Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kerevit ve yüzgeç Sistemi: Sinir Kordon ve Motorlu Pattern Extracellular Recordings ve Diseksiyon için Pratik Kılavuzu

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52109
Automatic Translation
1, 1, 1
1Emmy Noether Group, Institute of Zoology, University of Cologne

Abstract

Burada kerevit karın sinir kordonu diseksiyonu göstermektedir. Hazırlık son iki göğüs gangliyonları (T4, T5) ve karın ganglionlar zincirini (A6 A1) içermektedir. Yüzgeç sistemi: ganglion Bu zincir pleopods (swimmerets) koordineli lokomosyon sürücüler santral sinir sistemi (MSS) kısmını kapsamaktadır. Bu kerevit her yüzgeç ritmik alternatif aktivite 1-3 üretir kendi bağımsız desen üreten çekirdek tarafından tahrik beş yılı aşkın bir süredir bilinmektedir. motor nöronlar, her yüzgeç ve kas anatomik ve fonksiyonel olarak farklı popülasyonlar 4 iki içermektedir innerve. Bir yüzgeç geri çekilmesi (güç inme, PS) sorumludur. Diğer yüzgeç protraksiyonuna (dönüş inme, RS) sürücüler. Yüzgeç sisteminin motor nöronlar kendiliğinden in vivo olarak kaydedilen model ile aynı olan bir hayali motor modelini üretmek mümkün 1.

Bu raporun amacı, ritim üreten ağları ve öğrencilerin pratik laboratuar dersleri için bağımsız microcircuits koordinasyonu çalışmak için ilginç ve kullanışlı bir model sistemini tanıtmaktır. sağlanan protokol, ganglionlar izole zincirinin çivileme ganglionlar desheathing ve izole sinir sisteminden ekstraselüler swimmerets kurgusal motorlu desen kayıt, kerevit karın sinir kordonu diseksiyon için adım adım yönergeler içerir.

Ayrıca, biz dendritler hücre kaydedilen yüzgeç nöronların aktivitesini izleyebilirsiniz. İşte biz de kısaca bu teknikleri tanımlamak ve bazı örnekler sunmak. Ayrıca, yüzgeç nöronların morfolojisi çeşitli boyama teknikleri kullanılarak değerlendirilebilir. Burada boya dolu nöronlar ve yüzgeç motor nöron havuzları Dolgularda (iyontoforez ile) hücre içi örnekler sunmak. Bizim laboratuvardaBiz hücresel düzeyde microcircuits arasındaki kurgusal lokomosyon, MSS aktivitesine duyusal geribildirim etkisi ve koordinasyon temel fonksiyonlarını incelemek için bu hazırlık kullanın.

Introduction

kerevit swimmerets duruş kontrolünde bir işlevi yerine ve hayvanlar ileri yüzmek ritmik zaman yendi, kendi Burrows veya kadın kendi yumurta 5, 6 havalandırır havalandırın. Sinyal kerevit, Pacifastacus leniusculus ve swimmerets, beşte ikinci gelen çiftler meydana Karın 7 her tarafında bir uzuv ile karın segment. merkezi sinir sistemi hayvanda yanı sıra izole edilmiş sinir kablosu hazırlanmasında yüzgeç hareketini tahrik kendi ritmik motorlu kalıbında üretir. Duyu geri bildirim veya azalan girişi mevcut olduğunda üretilen ritmik motorlu model kurgusal lokomosyon 1, 2 denir. Yüzgeç sisteminde bu motorun model sağlam hayvan ölçülen swimmerets aktivitesi herhangi parametrede farklı değildir.

Her bir yüzgeç hareketi bulunan ve bir c sınırlı bir mikro devre ile tahrik edilirhemiganglion 1 orresponding -. 3 Her mikrodevre beş tanımlanan olmayan çivileme internöronlardan içeren bir desen üreten çekirdek vardır. Onlar işlevsel olarak karakterize edilebilir ya Güç İnme önleyici (IPS) ya da Return İnme önleyici (IRS) 8. Kendi alternatif aktivite karşılıklı inhibisyonu 9 ile tahrik edilir ziyade bu IPS ve IRS internöron, endojen osilatörler değildir. Bu internöron doğrudan yüzgeç motor nöronları inhibe Çünkü, alternatif PS-RS hareketi 10 oluşturulur. Hareket ancak, sadece, aynı zamanda farklı bağımsız microcircuits koordinasyon aktivitesi üretilmesini gerektirir, ancak değildir. Yüzgeç sisteminde bu koordinasyon uzuvlar doğru zamanlarda aktif olmasını sağlar koordine mikro devre ile kurulur. Bu mikrodevreli, her segmentteki 11-15 belirlenmiş üç nöronlar tarafından inşa edilmiştir.

Bu protokol, th sağlare ilk kez bir adım-adım diseksiyonu kılavuz ganglionlar (A6 T4, Şekil 1) zincirini izole etmek. Biz izole karın sinir kablosunu pin ve her ganglion desheathe nasıl gösterir. Bu izole edilmiş sinir sistemi hazırlanırken, yüzgeç hareketten sorumlu nöronlar elektrofizyolojik ve morfolojik deneylerinde kullanılmak üzere hazırdır. Bu protokolün ikinci bölümü yüzgeç motorlu modelinin temel özelliklerini gösterir. Bu hücre dışı kayıt için bir adım-adım kılavuzunu yüzgeç motor nöronların aktivitesini içerir. RS motor nöronların aksonları PS motor nöronların aksonları aynı sinirin posterior dalı ile (Şekil 1) proje ise, sinir N1 ön dalı ile proje 4. Bu nedenle onların faaliyet diferansiyel pim elektrotlar ile bu şubelerden kaydedilebilir.

Şekil 1,
Şekil 1: karın ganglion 6 (A6) ve T4 şematik diyagram göğüs ganglion 4 (T4) İzole sinir sistemi:. Torasik ganglion 4; T5: Torasik ganglion 5; A1, A2 ... A6 karın ganglion 1, karın ganglion 2 ... karın ganglion 6; N1: sinir N1; N2: sinir N2; N3: sinir N3; PS: Güç-inme; RS: dönüş inme. Yön kısaltmalar: A = ön; P = arka.

Bu diseksiyon prosedürü ve gösterdi elektrofizyolojik tekniği lisans öğrencileri için uygundur ve fizyoloji öğrenci uygulamalı dersler tamamlayabilir. gangliyonların izole zincir sinir sistemi işlevini, koordinasyon veya yüzgeç microcircuits 6 modülasyonunu olarak hareket yeteneği 16, 17 adaptif davranış nöronal kontrol çalışması için deneyler bir dizi kullanılmıştır. kerevit yüzgeç sistemi böylece çok büyük bir miktarını temin ilginç öğretim veya tTüm kerevit ve kurgusal motorlu modelinin dışı kayıt ventral sinir kordonu diseksiyonu ile başlayan fırsatlar yağıyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu diseksiyon prosedürü Avrupa Toplulukları Konseyi 22 Direktifi nd Eylül 2010'da (2010/63 / AB) ile uyumludur.

1. Hazırlık

  1. Boyutu ≥8 cm her iki cinsten kerevit, Pacifastacus leniusculus (Dana), edinin. Hayvanlar hayati ve karın ve karın uzuvlar sağlam olduğundan emin olun.
  2. Karapaksla incelemek için özen ve bu manikür sert ve sert olduğunu. Ön ve postmolt hayvanlar yumuşak karapaksla var çünkü birçok parametre değiştirmek deri değiştirme işlemi sırasında deneyler için uygun değildir (örneğin, lokomotor aktivite azalma).
  3. , Diseksiyon sırasında kullanılan tüm alet ve malzemeleri monte iğneleme ve sinir kordonu desheathing Şekil 2'de gösterilen ve sağlanan takviyeleri listelenen.

Şekil 2,
Şekil 2:

(1) buz dolu kova büyük; (2) kerevit tuzlu su; (3) serum dağıtıcı; (4) diseksiyonu mikroskop; (5) diseksiyonu çanak; (6) kuvvetli makas; (7) forseps (8) yaylı makas; Açık sylgard ile kaplı (9) Petri kabı; (10) sabitleme pimleri; (11) Soğuk lamba kaynağı.

2. Brüt Diseksiyon

  1. 20 dakika - 15 buz üzerinde hayvan anestezisi. Bir kan kaybı aşamasını kapsamaktadır ve numune prosedürü sırasında kerevit tuzlu su ile durulanır düzenli gerekiyor çünkü lavabonun yanında bir laboratuvar tezgah brüt diseksiyon ilk bölümünü yürütmek.
  2. Hayvan ventral yüzü yukarı tutun ve göğüs (Şekil 3-1) yakın üslerine hem pençeleri kesmek için güçlü makas kullanın. Sol ve sağ uropod (Şekil 3-2) sökün.
  3. Siyah sylgard ile kaplı diseksiyon çanak hayvan ventral tarafı yukarı yerleştirin. Elevatelson (Şekil 4A) de karın altında buz ekleyerek ve pin tarafından te Cephalothoraksın.
  4. 60 ml soğutulmuş kerevit tuzlu ~ ile tuzlu dağıtıcı doldurun. Kıskaç ağzının (Şekil 4B) ile, soğuk tuz ile kerevit serpmek. Aşırı tuzlu uropods de kesikler yoluyla tahliye olacak. Eksanginasyonunun sırasında buz ile kerevit Kapak
  5. Sadece güçlü makas (Şekil 5A) kullanarak hayvanın gözlerine posterior kesilmiş bir tek enine ile hayvan başını kesmek. Şekil 5B belirtildiği gibi baz eklemlerde yakınındaki bütün yürüyen ayakları çıkarın.
  6. Cephalothoraksın geri kalanından son göğüs kesimleri ile karın ayırın. İkinci yürüme bacak ağzına makas ucu takmadan ve karşı tarafa keserek ikinci yürüyüş bacaklar düzeyinde (göğüs segmenti 3) bir ilk kesim olun. (Şekil 6A-1).
  7. T ile her iki taraf için bu ilk kesim uzatınO (Şekil 6A-2) cephalothoraks.
  8. Iç organların bazı görünür hale getirmek için açık hayvan çevirin. Numunenin ön kısmına belirgin sindirim bezi (Şekil 6B-3) itin ve karın boşluğundan üreme organları kaldırmak için forseps kullanabilir.
  9. Cephalothoraksın (Şekil 6C) ön kısmını çıkarın. Kalan toraks (Şekil 6D-4) her iki tarafta, solungaçları kapağı karapaksla yan kısımlarını kaldırmak için yan keser kullanın. Solungaçları çıkarın ve soğuk tuzlu su ile durulayın örnek.
  10. Şekil 6E-5'te gösterildiği gibi, sternum levhanın tüm uzunluğu boyunca bir kesim ile diseksiyon devam edin. Pleuron ve swimmerets (Şekil 6E kırmızı işaretler) arasındaki maksimal yanal konumlarda bu kesim olun. Aynı kesim ile diğer tarafta devam edin. Soğuk tuzlu su ile örnek durulayın.
  11. Bir dissectio altında kalan diseksiyonu yürütmekn mikroskop. Siyah sylgard ile kaplı ve numune kapsar şekilde kerevit tuzlu su ile dolu diseksiyon çanak kerevit karın ventral tarafı yukarı yerleştirin.
    Not: Aşağıdaki adımlar (2,12-4,8) sağ elini deneyci için geçerli yönlü talimatları içerir. Aşağıdaki adımları (2,12-6,8) o, soğuk tuzlu su ile, düzenli aralıklarla her 20-30 dakikada bir kerevit tuzlu yerine sağlıklı sinir sistemi tutulması önemlidir.
  12. Posterior telson de ve öne karapaksla kalıntıları böcek pimleri ile örnek Fix. Sola telzon noktaları ve tablo kenarına paralel olacak şekilde örneği yerleştirin.
  13. Bir yürüyüş bacak açıklığı (Şekil 7A) ile yakala ve numune açık (Şekil 7B beyaz ok) çekmek için sol elinde kaba forseps kullanın. Onların ventral büyük iki dorsal fleksör kas ipliklerini (Şekil 7B-1 ve C-1) belirlenmesi ve kesimŞekil 7B'de gösterildiği gibi, baz.
  14. Dorsal (kalp) iner sternum arter (Şekil 7C-2), tanımlama ventral, 4. torakal segmentte. Ventral arter oluşturan, sinir kordonu altında projeler önce bu arter, sağ sinir kablosu (Şekil 7C-3) Yukarıdaki yatıyor.
  15. Sternum arter transect. Şekil 7C'de gösterildiği gibi, makas bir bıçak kullanarak, ilk arteri kaldırın ve ventral bulunan sinir kablosu görünür olduğunda sadece kesti.
  16. (Sağ tarafına) öne dorsal fleksör kasları Fix. Onlar vizyon bloke olmayacak şekilde bu pimleri ile maksimum gergin pozisyonda yapılmalı ve numune gergin kalır. Dorsal kas teller (Şekil 8-1), ilgili sinirler ilk karın gangliyonları, A1 ve A2, sabit zaman N1, N2, N3 ve görünür (Şekil 8) vardır.
  17. Spec kapmak için sol elinde forseps kullanınYürüme ayaklarından biri açılışında imen. Aşağıdaki diseksiyon boyunca adımlar açık örneği tutmak için yavaşça çekin.
  18. Sinir kablosu en uzak konumda sinirleri N3 transect. (Şekil 8-3).
  19. Şekil 8-4 gösterildiği gibi ventral apodeme yakın fleksör kasları kesin. Sinir kablosu veya sinirler N2 zarar vermemeye özen gösterin.
  20. Adımları 2.18 ve sinirler N3 için 2,19 ve A5 kalan karın ganglion A2 fleksör kasları tekrarlayın.
  21. Son karın ganglion anda, A6, ventral apodeme dorsal fleksör kasları kesmek ve örnek olarak Şekil 9'da gösterildiği bakmak gerekir.
  22. A6 (Şekil 9-1) sinirlere sternal plaka posterior kesin ve ventral bölümünü (Şekil 9-2) tutun. Fleksör kaslar (Şekil 9-3) ile dorsal kısmını atın. Yürüme bacak açıklıkları yoluyla pimleri ile öne sternum plaka Fix,ve posteriora A6.

3. İnce Diseksiyon

  1. Uzakta yönlendirilmiş ön kısmı ve tablolar 'kenarına doğru arka kısmı ile mikroskop altında örnek yerleştirin.
  2. Sefalotorasik göğsüne en ön kısımlarını çıkarmak için Şekil 10A'da gösterildiği gibi, forseps kullanın.
    NOT: Torasik ganglionlar ve ilişkili sinirler kısmen bacak kas ve sefalotorasik göğsüne kapsamındadır. sefalotorasik sterna birbirinden ve ventral sinir kablosu bulunduğu orta boşluğu yürüme bacak yanal olarak yer alan boşluklar ayıran bir iskelet oluşturur.
  3. Kalan exoskeletal Şekil 10B belirtildiği gibi yapıların -1 ve B2 arasındaki kasları kesin. Kapmak ve ventral sinir kordonu (Şekil 10C) ön ucunu kaldırmak için forseps kullanın.
    NOT: sinir kordonu sürecinde zarar görür, böylece NERV toplayıp önlemeke kablosu birden çok kez.
  4. Sinir kablosunu (Şekil 10C-3) kaldırırken yanal göğüs sinirleri kesin. Çivileme için uygun uzunlukta bu sinirleri tutun. Forseps ile tutuklanmıştı ganglionlar, zincirinin sıkılmış kısmını çıkarın, (Şekil 10C-4) T4 tüm doku anterior uzak keserek.
  5. Sola ön kısmı ile örnek yerleştirin ve A1 odaklanmak. Uygun uzunlukta (maks. 1 cm) onları bağlantılarını için de A1 sinirler N1 N2 ve kesin.
  6. A2 odaklanın ve sinirleri N1, N2, ve bu segmentin N3 (Şekil 11) tespit. Karın ganglion A2-A5 sinirleri N1 her segmentin (Şekil 11A-1) iki sternum cuticular infoldings arasında ikamet ve kas ile kaplıdır. Posterior sternum cuticular içe katlanması boyunca bir kesim olun. Karın yan kenarının başlayın ve Şekil 11A gösterildiği gibi orta hat doğru devam edin.
  7. Hedef N1 hala koy isedoku ile kırmızı kas demeti kesen, Şekil 11B (kırmızı ok) gösterildiği, ancak bu sefer ön sternum cuticular infoldings ve sinir N1 hem (Şekil 11B-2).
  8. Mümkün (Şekil 11C-3) gibi distalde sinir N1 kesin. Sinir N1 tamamen görünür ve anterior ve posterior dalı (Şekil 11C) tespit edilebilir.
  9. Taraf sinir N1 geçin ve ilk ganglion (Şekil 11D) yakınında, medial başlayan, arka sternum cuticular içe katlanması boyunca kasları kesti. Sinir hala dokusu ile örtülüdür ise, kas demeti kesen, ancak bu sefer ön sternum cuticular infoldings ve sinir N1 hem benzer 11B-2 Şekil. Kadar distalde mümkün olduğunca sinir N1 kesin.
  10. Uygun uzunlukta (yaklaşık. 0.5 cm) bağlantılarını için bu ganglion sinirler N2 kesin.
  11. Tekrar A3-A5 sinirler için 3,7-3,11 adımları.
  12. Ner Cutolarak distalde mümkün (Şekil 12A) olarak ganglion A6 ves. Bu ganglion kaldırın ve sternum plaka ganglionlar zincirini izole başlamak için A6 birden sinirleri kapmak için forseps kullanın.
  13. Sinir kablosu kaldırırken Şekil 12B (beyaz ok) gösterildiği gibi, ön yönde yavaşça çekin. Bireysel ganglion kaldırılır gibi, sinir kablosu (Şekil 12C), ventral tarafına tutturulabilir, ventral arter çıkarın. Sinir kordonu tamamen izole olduğu kadar bu (nazikçe) kesilmiş çekin dizisi devam edin.
  14. Açık sylgard ile kaplı ve kerevit tuzlu (Şekil 12D) ile dolu bir Petri kabı ganglionlar izole zincirini aktarın.

4. Petri Dish içine Sinir Kablosu İğneleme

NOT: Sinir kablosunu pin (takviyeleri bakınız) paslanmaz çelik tel kesilmiş küçük işaretçilerine kullanın. Forseps ile biten sadece sinir dokunun ve Squeez yokconnectives veya ganglionlar e.

  1. Yumuşak streç uygularken, düz bir çizgi olarak ganglion zincirini Pin.
  2. Yukarı bakacak şekilde sırt tarafında ile Petri kabındaki sinir kablosunu (Şekil 13, siyah çizgi) düzenleyin. ganglionlar ventral tarafı kendi konveksite tarafından tespit edilebilir; sırt tarafı düz. Kenarlarına göğüs sinirleri Pin. Uzunlamasına ekseni boyunca sinir kablosu germe, A6 sinirler ile devam edin.
  3. Sinir kablosu için 90 ° açıyla A1 sinirleri dışarı Pin.
  4. A2 geçin ve sinir kablosu (Şekil 1A) 35-45 ° göreli bir açıyla sinirler N2 pin.
  5. . Şekil 14'de gösterildiği gibi çivileme önce anterior ve posterior dalları sinirleri N1 ayırın sinir N1 arka dalı forseps bir çift ön ve diğer pick up ince forseps iki çift kullanın. Sadece en uzak ucunu almak için özensinir dallarının s. Şimdi dikkatle onları ayrı çekin.
  6. Sinir kablosu (Şekil 1A) bir 90 ° açıyla sinir N1 ön dalı Pin. Ön N1 şube ve sinir N2 arasındaki sinir N1 posterior dalı Pin.
  7. Ganglionlar A3-A5 sinirler için adımlar 4,4-4,6 tekrarlayın. Boyuna sinir kordonu streç o yanı sıra çapraz yön sabitleme yaparken.

5. gangliyonlar Desheathing

  1. Deneycinin elleri hep sallayarak önlemek için kararlı bir düzlem üzerinde dinlenirken böyle bir şekilde hazırlanmasını yerleştirin. Desheath için ganglionlar alttan sinir kablosunu aydınlatır.
  2. A5 herhangi karın ganglion A1 odaklanın. Ganglion ve sinirler N2 ve N3 (Şekil 15A kırmızı ok) arasında posterior, ganglion kılıf içinden küçük bir yan kesim yapmak için ince yaylı makas kullanın.
  3. Çok f kullanarak ganglion kılıfı Pick upŞekil 15A-1 'de belirtildiği gibi ine forseps ve bağlaçlar, yukarıda kılıf boyunca enine kesim. Sıkmak veya makas ile sinir kablosunu kesmek için özen gösterin.
  4. Hala tutarak ve forseps ganglion (Şekil 15B-2 ve -3) lateral sınırları boyunca kesmek devam ile ganglion kılıfı kaldırma. Kılıfını çıkarın. Alternatif olarak sabit, ancak sinir kablosu sıkışmayacak şekilde eklemlerin her iki tarafına da pin.
  5. Tekrar A5 tüm karın ganglion A1 için 5,2-5,4 adımları.
  6. Göğüs ganglionlar ve benzer bir şekilde ganglion A6 Desheathe. Ganglion A6 başlangıç ​​anterior ve posterior desheathe yönde devam etmek için. Ganglion zincirinin arka ucuna A6 ganglion kılıfını Pin.

Motor Nöronlar 6. Ekstraselüler Kayıtlar

  1. I gösterilen hücre dışı kayıtlar için kullanılan tüm alet ve malzemeleri birleştirinn Şekil 16B ve takviyeleri sıraladı. Kayıt kurulumu genel bir bakış Şekil 16A gösterilmiştir. Amplifikatör kayıttan önce en az 30 dakika boyunca ısınmak böylece, bu deney (Şekil 16C) kullanılan tüm elektronik ekipman başlatın. Bilgisayarı açın ve kayıt yazılımı başlatın.
  2. Mikroskop masaya ganglionlar zincirini yerleştirin ve aşağıdan aydınlatır. Ganglionlar (Şekil 17A ve B) hedef sinir ve yakın bir konumda referans elektrot yakın, ancak yan sylgard içine kayıt elektrodu yerleştirin. Kayıt elektrot (Şekil 17C) etrafında hedef sinir bükün.
  3. Elektrot ve sinir arasındaki teması sağlamak ve yan (F igure 17D) onu pin, biraz sinir gerin. Modelleme kil kullanılarak mikroskop masaya elektrot kablolarını Fix, böylece istenilen konumda kalmak.
  4. Kullanınvazelin ve (yuvarlatılmış ucu olan) bir 20 gauge iğne ile doldurulmuş şırınga (Şekil 17E-3) yıkama çözeltisine hedef sinir izole etmek. İlk kayıt elektrot etrafında sylgard bazı vazelin hafifçe sürün. Sonuç bir kayıt elektrotu (Şekil 17E-4) bulunduğu kısımda Sylgard kapsayan vazelin katmanıdır. Doğrudan bu katmanda hava kabarcıkları sinir üzerine kurulamak ve önlemek için dikkat edin.
  5. Tuzlu (Şekil 17F) yüzey seviyesine kadar her taraftan vazelin ile kayıt elektrodu Seal.
  6. Olan etkinlik izlenmelidir tüm hedef sinirler için bu işlemi tekrarlayın.
  7. Kaydetmeye başlayın. Sürekli ya da boşluk serbest edinim modu ve 5 kHz örnekleme hızı kullanın. Aşağıdaki parametrelere dışı amplifikatör ayarlayın; (sinyalini 1.000 kez güçlendirir kazanım yazılım ayarlarında bu büyütme parametresini dahil özen) 1.000 kazanmak bir2.000 Hz (yüksek kesim) 300 Hz (düşük kesim) ve da band geçiren filtre aralığı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RS ve PS, bir ganglion motor nöronların eşzamanlı dışı kayıtları ile, bu motor nöron havuzları alternatif etkinliği, kurgusal lokomosyon desen temsil (Şekil 18) izlenebilir.

Şekil 18
Şekil 18: Bir ganglion ve diferansiyel pim elektrot yerleştirme şematik Hücre dışı SC motor nöronların kayıt (üst iz) ve PS motor nöronlar (düşük iz)..

PS 5 motor nöronların ipsilateral PS 2 hücre dışı PS aktivitesi yüzgeç sistemi (Şekil 19A) içinde intersegmental koordinasyon ilginç yönlerini vurgulamaktadır.

İlk <, etkinlik her zaman A5 (Şekil 19A, 4. iz) bir PS patlama ile başlar ve uyarma dalga (ön yönünde ilerleyenstrong> Şekil 19A, yeşil hat). İkinci olarak, her segmentte (bir sonraki kaymasının başlangıcı bir kaymasının başlangıcından itibaren ölçülen zaman) süresi sabiti (Şekil 19A, mavi ok) kalır. Bu sürece sonraki bir gangliyondan bilgi akışı bozulmamış ve deneysel koşullar değişiklik yok gibi, doğrudur.

Farklı preparatlar içinde ya da farklı deneysel koşullar altında dönemleri ve patlama süreler esas değişebilir: 0.25 dönemlerinde 1 sn. Farklı hazırlıkları arasında bu parametreleri karşılaştırmak amacıyla, onlar normalleştirilmiş ve bir faz histogramı (Şekil 19B) olarak grafikle gerekir. Bu, motor desen üçüncü ilginç yönünü ortaya koymaktadır: segmentler arasındaki faz-lag, intersegmental gecikme, sabit ve ritim frekanstan bağımsız kalır.

Bir faz histogram hesaplamak için aşağıdaki ölçümler ve hesaplamalar nece vardırssary:

İlk olarak, bir referans izi seçilmelidir. Genellikle biz ms (örneğin, PS 5) referans birkaç segment (Şekil 19A) .Sonra genelinde kaydedilen yüzgeç ritim, dönemi ölçmek faz histogramı için (zaman 0 olmak) gibi (en arka ganglion PS iz kullanmak ) Bir PS 5 kaymasının (zaman = 0 başlangıcından ritim sonraki PS 5 kaymasının (Şekil 19A, mavi ok) yönelik olarak, bu döngü başlangıcında Şekil 19A, portakal noktalı çizgi), ms ​​gecikmeleri (ölçmek PS diğer ganglionlar her patlama arasında) PS 5 patlama (zaman 0) ve start (patlama başlangıçlı, Şekil 19A ve B, portakal oklar) ve sonu başlangıcı arasında (), Şekil 19A ve B menekşe oklarını ofset . Bu nedenle faz başlangıcı hesaplamak ve her latans eşzamanlı döneme göre ayrılır patlama dengelemek için. Bu ölçümler, sayısal v neden olurŞekil 19B gösterildiği gibi 0 ile 1 arasında edilen değerler Son olarak, bir faz Histogramda bu değerleri arsa.

Elde edilen faz histogramı (Şekil 19B) her segmentte patlama PS görev döngüsü hakkında bilgi içerir. Ve komşu segmentler arasında 0.25 ~ olan intersegmental faz-lag açıkça görülebilir.

Şekil 19
Şekil 19: (A) elektrot yerleştirme ve faz histogram için gerekli PS 2. (B) Ölçüler ve hesaplamalar ipsilateral PS 5 hücre dışı kayıt şematik. On ardışık patlamaları (n = 10) hesaplanan faz histogramı ~ 0.25 intersegmental faz gecikmesini gösterir.

Daha gelişmiş deneyci için, motor nöronların dendrit keskin Mikroelektronlar ile hücre içi kayıtları yararlı olabilir. membran potansiyelleribireyin hücre kaydedildi PS motor nöronların aynı hemiganglion tüm PS motor nöronların hücre dışında kaydedilen aktivitesi ile faz-içi salınımları (Şekil 20, gri paneller) gösterir. Seçenek olarak ise, RS motor nöronlar ya da internöron aynı şekilde hücre kaydedilebilir (veriler gösterilmemiştir).

Şekil 20
Şekil 20:. Elektrot yerleştirme şematik bir hücre kaydedildi PS motor nöron (üst iz) membran potansiyeli ekstraselüler kaydedilen PS aktivitesi (düşük iz) ile faz (gri paneller) olarak salınır.

Hücre kaydedilen nöronlar (internöron veya motor nöronlar) tanımlanması için, hücreler keskin Mikroelektronlar ve iyontoforez (tartışma) kullanılarak doldurulmuş boyamaktadır olabilir. Şekil 21, iki hücre dolu boyamaktadır PS motor nöronlar gösterilir. Onların ventral somataSinir N1 tabanına posterior yer almaktadır. Yanal nöropil (Şekil 21A ve B-3) kapsamında birincil akson öne projeler (Şekil 21B-2) ve dalları; yüzgeç kas (Şekil 21B-4) sinir N1 posterior dalı ile akson projeleri.

Şekil 21,
Şekil 21: Bir karın ganglion (A) şematik (B) İki hücre lekeli PS motor nöronlar.. (1) somata; (2) Birinci nevritler; Yan nöropil dallanma (3) dendritik; (4) sinir N1 posterior dalı ile projeyi aksonlar; Çubuk = 100 um.

Az gelişmiş deneyci veya karın ganglion morfolojisi incelemek isteyenler için, sinir N1 yoluyla PS ve RS motor nöron havuzlarından Dolgularda, ilginç bir egzersiz vardır. Şekil 2'de2, SC ve bir hemiganglion PS motor nöronlar, sırasıyla Co2 + (SC) ve Ni2 + iyonları (PS) ile boyandı. PS motor nöronların Somata sinir N1 (Şekil 22-1) tabanına posterior yer almaktadır. SC motor nöron tüm somata sinir N1 (Şekil 22-2) tabanına anterior bulunmaktadır.

Şekil 22,
Şekil 22: anterior (turuncu, Co 2+) ve posterior (mavi, Ni 2+) sinir N1 dalı gelen Dolgularda (1) PS motor nöronların Somata;. SC motor nöronların (2) somata. Çubuk = 100 um.

Şekil 3,
Şekil 3: Temizleme tırnakların (1) ve uropods (2). Kırmızı hatlar (1) ve (2) kesik konumlarını göstermektedir. Bar = 5 sm.


Şekil 4:. (A) Hayvan telson en ventral yüzü yukarı tutturulmuş ve sabit (B) kerevit soğuk tuzlu su ile pençe deliğinden kansızlaştırıldı edilir. Çubuklar = 5 sm.

Şekil 5,
Şekil 5 (A) Dekapitasyon ve yürüme bacakların (B) çıkarılması. Kırmızı çizgiler kesim pozisyonlarını göstermektedir. Barlar = 1 cm.

Şekil 6,
Şekil 6: (A, B, C ve D), ön ve Cephalothoraksın yanal kısımlarının çıkarılması. Yan tarafı boyunca karın E. açıldı.Kırmızı hatlar (1), (2), (4) ve (5) kesik konumlarını göstermektedir. (3) Sindirim bezi. Kırmızı oklar zaten açılmış karın boşluğuna işaret. Barlar = 1 cm.

Şekil 7,
Şekil 7 (A) örnek yürüme bacaklar (kırmızı oklar) bir açıklığa kapar numune açıkken (B), dorsal, kas şeritler (1) çapraz olarak kesilmiştir edilir.. Beyaz ok sternum plaka çekti hangi yönünü gösteriyor. Sternum arter (2) ve sinir kablosu ile karın boşluğu (C) Genel (3).

Şekil 8,
Şekil 8: Sabit dorsal kas şeritlerinin (1) ile kerevit karın Enine görünümü ve sternum arter (2); Kırmızı hatlar (3) ve (4) kesik konumlarını göstermektedir. Barlar= 5 mm olmalıdır.

Şekil 9,
Şekil 9: Sırt ve karın ventral kısımları birbirinden ayrılır (1) Kırmızı hat kesme konumunu gösterir.. Ventral sinir kablosu ile sternum plaka (2); Karın (3) bir bölümünü dorsal.

Şekil 10,
Şekil 10:.. (A) forseps Pozisyonlar ön sefalotorasik sterna kaldırmak için (B) Kırmızı çizgiler (1) ve (2) nerede kalan sefalotorasik göğsüne arasındaki kasları kesmek göstermektedir (C) göğüs sinirler de nakledilmiş olan kırmızı çizgiler (3) çevreleyen dokudan göğüs ganglionlar izole etmek. Kırmızı çizgi (4) T3 ve T4 arasındaki kesim gösterir. Çubuklar = 5 mm.


Şekil 11: (A ve B) A2 sternum plaka Görünüm. sinir N1 arka sternum cuticular içe katlanması (1) ve anterior sternal cuticular infoldings (B 2) hem de birlikte bir kesim ile dokudan izole edilmiştir. izole sinir N1 (C) A2 çevresindeki bölgenin yüksek büyütme,. ( benzer kesim ile karşı tarafta sinir N1 D) İzolasyon. Kırmızı hatları (2) ve (3) kesik pozisyonlarını gösterir; (1) ön ve sternum cuticular infoldings posterior; Çubuklar = 5 mm.

Şekil 12,
Şekil 12: (A ve B), A6 dokudan izole edilir ve sinir kablosu A6 sinirler de kaldırılabilir (° C). (D) İzole sinir kablosu açık sylgard ile kaplı bir Petri kabı aktarılır ve tuzlu su ile doldurulur. Kırmızı çizgiler kesim pozisyonlarını göstermektedir. Çubuklar = 5 mm.

Şekil 13,
Şekil 13:. Sinir kablosu dorsal ve ventral tarafında (siyah çizgi) bir ganglion tanımlanması Yanal görünümü. Bar = 5 mm

Şekil 14,
Şekil 14:. N1 arka dalı Bar = 5 mm ayrılır sinirin ön dalı.

Şekil 15
Şekil 15: bağlaçlar (kırmızı ok) kılıftan ilk küçük kesilmiş bir karın ganglion (A) Pozisyon desheathing talimatı, gangliyona lateral ve posterior yerleştirildi. Bağ yukarıdaki kılıftan sonraki kesim (1). (B) Kırmızı çizgiler (1) ve (2) ganglion yanal sınırları boyunca keser işaretlemek kırmızı çizgi ile işaretlenir. kılıf sonradan gangliyondan çekilebilir. Çubuklar = 1 mm arasındadır.

Şekil 16
Şekil 16:. Kayıt kurulumu (A) Genel (B) Malzemeler ve hücre dışı kayıtlar için gerekli araçlar. Elektrofizyolojik kayıt için gerekli C Ekipmanları. (1) Soğuk lamba kaynağı; (2) Faraday kafesi; (3) stereo mikroskop; (4) Hava-tablo; (5) mikroskop tablosu; (6) ayna; (7) diferansiyel pim elektrotlar; (8) şırınga petrol dolujöle; (9) modelleme kil; (10) forseps; (11) sıvı atık bertaraf; (12) sayısallaştırıcı; (13) hücre dışı bir amplifikatör; (14), bilgisayar, kayıt yazılımı ve monitör ile donatılmıştır.

Şekil 17
Şekil 17: (A ve B) (1) ve referans (2) pim elektrot kayıt pozisyonu. (C ve D) N1 kayıt elektrot etrafında viraj olan sinirin posterior dalı. Kayıt elektrot E. tabanı (4) vazelin ile izole edilir. F. tam kayıt elektrot banyo çözeltisinden vazelin ile izole edilir. Vazelin ile dolu (3) Şırınga. Çubuklar = 2 mm arasındadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kerevit anatomisi ve karın ganglionlar önce 5, 18, ​​19, 20 tarif edilmiştir ve önemli sinirlerin kesilmesi önlemek için diseksiyon önce onlarla aşina olmak için tavsiye edilir.

Bu izole sinir kablosu bozulmasını önlemek için 23 ° C'nin altındaki sıcaklıklarda hazırlık tutmak için kritik öneme sahiptir. Bu yıkama çözeltisine, soğuk kerevit tuzlu su ile 20-30 dk değiştirilmesiyle kolayca elde edilebilir. Bu koşullar altında, gangliyonların zincir kadar 12 saat boyunca elektrofizyolojik deneyler için kullanılabilir.

Bazen yüzgeç motor nöronları aktif değildir ve hiçbir spontan patlama aktivite gösterirler. kolinerjik agonist karbakol Bu terkiplerde patlama hareketliliğine sebep için kullanılır. Soğuk kerevit tuzlu su içinde çözülmüş, 1-3 uM karbakol banyo uygulamaları yüzgeç ritmi 21 aktif hale getirmek için yeterlidir.

"ove_content> kurgusal lokomosyon ve bu sistemde kayıtlı uzuvların özellikle koordinasyonu ritmik aktivite ve koordinasyon hücresel özellikleri hakkında birçok bilgi sağlamaktadır. Bu sistemde nöronal bileşenleri yerel microcircuits 8-10 tespit ve ayrıca edilir koordine ağ hücresel ayrıntılı 11,14,15 bilinmektedir. dışı kayıtları ile yapılan deneylerde elde edilen sonuçlar, daha önce matematiksel modeller ve roboticists için tahminler verir.

Tüm yüzgeç nöronlar dendritik Yanal neuropil içinde dallanma ve hücre bu dendritler kaydedilebilir göstermektedir. Şekil 20'de, PS motor nöronun hücre içi kayıt gösterilmiştir. 1 M KAc + 0.1 M KCl (35 arası elektrot direnci - 45 MΩ) ile dolu bu keskin mikroelektrot (takviyeleri bakınız) Yanal neuropil üstüne yerleştirilir. salınım membran potansiyelleri welektrot sinir N1 üssü yakınlarında takıldığında PS ve RS motor nöron dendritler ell sivri kaydedilebilir.

Şekil 21'de gösterildiği gibi, hücre içinde ayrı ayrı nöronlar (örn motor nöronları) leke için, keskin bir mikroelektrot ek olarak 1 M Kac + 0.1 M KCI içinde çözülmüş bir floresan boya (örneğin,% 1 dekstran Teksas Kırmızısı, bakınız ek) ile doldurulur. 2 Hz 250 ms süresi 1 nA darbeleri kutuplaştırıcı, iyontoforez ile hücre motor nöronları doldurmak için en az 10 dakika süreyle uygulanır. Pozitif yüklü boyalar bakliyat depolarizan ve negatif yüklü boyalar için kullanmak için hiperpolarizan darbeleri kullanın. Uzun dolgular güçlü etiketli nöron sonuçlanır. Görselleştirme için sinir kablosu, susuz sabit ve 22 monte edilmelidir.

Motor nöron bir havuz leke için bir yöntem, sinir N1 gelen Dolgularda kullanmaktır (Şekil 22) 4, 23. PS motor nöronların havuzu doldurmak için sinir N1 posterior dalı etrafında vazelin bir kuyu yerleştirin. SC motorun havuzu leke iyi sinir N1 ön dalı üzerine yerleştirilir nöronlar. kuyudaki kerevit tuzlu GKD 2 O. tarafından değiştirilir Sonra kuyunun içinde bu sinir kesmek ve oda sıcaklığında GKD 2 O (RT) 15 dakika bekletin. Veya% 5 NicL 2 - - vazelin ile (GKD 2 O çözünmüş) çözüm ve yakın kuyular Bundan sonra, 5% CoCl 2 biriyle kuyularda GKD 2 O değiştirin. Örnek 4 ° C'de en az 15 saat süre ile inkübe edilmesi gerekir. , Kuyu açmak için boya kaldırmak ve tuzlu su ile örneklemin 3 kez yıkayın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca başlık altında, Dithiooxamid Petri tabağına, her 10 mi kerevit tuzlu su için (% 100 EtOH içinde eritilir, doymuş solüsyon) 10 damla Ni 2+ veya Co + 2 iyonlarının çökmesi. Ni 2+ - iyonları mavi Ni (SCH) ve Co 2+ için çökelecektir

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz bazı rakamlar ile yardımcı olmak için Jos Burgert teşekkür ederiz. Biz Ingo Selbach (ve grubu "Edelkrebsprojekt NRW") deney hayvanları ile laboratuvar tedarik çabalarıyla minnettarız. Biz yazının ilk sürümlerini kontrol Anna C. Schneider teşekkür ederim. Bu araştırma Emmy Noether DFG hibe SM 206 / 3-1 ve kadın öğretim üyeleri için Köln Üniversitesi başlangıç ​​hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-channel extracellular amplifier: MA 102  Amplifier Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany
air-table Technical Manufacturing Corporation
(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA		 63-534
Axon Digidata 1440A Digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA DD1440A
big bucket 
Clampex & Clampfit pClamp 10, recording and analysis software Molecular Devices Design, Union City, CA pClamps 10 Standard
cold lamp source with flexible light guide (fiber optic bundle)  Euromex microscopes holland, Arnhem, BD LE.5211 & LE.5235
computer and monitor equipped with recording software
container and pipette for liquid waste 
crayfish saline  contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. 
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) fluorescent dye, lysine fixable Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany D3328
dissection dish  (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone
faraday cage
fixing pins
forceps (biology, Dumont #5) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11252-20
forceps (biology, Dumont #55) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11255-20
forceps (electronic, Dumont #5) Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11251-20
intracellular electrode Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament Sutter Instruments, Novato, CA BF100-50-10
Leica S8 Apo StereoZoom Dissection Microscope                       Zoom 1x - 8x Leica, Germany 10446298
microscope table
mirror to illuminate preparation from below
modeling clay
Olympus SZ61 Dissection Microscope                       Zoom 0.67x - 4.5x Olympus, Germany
petri dish  94 x 16 mm; lined with clear silicone Greiner bio-one, Germany 633180
ring scissors ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm Fine Science Tools (FST), Germany 14054-13
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm Fine Science Tools (FST), Germany 15024-10 or          15000-08
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm Fine Science Tools (FST), Germany 91500-09 or           15396-00
sylgard 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
  2. Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).
  3. Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
  4. Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
  5. Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
  6. Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
  7. Huxley, T. H. The crayfish: An introduction to the study of zoology. , MIT Press. Cambridge, MA. (1980).
  8. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
  9. Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
  10. Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
  11. Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
  12. Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
  13. Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
  14. Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
  15. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
  16. Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
  17. Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
  18. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
  19. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
  20. Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
  21. Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
  22. Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts - Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
  23. Altman, J. S., Tyrer, N. M. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. Strausfeld, N. J., Miller, T. A. , Springer. New York, NY. 373-402 (1980).

Tags

Nörobiyoloji Sayı 93 kabuklu diseksiyon hücre dışı kayıt kurgusal hareket motor nöronlar hareket
Kerevit ve yüzgeç Sistemi: Sinir Kordon ve Motorlu Pattern Extracellular Recordings ve Diseksiyon için Pratik Kılavuzu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seichter, H. A., Blumenthal, F.,… More

Seichter, H. A., Blumenthal, F., Smarandache-Wellmann, C. R. The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern. J. Vis. Exp. (93), e52109, doi:10.3791/52109 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter