Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Den Swimmeret System of kreps: A Practical Guide for Dissection av Nerve Cord og Ekstracellulære Opptak av Motor Pattern

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52109
Automatic Translation
1, 1, 1
1Emmy Noether Group, Institute of Zoology, University of Cologne

Abstract

Her demonstrerer vi disseksjon av kreps abdominal nerve ledningen. Preparatet består av de to siste thorax ganglia (T4, T5) og kjeden av mage ganglia (A1 til A6). Denne kjeden av ganglia omfatter den delen av sentralnervesystemet (CNS) som driver koordinert bevegelse av de pleopods (swimmerets): den swimmeret systemet. Det er kjent i over fem tiår som i kreps hver swimmeret er drevet av sin egen uavhengige mønster generere kernel som genererer rytmisk vekslende aktivitet 1-3. De motoriske nerveceller innervating muskulaturen hver swimmeret omfatter to anatomisk og funksjonelt atskilte populasjoner 4. Den ene er ansvarlig for tilbaketrekking (strøm slag, PS) av swimmeret. Den andre driver protraction (returslag, RS) av swimmeret. Motoriske nevroner i swimmeret systemet er i stand til å produsere spontant en fiktiv motor mønster, som er identisk med mønsteret registreres in vivo 1.

Målet med denne rapporten er å presentere en interessant og praktisk modellsystem for å studere rytmegenererende nettverk og samordning av uavhengige kretser for studentenes praktiske laboratoriekurs. Protokollen leveres inkluderer steg-for-trinn-instruksjoner for disseksjon av kreps mage nerve ledningen, låsing av isolert kjede av ganglier, desheathing ganglia og registrere swimmerets fiktiv motor mønster ekstracellulært fra den isolerte nervesystemet.

I tillegg kan vi overvåke aktiviteten til swimmeret nevroner registrert intracellulært fra dendritter. Her også vi kort beskrive disse teknikkene og gi noen eksempler. Videre kan morfologi swimmeret neuroner bli vurdert ved anvendelse av forskjellige fargingsteknikker. Her gir vi eksempler på intracellulær (etter iontoforese) dye fylt nevroner og backfills av bassenger av swimmeret motoriske nerveceller. I vår labvi bruker dette preparatet for å undersøke grunnleggende funksjoner av fiktiv bevegelse, effekten av sensorisk tilbakemelding på aktivitet i CNS, og koordinering mellom mikrokretser på et cellulært nivå.

Introduction

De swimmerets av kreps tjene en funksjon i holdning kontroll og slo rytmisk når dyrene svømme fremover, lufte hulene sine eller kvinner lufte sine egg 5, 6. De swimmerets av signalkreps, Pacifastacus leniusculus, opptrer i par fra andre til femte abdominal segment, med en lem på hver side av abdomen 7. Sentralnerve-systemet produserer i seg selv den rytmiske patter motor som driver swimmeret bevegelse i intakte dyr, så vel som i isolerte nerve ledningen preparat. Når det ikke er sensorisk feedback eller synkende innspill til stede den rytmiske motor mønster produsert kalles fiktiv locomotion 1, 2. I swimmeret system denne motoren mønsteret ikke avviker i noen parameter fra aktiviteten til swimmerets målt i den intakte dyr.

Bevegelsen av hver swimmeret blir drevet av en mikrokrets som er plassert i og begrenset til en corresponding hemiganglion 1 -. 3 I hvert mikrokrets det er et mønster generere kjerne som består av fem identifiserte ikke spiking interneuroner. De kan være funksjonelt karakteriseres som enten Inhibitor of Power Stroke (IPS) eller hemmer av Return Stroke (IRS) 8. Disse IPS og IRS interneuroner er ikke endogene oscillatorer, snarere deres vekslende aktivitet er drevet av gjensidig hemming 9. Fordi disse interneuroner hemme swimmeret motoriske nerveceller direkte, er det vekslende PS-RS bevegelse generert 10. Bevegelse vil imidlertid ikke bare krever genereringen av aktivitet, men også samordning av de forskjellige uavhengige mikrokretser. I swimmeret systemet slik samordning blir etablert av det koordinerende mikrokretsen som sikrer at lemmene er aktive ved riktig tidspunkt. Denne mikrokrets bygget av tre identifiserte nevroner i hvert segment 11-15.

Denne protokollen gir for the første gang en trinn-for-trinn-disseksjon guide for å isolere kjede av ganglia (T4 til A6, figur 1). Vi viser hvordan du fester den isolerte abdominal nerve ledningen og desheathe hver ganglion. I dette isolert nervesystemet forberedelse, nervecellene ansvarlig for swimmeret bevegelse er klare for bruk i elektrofysiologiske og morfologiske eksperimenter. Den andre delen av denne protokollen viser hovedtrekkene i den swimmeret motor mønster. Dette inkluderer en steg-for-steg guide til ekstracellulært rekord aktiviteten til swimmeret motoriske nerveceller. Aksoner av RS motor nevroner projisere gjennom fremre grenen av nerve N1, mens aksoner av PS motor nevroner projisere gjennom bakre gren av samme nerve (figur 1) 4. Derfor deres aktivitet kan registreres fra disse grenene med differensialpinne elektroder.

Figur 1
Figur 1: Isolert nervesystemet fra thorax ganglion 4 (T4) for å mage ganglion 6 (A6), og et skjematisk diagram av det T4:. Thorax ganglion 4; T5: thorax ganglion 5; A1, A2 ... A6 abdominal ganglion 1, mage ganglion 2 ... mage ganglion 6; N1: nerve N1; N2: nerve N2; N3: nerve N3; PS: power-takter; RS: retur-takter. Retnings forkortelser: A = anterior; P = posterior.

Dette disseksjon prosedyren og elektroteknikk demonstrert er praktisk for lavere grads studenter, og kan utfylle student praktiske kurs i fysiologi. Den isolerte kjede av ganglia er blitt benyttet i en rekke eksperimenter for å studere nervesystemet funksjon, koordinering, eller modulering av swimmeret mikrokretser 6 samt neuronal kontroll av adaptiv oppførsel i bevegelse 16, 17. Kreps swimmeret system tilveiebringer således en enorm mengde interessant undervisning eller tregner muligheter som alle begynner med disseksjon av ventral nerve ledningen av kreps og ekstracellulære opptak av det fiktive motor mønster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dette disseksjon prosedyren er i samsvar med europeiske fellesskap Rådsdirektiv av 22. september 2010 (2010/63 / EU).

1. Forberedelse

  1. Skaff kreps, Pacifastacus leniusculus (Dana), av begge kjønn ≥8 cm i størrelse. Sikre at dyrene er vital og magen og mage lemmer er intakt.
  2. Vær nøye med å inspisere ryggskjoldet, og at dette skjellaget er hard og stiv. Pre- og postmolt dyr har en myk ryggskjoldet og er ikke egnet for eksperimenter fordi under molting prosessen mange parametere endres (f.eks reduksjon i muskelaktivitet).
  3. Samle alle verktøy og materialer som brukes under disseksjon, låsing og desheathing av nerve ledningen vist i figur 2 og oppført i kosttilskudd som tilbys.

Figur 2
Figur 2:

(1) stor bøtte fylt med is; (2) kreps saltvann; (3) saltdispenser; (4) disseksjon mikroskop; (5) disseksjon rett; (6) sterke saks; (7) tang (8) våren saks; (9) petriskål foret med klar Sylgard; (10) festepinnene; (11) kalde lampekilde.

2. Brutto Dissection

  1. Bedøve dyret på is i 15 - 20 min. Utføre den første del av brutto disseksjon på en laboratoriebenk nær vasken siden den inneholder en blodtapping trinn og prøven må renses med jevne mellomrom med kreps saltvann under prosedyren.
  2. Holde dyr ventral side opp og bruke sterke saks til å klippe begge klørne på sine baser i nærheten thorax (figur 3-1). Fjern venstre og høyre uropod (Figur 3-2).
  3. Plasser dyret ventral side opp i disseksjon fatet foret med svart Sylgard. Elevaste cephalothorax ved å sette inn is under og pin magen på Telson (Figur 4A).
  4. Fyll saltbeholderen med ~ 60 ml kjølt kreps saltvann. Perfuse kreps med kaldt saltvann gjennom klo åpningen (Figur 4B). Overflødig saltvann vil renne av gjennom kutt på de uropods. Dekk kreps med is under exsanguination
  5. Halshogge dyret med et enkelt tverrgående kutt bare posterior til dyrets øyne benytter sterke saks (Figur 5A). Fjern alle gangbein nær bunnen leddene som vist i figur 5B.
  6. Isoler magen med den siste thorax segmenter fra resten av cephalothorax. Å gjøre et første snitt på nivå med de andre gangbein (thorax segment 3) ved å innføre spissen av saksen inn i åpningen av den andre gangbenet og skjæring til den motsatte side. (Figur 6A-1).
  7. Utvide denne første kuttet på begge sider gjennom tHan cephalothorax (figur 6A-2).
  8. Vend dyret åpen for å gjøre noen av de indre organer synlig. Skyv fremtredende fordøyelseskjertelen (Figur 6B-3) til den fremre delen av prøven og bruke pinsett for å fjerne reproduktive organer fra bukhulen.
  9. Fjern den fremre del av cephalothorax (figur 6C). Benytte tverrgående snitt for å fjerne de laterale deler av ryggskjoldet, som dekker gjellene, på begge sider av den gjenværende thorax (figur 6D-4). Fjern gjellene og skyll prøven med kaldt saltvann.
  10. Fortsett disseksjon med et snitt gjennom hele lengden av brystbenet platen som vist i figur 6E-5. Gjør dette kuttet ved maksimal lateral posisjoner mellom pleuron og swimmerets (Figur 6E røde markeringer). Fortsett på den andre siden med en samme kutt. Skyll prøven med kaldt saltvann.
  11. Gjennomføre de rester disseksjon under en dissection mikroskop. Plasser kreps mage ventral side opp i disseksjon fatet foret med svart Sylgard og fylt med kreps saltvann slik at den dekker prøven.
    MERK: Følgende trinn (02.12 til 04.08) inneholder retnings instrukser som gjelder for høyrehendte forskere. I de følgende trinnene (02.12 til 06.08) er det viktig å erstatte kreps saltvann i jevne mellomrom, hver 20-30 min med kaldt saltvann, for å holde nervesystemet sunt.
  12. Fix prøven med insekt pins posteriorly på Telson og anteriorly på restene av ryggskjoldet. Plasser prøven slik at Telson punktene til venstre og er parallelt til bordet kanten.
  13. Bruk grove tang i venstre hånd for å hente gjennom en gang etappe åpning (figur 7A) og trekk prøven åpen (figur 7B hvit pil). Identifisere de store to rygg flexor muskel tråder (Figur 7B-1 og C-1) og kutte sine ventralbasis som vist i figur 7B.
  14. Identifiser sternum arterie (figur 7C-2), som stammer fra dorsal (hjertet) til ventral, på den 4. thorax segment. Denne arterien ligger rett ovenfor nerve ledningen (figur 7C-3), før det prosjekter under nerve ledningen, forming ventral arterie.
  15. Transekt sternal arterie. Som vist i figur 7C, løft arterien først, ved hjelp av ett blad av saksen, og bare klippe når ventralt plassert nerve ledningen er synlig.
  16. Fest rygg flexor muskler anteriorly (til høyre side). Dette bør gjøres i maksimalt strukket stilling med pinner, slik at de ikke vil blokkere visjon og prøven forblir strukket. Når rygg muskel trådene er festet (figur 8-1), den første abdominale ganglia, A1 og A2, med tilhørende nerver N1, N2, N3 og er synlige (figur 8).
  17. Bruk pinsett i venstre hånd for å ta tak i specimen på en åpning av gangbein. Gjennom følgende disseksjon trinn dra forsiktig for å holde prøven åpen.
  18. Transekt nervene N3 på den fjerneste stilling fra nerve ledningen. (Figur 8-3).
  19. Skjær flexor musklene nær ventral apodeme som vist i Figur 8-4. Vær forsiktig så du ikke skader nerve ledningen eller nerver N2.
  20. Gjenta trinnene 2.18 og 2.19 for nerver N3 og flexor musklene i de resterende abdominal ganglia A2 til A5.
  21. I siste mage ganglion, A6, kutte rygg flexor muskler fra ventral apodeme og prøven bør se ut som vist i figur 9.
  22. Skjær brystbenet plate posterior til nerver av A6 (figur 9-1) og holde ventral del (figur 9-2). Kast ryggdelen med flexor muskler (Figur 9-3). Fest sternal plate anteriorly med pinner gjennom åpningene i gangbein,og posteriorly til A6.

3. Fin Dissection

  1. Plasser prøven under mikroskop med den fremre delen rettet bort og den bakre delen mot tabellene 'edge.
  2. Bruk tang som vist i figur 10A for å fjerne de fremre delene av cephalothoracic sterna.
    MERK: thorax ganglia og tilhørende nerver er delvis dekket av beinet muskulaturen og cephalothoracic sterna. Den cephalothoracic sterna danner et skjelett som skiller de sideveis beliggende hulrom av gangbein fra hverandre og fra den midtre hulrom i hvilket den ventrale nerveledningen befinner seg.
  3. Skjær musklene mellom de gjenværende exoskeletal strukturer som er angitt i figur 10B -1 og B2. Bruk pinsett til å ta tak og løfte den fremre enden av ventral nerve ledningen (Figur 10C).
    MERK: nerve ledningen vil bli skadet i prosessen så unngå å plukke opp nerve ledningen flere ganger.
  4. Skjær thorax nerver sidelengs mens du løfter nerve ledningen (Figur 10C-3). Holde disse nervene på passende lengde for låsing. Fjern det presset en del av kjeden av ganglier, som ble plukket opp med pinsett, ved å skjære bort alle vev anteriort for T4 (figur 10C-4).
  5. Plasser prøven med den fremre delen til venstre og fokusere på A1. Skjær nerver N1 og N2 av A1 på en passende lengde (maks. 1 cm) for låsing dem ut.
  6. Fokus på A2 og identifisere nervene N1, N2 og N3 i dette segmentet (Figur 11). Nervene N1 av mage ganglia A2-A5 ligge mellom to sternale cuticular infoldings i hvert segment (Figur 11A-1) og er dekket av muskulatur. Gjør ett kutt langs bakre sternal cuticular infolding. Starter på den laterale kant av abdomen og fortsette mot midtlinjen, som vist i figur 11A.
  7. Hvis målet N1 er fremdeles vikrød med vev som vist i figur 11B (rød pil), kuttet på tvers av muskelbunt, men denne gangen anterior til begge sternal cuticular infoldings og nerve N1 (figur 11B-2).
  8. Skjær nerve N1 som distalt som mulig (figur 11C-3). Nerve N1 er fullt synlig og fremre og bakre gren kan identifiseres (Figur 11C).
  9. Fortsett til kontralateral nerve N1 og først skjære musklene langs den bakre sternal cuticular infolding, starter medialt, nær ganglion (figur 11D). Hvis nerve er fortsatt dekket av vev, skjær over lukkemuskelen bunten, men denne gangen anterior til både sternale cuticular infoldings og nerve N1, tilsvarende figur 11B-2. Skjær nerve N1 som distalt som mulig.
  10. Skjær nerver N2 av dette ganglion til en passende lengde (ca. 0,5 cm) for låsing.
  11. Gjenta trinn 03.07 til 03.11 for nerver av A3-A5.
  12. Kutt nerves av ganglion A6 som distalt som mulig (figur 12A). Bruk pinsett til å ta flere nerver av A6 å løfte denne ganglion og begynne å isolere kjeden av ganglier fra sternum plate.
  13. Mens du løfter nerve ledningen ved å dra forsiktig i fremre retning som vist i figur 12B (hvit pil). Som de enkelte gangliene er løftet, fjerne ventral pulsåren som kan festes til ventral side av nerve ledningen (Figur 12C). Fortsett denne (forsiktig) Trekk snitt sekvens inntil nerve ledningen er helt isolert.
  14. Overfør isolert kjede av ganglia til en petriskål foret med klar Sylgard og fylt med kreps saltvann (figur 12D).

4. Feste den Nerve Cord inn i petriskål

MERK: Bruk små pinner kuttet fra rustfritt stål wire (se bilag) for å feste den nerve ledningen. Berøre den nerven slutter med pinsett og gjør ikke squeeze de connectives eller ganglia.

  1. Pin kjede av ganglier i en rett linje, mens søknad mild strekk.
  2. Ordne nerve ledningen i petriskål med ryggsiden vendt oppover (Figur 13, svart linje). Ventral side av gangliene kan identifiseres ved sin konveksitet; dorsal side er flat. Pin thorax nerver til sidene. Fortsett med nerver av A6, strekke nerve ledningen langs sin lengdeakse.
  3. Pin ut nerver av A1 i 90 ° vinkel i forhold til nerveledningen.
  4. Fortsett til A2 og feste den nerver N2 i en vinkel på 35-45 ° i forhold til nerveledning (figur 1A).
  5. Separer nerver N1 i sine fremre og bakre grener før låsing som vist i figur 14. Bruk to par av fin pinsett til å plukke opp med en pinsett fremre og med den andre bakre gren av nerve N1. Vær nøye med å plukke bare de mest fjerntliggende endens av nervegrener. Nå trekker dem forsiktig fra hverandre.
  6. Pin fremre gren av nerve N1 i 90 ° vinkel i forhold til nerve ledningen (figur 1A). Pin bakre gren av nerve N1 mellom fremre N1 gren og nerve N2.
  7. Gjenta trinn 4,4-4,6 for nerver av ganglier A3-A5. Mens feste nerve ledningen strekning det i lengde samt tverrgående retninger.

5. Desheathing ganglia

  1. Plasser fremstilling på en slik måte at experimenter hender alltid hviler på en stabil plan for å unngå rystelser. For å desheath de ganglia belyse nerve ledningen nedenfra.
  2. Fokusere på noen mage ganglion A1 til A5. Bruk tynne våren saks for å lage en liten lateral kutt gjennom ganglion skjede, posterior til ganglion og mellom nervene N2 og N3 (Figur 15A rød pil).
  3. Plukk opp ganglion skjede bruker svært fine pinsett og kuttet på tvers over kappen over connectives, som vist i figur 15A-1. Pass på å ikke presse eller kutte nerveledning med saksen.
  4. Fortsatt holder, og løfte ganglion slire med pinsett fortsette å klippe det sammen side grenser ganglion (Figur 15B-2 og -3). Fjerne kappen. Alternativt feste det til begge sider av connectives på en slik måte at det er løst, men nerve Ledningen er ikke presset.
  5. Gjenta trinn 05.02 til 05.04 for alle mage ganglia A1 til A5.
  6. Desheathe bryst ganglia og ganglion A6 på en lignende måte. For å desheathe A6 start anterior til ganglion og fortsette i posterior retning. Pin ganglion kappen A6 til den bakre enden av kjeden av ganglier.

6. Ekstracellulær Recordings fra motor nevroner

  1. Samle alle verktøy og materialer som brukes for ekstracellulære opptak vist in Figur 16B og oppført i kosttilskudd. En oversikt over opptaks oppsettet er vist i figur 16A. Starte alt elektronisk utstyr som brukes i dette eksperimentet (figur 16C), slik at forsterkerne kan varmes opp i minst 30 min før opptaket. Slå på datamaskinen og starte innspillingen programvare.
  2. Plasser kjede av ganglia på mikroskopbordet og belyse nedenfra. Sett opptaks elektroden i Sylgard nær målet nerve og referanseelektroden ved en posisjon i nærheten, men lateralt for ganglia (Figur 17A og B). Bøy målet nerve rundt innspillingen elektrode (Figur 17C).
  3. Strekke nerve litt, for å sikre kontakt mellom elektroden og nerve og feste det til side (F igur 17D). Fix elektrode kablene til mikroskop tabellen bruker modelleire, så de holder seg i ønsket posisjon.
  4. Bruk ensprøyte fylt med vaselin og en 20 gauge nål (med avrundet tupp) (figur 17E-3) for å isolere målet nerve fra bade løsning. Første DAB litt vaselin på Sylgard rundt innspillingen elektroden. Resultatet er et lag av vaselin dekker Sylgard i nærhet av opptakselektrode (figur 17E-4). Pass på å ikke direkte DAB på nerve og unngå luftbobler i dette laget.
  5. Forsegl opptakselektrode med vaselin fra alle sider opp til overflatenivået av saltvann (figur 17F).
  6. Gjenta denne prosedyren for alle målgrupper nerver hvis virksomhet bør overvåkes.
  7. Starte innspillingen. Bruk en kontinuerlig eller gap gratis oppkjøpsmodus og en samplingsfrekvens på 5 kHz. Still ekstracellulære forsterkeren til de følgende parametre; få til 1000 (forsterker signalet 1000 ganger, ta vare å inkludere denne forsterkningen parameter i oppkjøpet programvareinnstillinger) enda båndpassfilter utvalg på 300 Hz (low cut) til 2000 Hz (høy cut).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med samtidige ekstracellulære opptak fra RS og PS, motoriske nerveceller av en ganglion, vekslende aktiviteten til disse motor nevroner bassenger, kan overvåkes (Figur 18), som representerer det fiktive locomotion mønster.

Figur 18
Figur 18: Skjematisk av en ganglion og plassering av differensial pin elektrode Ekstracellulær opptak av RS motor nevroner (øvre spor) og PS motor nevroner (lavere trace)..

Den ekstracellulære PS aktiviteten til ipsilaterale PS 2 til PS fem motoriske nevroner hever interessante aspekter av intersegmental koordinering i swimmeret system (figur 19A).

Først aktiviteten starter alltid med en PS briste i A5 (figur 19A, 4. spor) og eksitasjon bølgen forplanter seg i fremre retning (<strong> Figur 19A, grønn linje). For det andre perioden (som er den tid måles fra begynnelsen av en burst til utbruddet av det neste burst) i hvert segment er konstant (figur 19A, cyan pil). Dette er sant, så lenge informasjonsflyten fra en ganglion til neste er intakt og de eksperimentelle forholdene ikke endres.

I ulike preparater eller ved ulike eksperimentelle forhold periodene og brast varighet kan variere betydelig: fra perioder på 0,25 til 1 sek. For å kunne sammenligne disse parametrene mellom ulike preparater, de trenger å bli normalisert og grafisk i en fase histogram (Figur 19B). Dette viser den tredje interessant aspekt av motoren mønster: en faseforsinkelse mellom segmentene, er intersegmental forsinkelse, forblir konstant og uavhengig av frekvensen av den rytme.

For å beregne en fase histogram, følgende målinger og beregninger er nøssary:

Først har en referanse spor å bli valgt. Vanligvis vi bruke PS spor av den mest posterior ganglion (f.eks PS 5) som en referanse (som tid 0) for en fase histogram av swimmeret rytme registrert over flere segmenter (Figur 19A) .Deretter, måle perioden (i ms ) av rytmen fra begynnelsen av en PS-5 burst (tid 0, Figur 19A, oransje stiplet linje) til begynnelsen av den neste PS 5 burst (figur 19A, cyan pil) .Within denne syklusen, måle ventetider (i ms ) mellom starten av PS 5 burst (tid 0) og starten (burst utbruddet, Figur 19A og B, oransje piler) og enden (offset figur 19A og B, fiolette piler) av PS sprenges i hver av de andre ganglia . Derfor for å beregne fase utbruddet og forskyvningen for hver sprekke ventetider er delt av den samtidige perioden. Disse målingene vil resultere i numerisk values ​​mellom 0 og 1. Endelig plotte disse verdiene i en fase histogram som vist i figur 19B.

Den resulterende fase histogram (Figur 19B) inneholder informasjon om driftssyklus på PS sprakk i hvert segment. Og intersegmental faseforskyvning på ~ 0,25 mellom nabosegmenter er godt synlig.

Figur 19
Figur 19: (A) Skjematisk fremstilling av elektrodeplassering og ekstracellulære opptak av ipsilateral PS 5 til PS 2. (B) Målinger og beregninger som trengs for fase histogram. Fase histogram beregnet fra ti påfølgende skurer (n = 10) viser intersegmental faseforsinkelse på ~ 0,25.

For mer avanserte forskere, kan intracellulære innspillinger med skarpe microelectrodes fra dendritter av motoriske nerveceller være nyttig. Membranpotensialerav individuelle intracellulært innspilte PS motoriske nerveceller viser i-fase svingninger med ekstracellulært registrert aktivitet av alle PS motoriske nerveceller i samme hemiganglion (Figur 20, grå paneler). Alternativt kan RS motoriske nerveceller eller interneuroner bli registrert intracellulært på samme måte (data ikke vist).

Figur 20
Figur 20:. Skjematisk av elektrodeplasseringen Membranen potensialet i ett intracellulært registrert PS motor nevron (øvre spor) svinger i fase (grå paneler) med ekstracellulært registrert PS aktivitet (nedre spor).

For identifikasjon av intracellulært innspilte nevroner (interneuroner eller motoriske nevroner), kan cellene være fargestoff fylt bruker skarpe mikroelektroder og iontoforese (se diskusjon). I Figur 21, to intracellulært fargestoff fylt PS motor nevroner vises. Deres ventral somataer plassert posterior til bunnen av nerven N1. De primære neurite prosjekter anteriort (Figur 21B-2) og grener innenfor Lateral Neuropil (figur 21A og B-3); axon prosjekter gjennom bakre gren av nerve N1 til swimmeret muskulatur (Figur 21B-4).

Figur 21
Figur 21: (A) Skjematisk av en abdominal ganglion (B) To intracellulært farget PS motoriske nerveceller.. (1) somata; (2) primære neurites; (3) dendrittisk forgrening i side neuropil; (4) axoner prosjektet gjennom den bakre gren av nerve N1; Bar = 100 mikrometer.

For mindre avanserte forskere, eller de som ønsker å studere morfologi av mage ganglion, backfills fra PS og RS motoriske nervecellen bassenger via nerve N1, er en interessant øvelse. I figur 22, RS og PS motoriske nerveceller i ett hemiganglion ble farget med Co 2+ (RS) og Ni 2 + ioner (PS), henholdsvis. Somata av PS motoriske neuroner er plassert posterior til bunnen av nerve N1 (figur 22-1). Alle somata av RS motoriske neuroner er lokalisert anteriort til bunnen av nerven N1 (figur 22-2).

Figur 22
Figur 22: Backfills fra anterior (oransje, Co 2+) og bakre (blå, Ni 2+) gren av nerve N1 (1) somata av PS motoriske nerveceller;. (2) somata av RS motoriske nerveceller. Bar = 100 mikrometer.

Figur 3
Figur 3: Fjerning klørne (1) og uropods (2). Røde linjer (1) og (2) viser posisjonene til kutt. Bar = 5 cm.


Figur 4:. (A) Dyret er festet ventral side opp og fikset på Telson (B) Kreps er tappet for blod gjennom klo åpning med kaldt saltvann. Barer = 5 cm.

Figur 5
Figur 5: (A) halshugging, og (B) fjerning av gangbein. Røde linjer viser posisjonene til kutt. Streker = 1 cm.

Figur 6
Figur 6: (A, B, C og D) fjerning av det fremre og laterale deler av cephalothorax. E. Åpning av buken langs den laterale side.Røde linjer (1), (2), (4) og (5) indikerer posisjoner av kutt. (3) Fordøyelseskjertelen. Røde pilene peker til den allerede åpnet bukhulen. Streker = 1 cm.

Figur 7
Figur 7: (A) Prøven blir fanget på en åpning av gangbein (røde piler) (B) Den dorsale muskel trådene (1) er transektert mens prøven er åpnet.. Hvite pilen viser den retning i hvilken den sternum platen er trukket. (C) Oversikt over bukhulen med brystbenet arterie (2) og nerveledning (3).

Figur 8
Figur 8: Tverrgående visning av kreps magen med fast ryggmuskel tråder (1) og sternal arterie (2); Røde linjer (3) og (4) viser posisjonene til kutt. Barer= 5 mm.

Figur 9
Figur 9: Dorsal og ventrale deler av buken er adskilt fra hverandre (1) Red linje angir stillingen av kuttet.. Sternal plate (2) med ventral nerve ledningen; dorsal del av abdomen (3).

Figur 10
Figur 10:.. (A) Posisjoner av pinsett for å fjerne den fremre cephalothoracic sterna (B) Røde linjer (1) og (2) indikerer hvor du skal kutte musklene mellom de resterende cephalothoracic sterna (C) De thorax nerver er transektert på de røde linjer (3) for å isolere den torakale ganglia fra det omgivende vev. Rød linje (4) viser kutt mellom T3 og T4. Barer = 5 mm.


Figur 11: (A og B) Utsikt over sternum plate på A2. Nerven N1 er isolert fra vev med et snitt langs den bakre sternum cuticular infolding (1) og anterior til begge sternal cuticular infoldings (B-2). (C) Høyere forstørrelse av området rundt A2, med det isolerte nerve N1. ( D) Isolasjon av nerve N1 på motsatt side med tilsvarende kutt. Røde linjer (2) og (3) indikerer posisjoner av kutt; (1) anterior og posterior sternale cuticular infoldings; Barer = 5 mm.

Figur 12
Figur 12: (A og B) A6 er isolert fra vevet, og nerven ledningen kan løftes på nervene A6 (C). (D) Isolert nerve ledningen er overført til en petriskål foret med klar Sylgard og fylt med saltvann. Røde linjer viser posisjonene til kutt. Barer = 5 mm.

Figur 13
Figur 13: Lateral visning av en ganglion Identifikasjon av dorsal og ventral side (svart linje) av nerveledningen.. Bar = 5 mm

Figur 14
Figur 14: Den fremre gren av den nerven N1 er skilt fra den bakre gren Bar = 5 mm..

Figur 15
Figur 15: Veiledning for desheathing av en abdominal ganglion (A) Plassering av første lille kutt gjennom kappe av de connectives (rød pil) som er lagt lateral og posterior til ganglion. Den påfølgende kutt gjennom skjede over binde er preget av den røde linjen (1). (B) Røde linjer (1) og (2) markere kutt langs side grenser ganglion. Skjede kan etterpå bli trukket fra ganglion. Streker = 1 mm.

Figur 16
Figur 16:. (A) Oversikt over opptak oppsett (b) materialer og verktøy som trengs for ekstracellulære opptak. C. Utstyr nødvendig for elektrofysiologisk registrering. (1) kaldt lampe kilde; (2) Faraday-bur; (3) stereo mikroskop; (4) luft-bordet; (5) mikroskop bordet; (6) speil; (7) differensial pin elektroder; (8) sprøyte fylt med petroleumgelé; (9) modelleringsleire; (10) tang; (11) flytende avfallshåndtering; (12) digitaliserer; (13) ekstracellulære forsterker; Datamaskin (14), som er utstyrt med innspillingen programvare og skjerm.

Figur 17
Figur 17: (A og B) Plassering av opptak (1) og referanse (2) pin elektrode. (C og D) Den bakre gren av nerven N1 er bøyes rundt opptakselektrode. E. Bunnen (4) av opptaks elektroden er isolert med vaselin. F. Den fullstendige opptak elektroden er isolert med vaselin fra badoppløsningen. (3) sprøyte fylt med vaselin. Barer = 2 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anatomi av kreps og deres mage ganglia har blitt beskrevet tidligere 5, 18, ​​19, 20 og det anbefales å bli kjent med dem før disseksjonen for å unngå skjæring av viktige nerver.

Det er kritisk å holde preparatet ved temperaturer under 23 ° C for å hindre nedbrytning av det isolerte nerveledning. Dette kan oppnås enkelt ved utskifting av badeløsningen hver 20-30 min med kaldt saltvann kreps. Under disse omstendigheter kjeden av gangliene kan brukes til elektrofysiologiske eksperimenter for opp til 12 timer.

Noen ganger swimmeret motor nevroner er inaktive og viser ingen spontan sprengning aktivitet. Den kolinerg agonist karbakol blir brukt til å indusere sprekker aktivitet i disse preparatene. Oppløst i kald kreps saltvann, bad anvendelser av 1-3 mikrometer carbachol er tilstrekkelig for å aktivere swimmeret rytme 21.

ove_content "> Den fiktive locomotion og spesielt samordning av lemmer registrert i dette systemet gir mye informasjon om de cellulære egenskapene til rytmisk aktivitet og koordinering. I dette systemet de nevronale komponenter 8-10 av de lokale mikrokretser er identifisert og i tillegg den koordinere nettverket er kjent i mobilnettet detalj 11,14,15. De trukket fra eksperimenter utført med ekstracellulære opptak resultater, la allerede spådommer for matematiske modeller og for roboticists.

Alle swimmeret nevroner viser dendrittiske forgrening innen Lateral Neuropil og kan intracellulært registrert fra disse dendritter. I figur 20, er en intracellulær innspilling av en PS motor nevron vist. For dette en skarp microelectrode (se bilag) fylt med 1 M KAc + 0,1 M KCl (elektrodemotstanden mellom 35 - 45 Megohm) er plassert over side Neuropil. Oscillerende membran potensialene som well toppene fra dendritter av PS og RS motoriske nerveceller kan tas opp når elektroden settes inn nær bunnen av nerve N1.

For å farge de enkelte neuroner (f.eks motoriske nevroner) intracellulært, som vist i figur 21, må den skarpe microelectrode tillegg bli fylt med fluorescerende fargestoff (f.eks, 1% dekstran Texas Red, se bilag) oppløst i 1 M KAc + 0,1 M KCl. Å fylle motor nevroner intracellulært av iontoforese, polariserende pulser av en nA med en varighet på 250 ms ved 2 Hz er brukt i minst 10 min. For positivt ladede fargestoffer bruke depolariserende pulser og for negativt ladet fargestoffer bruke hyperpolariserer pulser. Lengre fills resultere i en sterkere merket nevron. For visualisering nerve ledningen må fikses, dehydrert, og montert 22.

En metode for å farge en pool av motoriske nerveceller er å bruke backfills fra nerve N1 (Figur 22) 4, 23. Plasser en brønn med vaselin rundt bakre gren av nerve N1 å etterfylle bassenget i PS motoriske nerveceller. For å farge pool av RS motoriske nevroner en brønn er plassert på den fremre gren av nerve N1. Kreps saltvann i brønnen er erstattet av DDH 2 O. Deretter kuttet denne nerve inne i godt og la det stå i 15 minutter i DDH 2 O ved romtemperatur (RT). Deretter erstatte DDH 2 O i brønnene med enten 5% CoCl 2 - eller 5% NiCl2 - løsning (oppløst i DDH 2 O) og nære brønner med vaselin. Prøven må inkuberes i minst 15 timer ved 4 ° C. Åpne brønnene, fjerne fargestoff og skyll prøven tre ganger med saltvann. Utfelling av Ni 2+ 2 + eller Co-ioner med 10 dråper Dithiooxamid (mettet oppløsning oppløst i 100% EtOH) for hver 10 ml kreps saltvann i petriskål, under panseret i 20 min ved RT. Ni 2+ - ioner vil utløse til blå Ni (SCH) og Co 2+

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Jos Burgert for å hjelpe med noen av tallene. Vi er takknemlige for Ingo Selbach (og gruppen "Edelkrebsprojekt NRW") for sin innsats for å forsyne lab med forsøksdyr. Vi takker Anna C. Schneider for korrekturlesing første versjonene av manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av en Emmy Noether DFG stipend SM 206 / 3-1 og en oppstart stipend ved Universitetet i Köln for kvinnelige lærere.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-channel extracellular amplifier: MA 102  Amplifier Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany
air-table Technical Manufacturing Corporation
(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA		 63-534
Axon Digidata 1440A Digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA DD1440A
big bucket 
Clampex & Clampfit pClamp 10, recording and analysis software Molecular Devices Design, Union City, CA pClamps 10 Standard
cold lamp source with flexible light guide (fiber optic bundle)  Euromex microscopes holland, Arnhem, BD LE.5211 & LE.5235
computer and monitor equipped with recording software
container and pipette for liquid waste 
crayfish saline  contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. 
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) fluorescent dye, lysine fixable Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany D3328
dissection dish  (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone
faraday cage
fixing pins
forceps (biology, Dumont #5) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11252-20
forceps (biology, Dumont #55) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11255-20
forceps (electronic, Dumont #5) Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11251-20
intracellular electrode Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament Sutter Instruments, Novato, CA BF100-50-10
Leica S8 Apo StereoZoom Dissection Microscope                       Zoom 1x - 8x Leica, Germany 10446298
microscope table
mirror to illuminate preparation from below
modeling clay
Olympus SZ61 Dissection Microscope                       Zoom 0.67x - 4.5x Olympus, Germany
petri dish  94 x 16 mm; lined with clear silicone Greiner bio-one, Germany 633180
ring scissors ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm Fine Science Tools (FST), Germany 14054-13
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm Fine Science Tools (FST), Germany 15024-10 or          15000-08
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm Fine Science Tools (FST), Germany 91500-09 or           15396-00
sylgard 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
  2. Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).
  3. Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
  4. Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
  5. Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
  6. Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
  7. Huxley, T. H. The crayfish: An introduction to the study of zoology. , MIT Press. Cambridge, MA. (1980).
  8. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
  9. Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
  10. Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
  11. Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
  12. Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
  13. Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
  14. Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
  15. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
  16. Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
  17. Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
  18. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
  19. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
  20. Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
  21. Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
  22. Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts - Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
  23. Altman, J. S., Tyrer, N. M. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. Strausfeld, N. J., Miller, T. A. , Springer. New York, NY. 373-402 (1980).

Tags

Nevrobiologi krepsdyr disseksjon ekstracellulære opptak fiktiv locomotion motoriske nerveceller bevegelse
Den Swimmeret System of kreps: A Practical Guide for Dissection av Nerve Cord og Ekstracellulære Opptak av Motor Pattern
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seichter, H. A., Blumenthal, F.,… More

Seichter, H. A., Blumenthal, F., Smarandache-Wellmann, C. R. The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern. J. Vis. Exp. (93), e52109, doi:10.3791/52109 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter