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Neuroscience

O Sistema Swimmeret de lagosta: Um Guia Prático para a dissecção da medula nervosa e extracelulares Recordings do padrão motor

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52109
Automatic Translation
1, 1, 1
1Emmy Noether Group, Institute of Zoology, University of Cologne

Abstract

Aqui demonstramos a dissecção do cordão nervoso abdominal lagostim. A preparação compreende os dois últimos gânglio torácico (T4, T5) e a cadeia de gânglios abdominal (A1 a A6). Esta cadeia de gânglios inclui a parte do sistema nervoso central (SNC) que leva a locomoção coordenada dos pleópodos (pleópodes): o sistema swimmeret. Ele é conhecido por mais de cinco décadas em que lagostas cada swimmeret é impulsionado por seu próprio padrão do kernel gerando independente que gera atividade rítmica alternando 1-3. Os neurônios motores que inervam a musculatura de cada swimmeret compreendem dois anatômica e funcionalmente distintas populações 4. Uma delas é responsável pela retração (curso de potência, PS) do swimmeret. O outro impulsiona o protraction (curso de retorno, RS) da swimmeret. Os neurónios motores do sistema swimmeret são capazes de produzir espontaneamente um padrão fictício do motor, que é idêntico ao padrão gravado in vivo 1.

O objetivo deste relatório é a introdução de um sistema modelo interessante e conveniente para o estudo de redes de geração de ritmo e coordenação dos microcircuitos independentes para cursos práticos de laboratório dos alunos. O protocolo fornecido inclui instruções passo-a-passo para a dissecação de cordão nervoso abdominal do lagostim, prendendo da cadeia isolado de gânglios, desheathing gânglios e registrando o swimmerets padrão motor fictício extracelular do sistema nervoso isolado.

Além disso, podemos monitorar a atividade dos neurônios swimmeret gravadas intracelular de dendritos. Aqui também descrever brevemente essas técnicas e dar alguns exemplos. Além disso, a morfologia de neurónios swimmeret pode ser avaliada utilizando várias técnicas de coloração. Aqui nós fornecemos exemplos de intracelular (por iontoforese) Dye preenchido neurônios e aterros de pools de neurônios motores swimmeret. No nosso laboratóriousamos esta preparação para estudar as funções básicas de locomoção fictício, o efeito de retorno sensorial sobre a actividade do sistema nervoso central, e a coordenação entre microcircuitos a um nível celular.

Introduction

Os swimmerets de lagostins servem a uma função no controle da postura e bater ritmicamente quando os animais nadar para a frente, ventilar suas tocas ou fêmeas arejar seus ovos 5, 6. Os swimmerets do lagostim sinal, Pacifastacus leniusculus, ocorrem em pares do segundo para o quinto segmento abdominal, com um membro de cada lado do abdômen 7. O sistema nervoso central produz por si própria o alinhador rítmica do motor que acciona o movimento swimmeret no animal intacto, bem como na preparação de nervo isolado cabo. Quando não há feedback sensorial ou descendente de entrada presente o padrão motor rítmica é chamado locomoção fictício 1, 2. No sistema swimmeret este padrão motor não diferem em qualquer parâmetro da actividade dos pleópodes medidos no animal intacto.

O movimento de cada swimmeret é accionado por um microcircuito que está localizado dentro e restrita a um corresponding hemiganglion 1 - 3. Em cada microcircuito há um núcleo de geração de padrões que compreende cinco identificados interneurons não spiking. Eles podem ser funcionalmente caracterizada como sendo ou Inibidor de Power Stroke (IPS) ou inibidor de Retorno Curso (IRS) 8. Estes IPS e interneurônios IRS não são osciladores endógenos, em vez da sua actividade alternada é impulsionado por inibição recíproca 9. Porque estes interneurônios inibem os neurônios motores swimmeret diretamente, o movimento alternado PS-RS é gerado 10. Locomoção no entanto, não requerem apenas a geração de actividade, mas também a coordenação das diferentes microcircuitos independentes. No sistema swimmeret essa coordenação é estabelecida pelo microcircuito coordenação que assegura que os membros estão ativos em horários corretos. Este microcircuito é construído por três neurônios identificados em cada segmento 11-15.

Este protocolo prevê the primeira vez um passo-a-passo para isolar a dissecção de gânglios da cadeia (T4 para A6, Figura 1). Mostramos como fixar o cordão nervoso abdominal isolada e desheathe cada gânglio. Neste isolado de preparação do sistema nervoso, os neurônios responsáveis ​​pelo movimento swimmeret estão prontos para uso em experimentos eletrofisiológicos e morfológicos. A segunda parte deste protocolo demonstra as principais características do padrão motor swimmeret. Isto inclui um guia passo-a-passo para registro extracelular a atividade dos neurônios motores swimmeret. Os axônios dos neurônios motores RS projetar através do ramo anterior do nervo N1, enquanto axônios dos neurônios motores PS projeto por meio do ramo posterior do mesmo nervo (Figura 1) 4. Por isso a sua atividade pode ser gravado a partir destes ramos com eletrodos diferenciais pinos.

Figura 1
Figura 1: Isolado sistema nervoso de gânglio torácico 4 (T4) ao gânglio abdominal 6 (A6) e um diagrama esquemático de que T4:. Gânglio torácico 4; T5: gânglio torácico 5; A1, A2 ... A6 gânglio abdominal 1, gânglio abdominal 2 ... gânglio abdominal 6; N1: nervo N1; N2: nervo N2; N3: nervo N3; PS: power-acidente vascular cerebral; RS: return-acidente vascular cerebral. Abreviaturas direcionais: A = anterior; P = posterior.

Este procedimento de dissecção e a técnica eletrofisiológica demonstrado são convenientes para estudantes de graduação e podem complementar de estudantes de cursos práticos em fisiologia. A cadeia isolada de gânglios foi usado em uma série de experiências para estudar a função do sistema nervoso, a coordenação, ou modulação de microcircuitos swimmeret 6, bem como o controlo neuronal do comportamento adaptativo na locomoção 16, 17. O sistema de lagostas swimmeret proporciona assim uma enorme quantidade de ensino interessante ou tchovendo oportunidades que todos começam com a dissecção do cordão nervoso ventral de lagostins e gravação extracelular do padrão motor fictício.

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Protocol

Este procedimento de dissecção está em conformidade com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias do dia 22 de Setembro 2010 (2010/63 / UE).

1. Preparação

  1. Obter lagostas, Pacifastacus leniusculus (Dana), de ambos os sexos ≥8 cm de tamanho. Certifique-se de que os animais são vitais e abdome e dos membros abdominais estão intactos.
  2. Tome cuidado para inspecionar a carapaça e que esta cutícula é dura e rígida. Pré- e pós-muda animais têm uma carapaça macio e não são adequados para experiências porque durante o processo de muda mudar vários parâmetros (por exemplo, diminuição da actividade locomotora).
  3. Montar todas as ferramentas e os materiais utilizados durante a dissecção, prendendo e desheathing do cordão nervoso mostrado na Figura 2 e enumerados nos suplementos fornecidos.

Figura 2
Figura 2:

(1) balde grande cheio de gelo; (2) solução salina lagostas; (3) dispensador de solução salina; (4) microscópio de dissecação; (5) prato dissecção; (6) uma tesoura forte; (7) fórceps (8) tesoura primavera; (9) placa de Petri forradas com Sylgard claro; (10) dos pinos de fixação; (11) fonte de luz fria.

2. Dissecção Gross

  1. Anestesiar animais em gelo durante 15-20 min. Realizar a primeira parte da dissecção bruto a uma bancada de laboratório perto da pia, pois inclui uma etapa exsanguination ea amostra precisa ser lavado regularmente com lagostas salina durante o procedimento.
  2. Segure lado ventral animais e usar uma tesoura para cortar ambos os fortes garras em suas bases perto do tórax (Figura 3-1). Remover uropod esquerda e direita (Figura 3-2).
  3. Coloque o animal lado ventral-se no prato forrado com dissecção Sylgard preto. Elevate cefalotórax através da inserção de gelo por baixo e prender o abdômen no telson (Figura 4A).
  4. Encha o distribuidor de solução salina com ~ 60 ml de solução salina gelada lagostas. Perfundir lagostim com soro fisiológico frio através da abertura de garra (Figura 4B). O excesso de solução salina irá drenar através dos cortes nos uropods. Cubra lagostim com gelo durante exsanguination
  5. Decapitar o animal com um único corte transversal apenas posterior para os olhos do animal utilizando uma tesoura forte (Figura 5A). Remova todas as pernas que andam perto das articulações de base, como indicado na Figura 5B.
  6. Isolar o abdômen com os últimos segmentos torácicos a partir do resto do cefalotórax. Adicione um primeiro corte ao nível das segundas pernas de passeio (segmento torácico 3) inserindo a extremidade da tesoura para dentro da abertura da segunda perna curta e de corte para o lado oposto. (Figura 6A-1).
  7. Estender este primeiro corte para ambos os lados através de tele cefalotorácica (Figura 6A-2).
  8. Virar o animal aberto para fazer alguns dos órgãos internos visíveis. Empurrar o proeminente glândula digestivo (Figura 6B-3) para a parte anterior da amostra e usar uma pinça para remover os órgãos reprodutores a partir da cavidade abdominal.
  9. Retire a parte anterior do cefalotórax (Figura 6C). Use cortes laterais para remover as partes laterais da carapaça, que cobrem as guelras, em ambos os lados do tórax remanescente (Figura 6D-4). Retire as brânquias e enxaguar a amostra com solução salina fria.
  10. Continuar a dissecação com um corte através de todo o comprimento da placa esternal, como indicado na Figura 6E-5. Faça este corte nas posições laterais máximas entre Pleuron e swimmerets (Figura 6E marcações vermelhas). Proceder do outro lado com um mesmo corte. Lavar a amostra com solução salina fria.
  11. Realizar a dissecção restante sob uma dissection microscópio. Coloque abdômen lado ventral do lagostim-se no prato forrado com dissecção Sylgard preto e cheio de lagostas salina para que ele cobre o espécime.
    NOTA: Os passos seguintes (2,12-4,8) contêm instruções de direção que se aplicam aos experimentadores destros. Nos passos seguintes (2,12-6,8) é importante para substituir lagostas salina em intervalos regulares, a cada 20-30 min com solução salina fria, para manter o sistema nervoso saudável.
  12. Fixe a amostra com os pinos de insetos posteriormente no telson e anteriormente com os restos da carapaça. Coloque a amostra de modo a que os pontos Telson para a esquerda e é paralela à borda da mesa.
  13. Use uma pinça grossa na mão esquerda para pegar através de uma abertura perna curta (Figura 7A) e puxe o modelo open (Figura 7B seta branca). Identificar os grandes dorsais duas fibras musculares flexor (Figura 7b-1 e C-1) e cortar seu ventralbase, como mostrado na Figura 7B.
  14. Identificar a artéria esternal (Figura 7C-2), que desce a partir dorsal (coração) para ventral, no segmento torácico 4 th. Esta artéria situa-se acima do cordão nervoso (Figura 7C-3), antes de projectos no âmbito do cordão nervoso, formando a artéria ventral.
  15. Transecto artéria esternal. Como demonstrado na Figura 7C, levantar a artéria primeiro, usando uma lâmina da tesoura, e apenas cortada quando o cordão nervoso localizada ventralmente é visível.
  16. Corrigir os músculos flexores dorsal anterior (para o lado direito). Isto deve ser feito na posição máxima esticado com pinos que eles não vão bloquear a visão ea amostra permanece esticado. Quando as fibras musculares dorsal são fixadas (Figura 8-1), o primeiro gânglio abdominal, A1 e A2, com nervos associados N1, N2 e N3 são visíveis (Figura 8).
  17. Use uma pinça na mão esquerda para pegar a especificaçãoimen em uma abertura de pernas para caminhada. Durante todo o seguinte dissecção passos puxe delicadamente para manter o modelo aberto.
  18. Transecto os nervos N3 na posição mais distante do cordão nervoso. (Figura 8-3).
  19. Cortar os flexores perto do apodeme ventral, conforme mostrado na Figura 8-4. Tome cuidado para não danificar o cabo dos nervos ou o N2 nervos.
  20. Repita os passos 2.18 e 2.19 para o N3 nervos e os músculos flexores do restante gânglios abdominal A2 a A5.
  21. Na última gânglio abdominal, A6, cortar os flexores do apodeme dorsal e ventral do espécime deve ter a aparência, como mostrado na Figura 9.
  22. Corte a placa posterior do esterno para os nervos da A6 (Figura 9-1) e manter a parte ventral (Figura 9-2). Descarte a parte dorsal com músculos flexores (Figura 9-3). Fixar a placa esternal anteriormente com pinos através das aberturas das pernas de passeio,e posteriormente para A6.

3. Belas Dissection

  1. Coloque a amostra sob o microscópio com a parte anterior direcionada para fora e na parte posterior em direção da borda das mesas.
  2. Use uma pinça, como mostrado na Figura 10A para remover as partes mais anterior da esternos cefalotorácico.
    NOTA: Os gânglios torácicos e nervos associados estão parcialmente cobertas pela musculatura da perna e esternos cefalotorácico. O esternos cefalotorácico formar um esqueleto que separa as cavidades localizadas lateralmente das pernas caminhada um do outro e da cavidade medial em que o cordão nervoso ventral reside.
  3. Cortar os músculos entre as estruturas restantes exoesqueléticas conforme indicado na Figura 10B -1 e B2. Use uma pinça para agarrar e levantar a extremidade anterior do cordão nervoso ventral (Figura 10C).
    NOTA: O cabo de nervo é danificado durante o processo, para evitar pegar a NERVe cabo várias vezes.
  4. Cortar os nervos torácicos lateralmente ao levantar o nervo espinhal (Figura 10C-3). Manter estes nervos ao comprimento adequado para fixação. Retire a parte espremido da cadeia de gânglios, que foi pego com uma pinça, cortando-se todo o tecido anterior ao T4 (Figura 10C-4).
  5. Coloque a amostra com a parte anterior para a esquerda e se concentrar em A1. Corte o N1 e N2 nervos de A1 em um comprimento adequado (max. 1 cm) para fixar-los para fora.
  6. Concentre-se em A2 e identificar os nervos N1, N2, N3 e deste segmento (Figura 11). Os nervos N1 do gânglio abdominal A2-A5 residir entre dois dobramentos cuticulares esternal em cada segmento (Figura 11A-1) e são cobertos por musculatura. Faça um corte ao longo da infolding cuticular esternal posterior. Iniciar na borda lateral do abdómen e avançar no sentido da linha média como mostrado na Figura 11A.
  7. Se o N1 alvo ainda é covevermelha com o tecido, como mostrado na Figura 11B (seta vermelha), atravessam o feixe muscular, mas este tempo anterior para ambos os invaginações cuticulares esternal e o nervo N1 (Figura 11B-2).
  8. Cortar N1 nervo como distalmente quanto possível (Figura 11C-3). Nerve N1 é totalmente visível e do ramo anterior e posterior podem ser identificados (Figura 11C).
  9. Vá para a N1 nervo contralateral e primeiro corte os músculos ao longo da infolding cuticular esternal posterior, começando medial, próximo ao gânglio (Figura 11D). Se o nervo ainda é coberto por tecido, cortar transversalmente o feixe muscular, mas este tempo anterior para ambos os invaginações cuticulares esternal e o nervo N1, semelhante à Figura 11B-2. Corte o N1 nervo como distal possível.
  10. Corte o nervos N2 deste gânglio para um comprimento adequado (aprox. 0,5 centímetros) para fixação.
  11. Repita os passos 3,7-3,11 para os nervos de A3-A5.
  12. Corte o nerves de gânglio A6 como distal possível (Figura 12a). Use uma pinça para agarrar múltiplos nervos de A6 para levantar este gânglio e começar a isolar a cadeia de gânglios da placa esternal.
  13. Ao levantar o cordão nervoso, puxe-o suavemente na direção anterior, como demonstrado na Figura 12B (seta branca). Como os gânglios individuais são levantadas, remover a artéria ventral que pode ser ligado ao lado ventral do nervo espinhal (Figura 12C). Continue esta seqüência (suavemente) Puxe cortar, até o cordão nervoso está completamente isolado.
  14. Transfira a corrente isolada de gânglios de uma placa de Petri forradas com Sylgard claro e preenchido com solução salina lagostas (Figura 12D).

4. Fixar o cordão nervoso em placa de Petri

NOTA: Use pequenos pinos cortados a partir de fio de aço inoxidável (ver suplementos) para prender o cabo dos nervos. Toque apenas a terminação nervosa com a pinça e não fazer squeezum e os conectivos ou gânglios.

  1. Pin a cadeia de gânglios em uma linha reta, ao aplicar alongamento suave.
  2. Arrume o cordão nervoso na placa de Petri com o lado dorsal virada para cima (Figura 13, linha preta). O lado ventral do gânglio pode ser identificada pela sua convexidade; lado dorsal é plana. Pin os nervos torácicos para os lados. Continue com os nervos da A6, esticando o cordão nervoso ao longo do seu eixo longitudinal.
  3. Pin para os nervos de A1 em um ângulo de 90 ° em relação ao cordão nervoso.
  4. Avance para o pino A2 e N2 nervos num ângulo de 35-45 ° em relação ao cordão nervoso (Figura 1A).
  5. Separe os nervos N1 em seus ramos anterior e posterior antes de fixar como demonstrado na Figura 14. Use dois pares de uma pinça fina para pegar com um par de fórceps o anterior e com a outra o ramo posterior do nervo N1. Tome cuidado para escolher apenas o fim mais distals dos ramos nervosos. Agora puxe-os cuidadosamente separados.
  6. Pin o ramo anterior do nervo N1 a um ângulo de 90 ° relativamente ao cabo de nervo (Figura 1A). Pin o ramo posterior do nervo N1 entre o ramo N1 anterior eo nervo N2.
  7. Repita o 4,4-4,6 passos para os nervos dos gânglios A3-A5. Enquanto fixando o trecho cordão nervoso que em longitudinal, bem como as direções transversais.

5. Desheathing os gânglios

  1. Coloque a preparação de uma tal maneira que as mãos do experimentador estão sempre em repouso sobre um plano estável para evitar agitação. A fim de desheath os gânglios iluminar o cordão nervoso a partir de baixo.
  2. Concentre-se em qualquer gânglio A1 abdominal para A5. Use tesoura mola finos para fazer um pequeno corte lateral através da bainha gânglio, posterior ao gânglio e entre os nervos N2 e N3 (Figura 15A seta vermelha).
  3. Pegue a bainha gânglio usando muito ffórceps ine e cortar transversalmente através da bainha acima dos conectivos, como indicado na Figura 15A-1. Tome cuidado para não apertar ou cortar o cordão nervoso com a tesoura.
  4. Ainda segurando e levantando a bainha gânglio com uma pinça continuar a cortá-lo ao longo das bordas laterais do gânglio (Figura 15B-2 e -3). Remover a bainha. Alternativamente fixá-lo para ambos os lados dos conectores de tal modo que ele é fixado, mas o cordão nervoso não é espremido.
  5. Repita os passos de 5,2-5,4 para todos os gânglios abdominal A1 a A5.
  6. Desheathe gânglios torácica e o gânglio A6 de uma forma semelhante. A fim de desheathe A6 anterior início ao gânglio e prosseguir em direção posterior. Pin a bainha gânglio de A6 até o fim posterior da cadeia de gânglios.

6. Extracelular Recordings de Neurônios Motores

  1. Reúna todas as ferramentas e materiais utilizados para gravações extracelulares mostrados in Figura 16B e listados nos suplementos. Uma visão geral sobre a configuração de gravação é mostrado na Figura 16A. Comece todos os equipamentos eletrônicos utilizados neste experimento (Figura 16C), para que os amplificadores podem aquecer-se durante pelo menos 30 minutos antes da gravação. Ligue o computador e iniciar o software de gravação.
  2. Coloque a cadeia de gânglios na mesa de microscópio e iluminar a partir de baixo. Insira o eletrodo de registro no Sylgard próximo ao nervo alvo e o eletrodo de referência em uma posição próxima, mas lateral à gânglios (Figura 17A e B). Dobre o nervo alvo em torno do eletrodo de registro (Figura 17C).
  3. Esticar o nervo ligeiramente, para garantir o contato entre o eletrodo e do nervo e fixá-lo para o lado (F igura 17D). Fixe os cabos de força para a tabela de microscópio utilizando massa de modelar, para que fiquem na posição desejada.
  4. Use umcheia com geleia de petróleo e uma agulha de calibre 20 (com ponta arredondada) (Figura 17E-3) para isolar o nervo alvo a partir da solução do banho. Primeiro dab alguns vaselina na Sylgard em torno do eletrodo de registro. O resultado é uma camada de geleia de petróleo cobrindo o Sylgard na proximidade do eléctrodo de registo (Figura 17E-4). Tome cuidado para não bata diretamente no nervo e evitar bolhas de ar nesta camada.
  5. Fecha-se o eléctrodo de registo com geleia de petróleo a partir de todos os lados, até ao nível da superfície da solução salina (Figura 17F).
  6. Repita esse procedimento para todos os nervos alvo cuja actividade deve ser monitorado.
  7. Iniciar a gravação. Use um modo de aquisição livre contínua ou lacuna e uma taxa de amostragem de 5 kHz. Defina o amplificador extracelular com os seguintes parâmetros; ganhar para 1.000 (amplifica o sinal de 1.000 vezes, ter o cuidado de incluir esse parâmetro amplificação nas configurações do software de aquisição) umada faixa de filtro de banda de 300 Hz (baixo) a 2.000 Hz (alta corte).

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Representative Results

Com as gravações extracelulares simultâneas de RS e PS, os neurônios motores de um gânglio, a atividade alternada dessas piscinas do neurônio motor, podem ser monitorados (Figura 18), o que representa o padrão de locomoção fictício.

Figura 18
Figura 18: Esquema de um gânglio e colocação de eletrodos diferencial pin gravação Extracelular de RS neurônios motores (traço superior) e neurônios motores PS (menor traço)..

A atividade PS extracelular do PS ipsilateral 2 a 5 PS neurônios motores destaca aspectos interessantes da coordenação intersegmental no sistema swimmeret (Figura 19a).

Em primeiro lugar, a actividade começa sempre com uma explosão PS em A5 (Figura 19A, 4 th traço) e a onda de excitação se propaga no sentido anterior (<strong> Figura 19A, linha verde). Em segundo lugar, o período (que é o tempo medido desde o início de uma rajada para o início da próxima rajada) em cada segmento mantém-se constante (Figura 19A, ciano seta). Isto é verdade, enquanto o fluxo de informação a partir de um gânglio para o próximo está intacta e as condições experimentais não mudam.

Em diferentes preparações ou sob diferentes condições experimentais e os períodos de duração de ruptura pode variar substancialmente: a partir de períodos de 0,25 a 1 seg. A fim de comparar estes parâmetros entre diferentes preparações, eles precisam ser normalizados e representados graficamente em um histograma de fase (Figura 19b). Isto revela o terceiro aspecto interessante do padrão motor: o atraso de fase entre segmentos, o atraso intersegmental, permanece constante e independente da frequência do ritmo.

Para calcular um histograma fase, as seguintes medidas e cálculos são necessary:

Em primeiro lugar, um traço de referência tem de ser escolhido. Normalmente usamos o traço PS do gânglio mais posterior (por exemplo, PS 5) como referência (sendo tempo 0) para um histograma fase do ritmo swimmeret gravado em vários segmentos (Figura 19A) .Em seguida, meça o período (em ms ) do ritmo a partir do início de um PS 5 rebentamento (tempo 0, Figura 19A, laranja linha pontilhada) para o início da próxima rajada PS 5 (Figura 19A, seta ciano) .Within este ciclo, medir as latências (em ms ) entre o início da rajada PS 5 (tempo 0) e o início (início explosão, Figura 19A e B, setas laranja) e final (offset Figura 19A e B, setas violeta) do PS explosão em cada um dos outros gânglios . Por conseguinte, para calcular a fase de início e de desvio para cada rajada as latências são divididas pelo período simultâneo. Estas medidas irão resultar em v numéricoalores entre 0 e 1. Finalmente, traçar esses valores de histograma, como se mostra na Figura 19B.

O histograma fase resultante (Figura 19b) contém informações sobre o ciclo de trabalho do PS estourar em cada segmento. E a fase de lag intersegmental de ~ 0,25 entre os segmentos vizinhos é claramente visível.

Figura 19
Figura 19: (A) Esquema da colocação do eléctrodo de registo e extracelular de PS ipsilateral 5 a PS 2. (B) Medições e cálculos necessários para o histograma de fase. O histograma de fase calculados a partir de dez rajadas consecutivas (n = 10) mostra o atraso de fase intersegmental de ~ 0,25.

Para mais experimentadores avançados, gravações intracelulares, com microeletrodos afiadas das dendrites dos neurónios motores pode ser útil. Os potenciais de membranado indivíduo intracelularmente gravados neurónios motores PS mostram oscilações em fase com a actividade extracelularmente gravado de todos os neurónios motores PS da mesma hemiganglion (Figura 20, painéis de cinzento). Em alternativa, neurónios motores ou RS interneurónios intracelularmente podem ser gravados na mesma forma (dados não apresentados).

Figura 20
Figura 20:. Esquemática da colocação de eletrodos O potencial de membrana de um neurônio motor intracelular gravado PS (traço superior) oscila em fase (painéis de cinza) com a atividade PS extracelular gravada (traço inferior).

Para a identificação dos neurônios intracelularmente gravados (interneurônios ou neurônios motores), as células podem ser preenchidas usando corante microeletrodos afiados e iontoforese (ver discussão). Na Figura 21, dois intracelularmente corante cheias neurónios motores PS são mostrados. Sua somata ventrallocalizam-se posteriormente para a base do nervo N1. Os projetos neurite primário anterior (Figura 21B-2) e sucursais na lateral Neurópilo (Figura 21A e B-3); os projetos de axônios através do ramo posterior do nervo N1 para a musculatura swimmeret (Figura 21B-4).

Figura 21
Figura 21: (A) Esquema de um gânglio abdominal (B) Dois intracelularmente coradas neurónios motores PS.. (1) somata; (2) neurites primárias; (3) ramificação dendrítica na neur�ilo lateral; (4) axônios projeto através do ramo posterior do nervo N1; Barra = 100 um.

Por menos experimentadores avançados, ou aqueles que querem estudar a morfologia do gânglio abdominal, backfills dos PS e RS motoras piscinas neurônio através do nervo N1, são um exercício interessante. Na Figura 22, o RS e PS neurônios motores de um hemiganglion foram coradas com Co 2+ (RS) e íons Ni 2+ (PS), respectivamente. Somata do PS neurônios motores estão localizados posterior à base da N1 nervo (Figura 22-1). Todos somata de RS neurônios motores estão localizados anterior para a base do nervo N1 (Figura 22-2).

Figura 22
Figura 22: backfills do anterior (laranja, Co 2+) e posterior (azul, Ni 2+) ramo do nervo N1 (1) Somata do PS neurônios motores;. (2) somata de neurónios motores RS. Barra = 100 um.

Figura 3
Figura 3: Remoção das garras (1) e urópodos (2). As linhas vermelhas (1) e (2) indicam posições de cortes. Barra = 5 cm.


Figura 4:. (A) O animal é preso lado ventral e fixado no telson (B) O lagostim é sangrados através da abertura de garra com soro fisiológico frio. Bares = 5 cm.

Figura 5
Figura 5: (A) decapitação e (B) a remoção de pés de passeio. As linhas vermelhas indicam as posições dos cortes. Bares = 1 cm.

Figura 6
Figura 6: (A, B, C e D) A remoção do anterior e as partes laterais da cefalotòrax. E. Abertura do abdômen ao longo do lado lateral.As linhas vermelhas (1), (2), (4) e (5) indicam as posições dos cortes. (3) glândula digestiva. As setas vermelhas apontam para a cavidade abdominal já aberto. Bares = 1 cm.

Figura 7
Figura 7: (A) O espécime é agarrado a uma abertura das pernas de passeio (setas vermelhas) vertentes (B) O músculo dorsal (1) são seccionadas, enquanto a amostra é aberto.. Seta branca representa a direcção na qual a placa é puxada esternal. (C) Resumo da cavidade abdominal com a artéria esternal (2) e cordão nervoso (3).

Figura 8
Figura 8: visão transversal do abdômen lagostins com cadeias musculares dorsal fixo (1) e artéria esternal (2); As linhas vermelhas (3) e (4) indicam posições de cortes. Bares= 5 mm.

Figura 9
Figura 9: dorsais e ventrais partes do abdómen são separados um do outro (1) A linha vermelha indica a posição de corte.. Placa esternal (2) com cordão nervoso ventral; dorsal parte do abdome (3).

Figura 10
Figura 10:.. (A) As posições dos pinça para remover o esternos cefalotorácico anterior (B) As linhas vermelhas (1) e (2) indicam onde cortar os músculos entre o esternos cefalotorácico restante (C) Os nervos torácicos são seccionadas em as linhas vermelhas (3) para isolar o gânglio torácica a partir do tecido circundante. A linha vermelha (4) indica o corte entre T3 e T4. Bares = 5 mm.


Figura 11: (A e B) Vista da placa esternal na A2. O nervo N1 é isolado a partir do tecido com um corte ao longo da infolding cuticular esternal posterior (1) e anterior para ambos os invaginações cuticulares esternais B (2). (C) Maior ampliação da região à volta A2, com o nervo isolado N1. ( D) O isolamento do nervo N1 no lado contralateral com cortes semelhantes. As linhas vermelhas (2) e (3) indicam as posições dos cortes; (1) anterior e posterior dobramentos cuticulares esternal; Bares = 5 mm.

Figura 12
Figura 12: (A e B) A6 é isolado a partir do tecido e o cabo de nervo pode ser suprimidos os nervos da A6 (C). (D) cordão nervoso Isolado é transferido para uma placa de Petri forradas com Sylgard claro e cheio com solução salina. As linhas vermelhas indicam as posições dos cortes. Bares = 5 mm.

Figura 13
Figura 13: Vista lateral de um gânglio Identificação da dorsal e ventral (linha preta) do cordão nervoso.. Barra de 5 mm

Figura 14
Figura 14: O ramo anterior do nervo N1 é separada do ramo posterior Barra = 5 mm..

Figura 15
Figura 15: Modo de desheathing de um gânglio abdominal (A) Posição do primeiro corte pequeno através da bainha dos conectivos (seta vermelha), colocado lateral e posterior ao gânglio. O corte posterior através da bainha acima do conjuntivo é marcada pela linha vermelha (1). (B) As linhas vermelhas (1) e (2) marcar os cortes ao longo das bordas laterais do gânglio. A bainha pode depois ser puxado a partir do gânglio. Bares = 1 mm.

Figura 16
Figura 16:. (A) Visão geral da configuração de gravação (b) os materiais e as ferramentas necessárias para gravações extracelular. C. Equipamento necessário para a gravação eletrofisiológico. (1) fonte de luz fria; (2) gaiola de Faraday; (3) microscópio estéreo; (4) mesa-ar; (5) Mesa de microscópio; (6) espelho; (7) os eléctrodos de pinos diferencial; (8) cheia com petróleogeléia; (9) massa de modelar; (10) uma pinça; (11) eliminação de resíduos líquidos; (12) digitador; (13) amplificador extracelular; (14) computador, equipado com software de gravação e monitor.

Figura 17
Figura 17: (A e B) Posição de gravação (1) e de referência (2) eléctrodo pino. (C e D) O ramo posterior do nervo N1 é dobrar em torno do eletrodo de registro. E. A base (4) do eletrodo de registro é isolado com vaselina. F. O eletrodo de gravação completo é isolado com vaselina da solução de banho. (3) Seringa enchida com vaselina. Bares = 2 mm.

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Discussion

A anatomia de lagostins e seus gânglios abdominal tem sido descrito anteriormente 5, 18, ​​19, 20 e recomenda-se a familiarizar-se com eles antes da dissecção, a fim de evitar o corte de nervos importantes.

É crítico para manter a preparação, a temperaturas inferiores a 23 ° C para evitar degradação do cabo de nervo isolado. Isto pode ser facilmente conseguido por substituição da solução de banho a cada 20-30 min com solução salina fria lagostas. Nestas circunstâncias, a cadeia de gânglios pode ser utilizado para experiências electrofisiológicas para até 12 horas.

Às vezes, os neurônios motores swimmeret estão inativos e não apresentam qualquer actividade de ruptura espontânea. O carbacol agonista colinérgico é utilizado para induzir a actividade de ruptura nestas preparações. Dissolvido em solução salina lagostas frio, aplicações de banho de 1-3 mM carbacol são suficientes para ativar o ritmo swimmeret 21.

ove_content "> A locomoção fictícia e, especialmente, a coordenação dos membros registrados neste sistema fornecer uma série de informações sobre as propriedades celulares de atividade e coordenação rítmica. Neste sistema os componentes neuronais 8-10 dos microcircuitos locais são identificados e, adicionalmente, o rede de coordenação é conhecido em detalhe celular 11,14,15. Os resultados extraídos dos experimentos realizados com gravações extracelulares, permitem já previsões para modelos matemáticos e para especialistas em robótica.

Todos os neurónios swimmeret mostram dendrítica de ramificação dentro do Neurópilo lateral e pode ser intracelularmente registadas a partir destes dendritos. Na Figura 20, um registo intracelular de um neurónio motor PS é mostrado. Para este um microeléctrodo afiado (ver suplementos) encheu-se com 1 M + KAc 0,1 M de KCl (resistência de eléctrodo entre 35 - 45 mohms) é colocada acima da lateral Neurópilo. Os potenciais de membrana oscilantes como wspikes ell dos dendritos de PS e RS neurônios motores pode ser gravado quando o eletrodo é introduzido perto da base do nervo N1.

Para corar neurónios individuais (por exemplo, neurónios motores) intracelularmente como mostrado na Figura 21, o microeléctrodo afiado deve ser, adicionalmente, preenchido com corante fluorescente (por exemplo, 1% de dextrano vermelho do Texas, ver suplementos) dissolvido em 1 M + KAc 0,1 M de KCl. Para preencher os neurônios motores intracelularmente por iontoforese, polarizando pulsos de 1 nA com uma duração de 250 ms a 2 Hz são aplicadas por pelo menos 10 min. Para corantes carregados positivamente usar pulsos despolarizantes e para corantes carregadas negativamente usar pulsos hiperpolarizantes. Preenchimentos mais longos resultam em um neurónio mais forte rotulado. Para visualização do cordão nervoso devem ser fixadas, desidratadas e montadas 22.

Um método para corar uma piscina de neurónios motores é a utilização de aterros do nervo N1 (Figura 22) 4, 23. Coloque um bem de vaselina ao redor do ramo posterior do nervo N1 para aterrar a piscina do PS neurônios motores. Para corar o conjunto de motor de RS neurónios um bem é colocado sobre o ramo anterior do nervo N1. A solução salina de lagostas no bem é substituído por ddH 2 O. Em seguida, corte este nervo dentro do poço e deixe agir por 15 min em DDH 2 O em temperatura ambiente (RT). Depois disso, substituir o ddH2O nos poços com 5% ou CoCl2 - 5% ou NiCl2 - solução (dissolvido em ddH 2 O) e cavidades estreitas com geleia de petróleo. A amostra deve ser incubada durante pelo menos 15 horas a 4 ° C. Abra os poços, remover o corante e lavar a amostra 3 vezes com solução salina. Precipitar o Ni2 + ou iões Co 2+, com 10 gotas de Dithiooxamid (solução saturada dissolvido em EtOH a 100%) para cada 10 ml de solução salina lagostas na placa de Petri, sob o capô, durante 20 min à TA. Ni 2+ - íons irá precipitar a azul Ni (SCH) e Co 2+

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Acknowledgments

Agradecemos Jos Burgert para ajudar com algumas das figuras. Somos gratos a Ingo Selbach (e do grupo "Edelkrebsprojekt NRW") por seus esforços para fornecer o laboratório com animais experimentais. Agradecemos a Anna C. Schneider para reler primeiras versões do manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa de SM Emmy Noether DFG 206 / 3-1 e uma subvenção de arranque da Universidade de Colônia para professores do sexo feminino.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-channel extracellular amplifier: MA 102  Amplifier Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany
air-table Technical Manufacturing Corporation
(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA		 63-534
Axon Digidata 1440A Digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA DD1440A
big bucket 
Clampex & Clampfit pClamp 10, recording and analysis software Molecular Devices Design, Union City, CA pClamps 10 Standard
cold lamp source with flexible light guide (fiber optic bundle)  Euromex microscopes holland, Arnhem, BD LE.5211 & LE.5235
computer and monitor equipped with recording software
container and pipette for liquid waste 
crayfish saline  contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. 
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) fluorescent dye, lysine fixable Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany D3328
dissection dish  (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone
faraday cage
fixing pins
forceps (biology, Dumont #5) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11252-20
forceps (biology, Dumont #55) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11255-20
forceps (electronic, Dumont #5) Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11251-20
intracellular electrode Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament Sutter Instruments, Novato, CA BF100-50-10
Leica S8 Apo StereoZoom Dissection Microscope                       Zoom 1x - 8x Leica, Germany 10446298
microscope table
mirror to illuminate preparation from below
modeling clay
Olympus SZ61 Dissection Microscope                       Zoom 0.67x - 4.5x Olympus, Germany
petri dish  94 x 16 mm; lined with clear silicone Greiner bio-one, Germany 633180
ring scissors ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm Fine Science Tools (FST), Germany 14054-13
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm Fine Science Tools (FST), Germany 15024-10 or          15000-08
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm Fine Science Tools (FST), Germany 91500-09 or           15396-00
sylgard 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip

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References

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O Sistema Swimmeret de lagosta: Um Guia Prático para a dissecção da medula nervosa e extracelulares Recordings do padrão motor
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Seichter, H. A., Blumenthal, F., Smarandache-Wellmann, C. R. The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern. J. Vis. Exp. (93), e52109, doi:10.3791/52109 (2014).

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