ उदर गुहा (सी) अवलोकन (3)।
चित्रा 8: निश्चित पृष्ठीय मांसपेशी किस्में (1) के साथ क्रेफ़िश पेट की अनुप्रस्थ देखें और sternal धमनी (2); लाल लाइनों (3) और (4) में कटौती की स्थिति से संकेत मिलता है। बार्स= 5 मिमी।
चित्रा 9: पृष्ठीय और पेट के उदर भागों को एक दूसरे से अलग हो रहे हैं (1) रेड लाइन कट की स्थिति को इंगित करता है।। उदर तंत्रिका कॉर्ड के साथ sternal प्लेट (2); पेट (3) का हिस्सा पृष्ठीय।
चित्रा 10:।। (ए) संदंश की स्थितियां पूर्वकाल cephalothoracic स्टर्ना दूर करने के लिए (बी) लाल लाइनों (1) और (2) जहां शेष cephalothoracic स्टर्ना के बीच की मांसपेशियों में कटौती करने का संकेत मिलता है (सी) वक्ष नसों में transected रहे हैं लाल लाइनों (3) के आसपास के ऊतकों से वक्ष गैन्ग्लिया अलग करने के लिए। रेड लाइन (4) T3 और टी -4 के बीच में कटौती का संकेत है। बार्स = 5 मिमी।
चित्रा 11: (ए और बी) ए 2 में sternal थाली के देखें। तंत्रिका N1 के पीछे sternal चर्म संबंधी infolding (1) और पूर्वकाल के लिए sternal चर्म संबंधी infoldings (बी 2) दोनों साथ में कटौती के साथ ऊतक से अलग है। पृथक तंत्रिका N1 के साथ (सी) ए 2 के आसपास के क्षेत्र की उच्च बढ़ाई,। ( इसी तरह की कटौती के साथ contralateral पक्ष पर तंत्रिका एन 1 की डी) अलगाव। लाल लाइनों (2) और (3) में कटौती की स्थिति से संकेत मिलता है; (1) पूर्वकाल और sternal चर्म संबंधी infoldings पीछे; बार्स = 5 मिमी।
चित्रा 12: (ए और बी) ए 6 ऊतक से अलग है और तंत्रिका कॉर्ड ए 6 की नसों में उठाया जा सकता है (सी)। (डी) पृथक तंत्रिका कॉर्ड स्पष्ट Sylgard के साथ लाइन में खड़ा एक पेट्री डिश में स्थानांतरित कर रहा है और नमक के साथ भर दिया। लाल लाइनों में कटौती की स्थिति से संकेत मिलता है। बार्स = 5 मिमी।
चित्रा 13:। तंत्रिका कॉर्ड के पृष्ठीय और उदर पक्ष (काला लाइन) की एक नाड़ीग्रन्थि पहचान के पार्श्व दृश्य। बार = 5 मिमी
चित्रा 14:। N1 के पीछे शाखा बार = 5 मिमी से अलग है तंत्रिका के पूर्वकाल शाखा।
चित्रा 16:। रिकॉर्डिंग सेटअप की (ए) अवलोकन (बी) सामग्री और बाह्य रिकॉर्डिंग के लिए उपकरणों की जरूरत है। Electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक सी उपकरण। (1) ठंड दीपक स्रोत; (2) फैराडे पिंजरे; (3) स्टीरियो माइक्रोस्कोप; (4) एयर तालिका; (5) माइक्रोस्कोप तालिका; (6) दर्पण; (7) अंतर पिन इलेक्ट्रोड; (8) सिरिंज पेट्रोलियम के साथ भराजेली; (9) क्ले मॉडलिंग; (10) संदंश; (11) तरल अपशिष्ट निपटान; (12) अंकरूपक; (13) कोशिकी एम्पलीफायर; (14) कंप्यूटर, रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर और निगरानी के साथ सुसज्जित है।
चित्रा 17: (ए और बी) (1) और संदर्भ (2) पिन इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग की स्थिति। (सी और डी) एन 1 रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के चारों ओर मोड़ है तंत्रिका के पीछे शाखा। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की ई आधार (4) पेट्रोलियम जेली के साथ अलग है। एफ पूरी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड स्नान समाधान से पेट्रोलियम जेली के साथ अलग है। पेट्रोलियम जेली से भर (3) सिरिंज। बार्स = 2 मिमी।
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Discussion
क्रेफ़िश की शारीरिक रचना और उनके पेट गैन्ग्लिया पहले से 5, 18, 19, 20 में वर्णित किया गया है और यह महत्वपूर्ण नसों के काटने से बचने के लिए विच्छेदन करने से पहले उनके साथ परिचित बनने के लिए सिफारिश की है।
यह अलग तंत्रिका कॉर्ड की गिरावट को रोकने के लिए 23 डिग्री सेल्सियस नीचे तापमान पर तैयारी रखने के लिए महत्वपूर्ण है। इस स्नान समाधान ठंड क्रेफ़िश खारा के साथ हर 20-30 मिनट के प्रतिस्थापन के द्वारा आसानी से हासिल किया जा सकता है। इन परिस्थितियों में गैन्ग्लिया की श्रृंखला के लिए 12 घंटे के लिए electrophysiological प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
कभी कभी swimmeret मोटर न्यूरॉन्स निष्क्रिय हैं और कोई सहज फोड़ सक्रियता दिखाई। कोलीनर्जिक एगोनिस्ट carbachol इन तैयारियों में फटा गतिविधि के लिए प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ठंड क्रेफ़िश खारा में भंग, 1-3 माइक्रोन carbachol के स्नान अनुप्रयोगों swimmeret ताल 21 को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त हैं।
"ove_content> कल्पित हरकत और इस प्रणाली में दर्ज अंगों की विशेष रूप से समन्वय लयबद्ध गतिविधि और समन्वय के सेलुलर गुणों के बारे में जानकारी का एक बहुत प्रदान करते हैं। इस प्रणाली में neuronal घटकों स्थानीय microcircuits की 8-10 पहचान की है और साथ ही कर रहे हैं समन्वय नेटवर्क सेलुलर विस्तार 11,14,15 में जाना जाता है। कोशिकी रिकॉर्डिंग के साथ प्रदर्शन प्रयोगों से खींचा परिणाम है, जो पहले से ही गणितीय मॉडलों के लिए और roboticists के लिए भविष्यवाणियों अनुमति देते हैं।सभी swimmeret न्यूरॉन्स वृक्ष के समान पार्श्व neuropil भीतर शाखाओं में बंटी और intracellularly इन डेन्ड्राइट से दर्ज किया जा सकता है दिखाते हैं। चित्रा 20 में, एक पुनश्च मोटर न्यूरॉन के एक intracellular रिकॉर्डिंग दिखाया गया है। 1 एम KAC 0.1 एम KCl (35 के बीच इलेक्ट्रोड प्रतिरोध - 45 MΩ) से भरा यह एक तेज microelectrode (की खुराक देखें) के लिए पार्श्व neuropil से ऊपर रखा गया है। दोलन झिल्ली क्षमता w के रूप मेंइलेक्ट्रोड तंत्रिका एन 1 के आधार के पास डाला जाता है जब पुनश्च और रुपये मोटर न्यूरॉन्स की डेन्ड्राइट से पक्ष के spikes दर्ज किया जा सकता है।
चित्रा 21 में दिखाया गया है intracellularly व्यक्तिगत न्यूरॉन्स (जैसे, मोटर न्यूरॉन्स) दाग, तेज microelectrode इसके अतिरिक्त 1 एम KAC 0.1 एम KCl में भंग फ्लोरोसेंट रंजक (जैसे, 1% dextran टेक्सास लाल, देखने की खुराक) के साथ भरा होना चाहिए। 2 हर्ट्ज पर 250 एमएस की अवधि के साथ एक एनए के दालों के ध्रुवीकरण, योणोगिनेसिस द्वारा intracellularly मोटर न्यूरॉन्स को भरने के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए लागू कर रहे हैं। सकारात्मक आरोप लगाया रंजक दालों depolarizing और नकारात्मक आरोप लगाया रंजक लिए इस्तेमाल के लिए hyperpolarizing दालों का उपयोग करें। लंबे समय तक भरता है एक मजबूत लेबल वाले न्यूरॉन में परिणाम। दृश्य के लिए तंत्रिका कॉर्ड, निर्जलित तय हो, और 22 घुड़सवार किया जाना चाहिए।
मोटर न्यूरॉन्स की एक पूल दाग एक विधि तंत्रिका एन 1 से backfills उपयोग करने के लिए है (चित्रा 22) 4, 23। पुनश्च मोटर न्यूरॉन्स के पूल backfill के लिए तंत्रिका एन 1 के पीछे शाखा के आसपास पेट्रोलियम जेली की एक अच्छी तरह से रखें। आरएस मोटर के पूल दाग के लिए एक अच्छी तरह से तंत्रिका एन 1 के पूर्वकाल शाखा पर रखा गया है न्यूरॉन्स। कुएं में क्रेफ़िश खारा DDH 2 ओ द्वारा बदल दिया है तो अच्छी तरह से अंदर इस तंत्रिका कटौती और कमरे के तापमान पर DDH 2 ओ (आरटी) में 15 मिनट के लिए छोड़ दें। या 5% NICL 2 - - पेट्रोलियम जेली के साथ (DDH 2 हे में भंग) समाधान और करीब कुओं इसके बाद, 5% CoCl 2 के साथ या तो कुओं में DDH 2 ओ की जगह। नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 15 घंटे के लिए incubated की जरूरत है। , वेल्स ओपन डाई हटाने और नमक के साथ नमूना तीन बार कुल्ला। आरटी पर 20 मिनट के लिए हुड के नीचे, Dithiooxamid पेट्री डिश में हर 10 मिलीलीटर क्रेफ़िश खारा के लिए (100% EtOH में भंग संतृप्त समाधान) के 10 बूंदों के साथ नी 2 + या सीओ 2 + आयनों वेग। नी 2 + - आयनों नीले नी (SCH) और सह 2 + करने के वेग होगा
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Acknowledgments
हम आंकड़े से कुछ के साथ मदद करने के लिए जोस Burgert धन्यवाद। हम इंगो Selbach (और समूह "Edelkrebsprojekt NRW") प्रायोगिक पशुओं के साथ प्रयोगशाला की आपूर्ति करने के अपने प्रयासों के लिए आभारी हैं। हम पांडुलिपि के पहले संस्करण proofreading के लिए अन्ना सी श्नाइडर धन्यवाद। इस शोध एक एमी नोथेर DFG अनुदान एसएम 206 / 3-1 और महिला संकाय के लिए कोलोन विश्वविद्यालय की एक स्टार्टअप अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel extracellular amplifier: MA 102 | Amplifier | Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany | |
| air-table | Technical Manufacturing Corporation (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA |
63-534 | |
| Axon Digidata 1440A | Digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA | DD1440A |
| big bucket | |||
| Clampex & Clampfit | pClamp 10, recording and analysis software | Molecular Devices Design, Union City, CA | pClamps 10 Standard |
| cold lamp source | with flexible light guide (fiber optic bundle) | Euromex microscopes holland, Arnhem, BD | LE.5211 & LE.5235 |
| computer and monitor | equipped with recording software | ||
| container and pipette for liquid waste | |||
| crayfish saline | contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. | ||
| dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) | fluorescent dye, lysine fixable | Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | D3328 |
| dissection dish | (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone | ||
| faraday cage | |||
| fixing pins | |||
| forceps (biology, Dumont #5) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11252-20 |
| forceps (biology, Dumont #55) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11255-20 |
| forceps (electronic, Dumont #5) | Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11251-20 |
| intracellular electrode | Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament | Sutter Instruments, Novato, CA | BF100-50-10 |
| Leica S8 Apo StereoZoom | Dissection Microscope Zoom 1x - 8x | Leica, Germany | 10446298 |
| microscope table | |||
| mirror | to illuminate preparation from below | ||
| modeling clay | |||
| Olympus SZ61 | Dissection Microscope Zoom 0.67x - 4.5x | Olympus, Germany | |
| petri dish | 94 x 16 mm; lined with clear silicone | Greiner bio-one, Germany | 633180 |
| ring scissors | ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 14054-13 |
| spring scissors or alternative: Vannas spring scissors | cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 15024-10 or 15000-08 |
| student Vannas spring scissors or alternative: Moria Spring Scissors | cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 91500-09 or 15396-00 |
| sylgard | 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon | Dow Corning, Midland, MI, USA | |
| syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip |
References
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