Abstract
Hier zeigen wir die Dissektion der Krebse Bauchnervenstrang. Die Herstellung umfasst den letzten zwei Thoracalganglien (T4, T5) und die Kette der Abdominalganglien (A1 bis A6). Diese Kette von Ganglien umfasst den Teil des zentralen Nervensystems (ZNS), die koordinierte Bewegungs der Pleopoden (swimmerets) treibt: der swimmeret System. Es ist für mehr als fünf Jahrzehnten, die in Flusskrebse jeweils swimmeret wird durch eine eigene, unabhängige Mustererzeugungs Kernel, der rhythmischen Wechselaktivität 1-3 erzeugt angetrieben bekannt. Die Motoneuronen innervieren die Muskulatur jeder swimmeret anatomisch und funktionell unterschiedliche Populationen 4 umfassen zwei. Einer ist für den Rückzug (Arbeitstakt, PS) des swimmeret verantwortlich. Die andere treibt die Verschleppung (Rücklauf, RS) des swimmeret. Motoneuronen des swimmeret Systems sind in der Lage, spontan eine fiktive Motor Muster, welches identisch mit dem in vivo aufgezeichnete Muster ist 1.
Das Ziel dieses Berichts ist es, eine interessante und bequeme Modellsystem zur Untersuchung Rhythmus erzeugenden Netzwerke und Koordination von unabhängigen Mikroschaltungen aus praktischen Laborkurse Schüler einzuführen. Die zur Verfügung gestellten Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Präparation der Bauchnervenstrang der Krebse ist, Pinning der isoliert Kette von Ganglien, desheathing die Ganglien und die Aufzeichnung der swimmerets fiktiven Motor Muster extrazellulär aus dem isolierten Nervensystem.
Darüber hinaus können wir die Aktivität von Neuronen swimmeret intrazellulär von Dendriten, aufgezeichnet. Hier beschreiben wir kurz auch diese Techniken und stellen einige Beispiele. Weiterhin kann die Morphologie swimmeret Neuronen mit Färbetechniken beurteilen. Hier stellen wir Beispiele für intrazelluläre (durch Iontophorese) Farbstoff gefüllt Neuronen und Hinterfüllungen von Pools von swimmeret Motoneuronen. In unserem Laborwir diese Vorbereitung auf die Grundfunktionen des fiktiven Fortbewegung, die Wirkung der sensorischen Rückmeldung über die Aktivität des ZNS, und die Koordinierung zwischen Mikroschaltungen auf zellulärer Ebene zu untersuchen.
Introduction
Die swimmerets von Krebsen dienen eine Funktion in Lageregelung und schlugen rhythmisch, wenn die Tiere schwimmen freuen, lüften ihre Höhlen oder Weibchen ihre Eier belüften 5, 6. Die swimmerets der Signalkrebs, Pacifastacus leniusculus treten paarweise vom zweiten bis zum fünften Abdominalsegment, mit einem Schenkel auf jeder Seite des Bauches 7. Das Zentralnervensystem produziert eigener rhythmischen Motor Rüttler, der die swimmeret Bewegung in intakten Tier als auch in der isolierten Nervenstrang Herstellung antreibt. Wenn es keine sensorische Rückmeldung oder absteige gegenwärtigen Eingangs die erzeugte rhythmische Motormuster heißt fiktive Lokomotion 1, 2. Im swimmeret System dieser Motor Muster nicht in jedem Parameter aus der Aktivität der swimmerets im intakten Tier gemessen abweichen.
Die Bewegung jedes swimmeret wird durch eine Mikroschaltung, die in sich und mit einem c beschränkt angetriebenhenden hemiganglion. 1 - 3 In jedem Mikro es eine Mustererzeugungs Kernel, der fünf identifizierten nicht Spiking Inter umfasst. Sie können funktionell als charakterisiert werden entweder Inhibitor of Power Stroke (IPS) oder Inhibitor of Return Stroke (IRS) 8. Diese IPS und IRS Inter nicht endogene Oszillatoren, sondern ihre Wechselaktivität wird durch reziproke Hemmung 9 angetrieben. Da diese Inter direkt hemmen die swimmeret Motoneurone wird die Wechsel PS-RS Bewegung erzeugt 10. Locomotion jedoch erfordert nicht nur die Erzeugung der Aktivität, sondern auch die Koordination der verschiedenen unabhängigen Mikroschaltungen. Im swimmeret System wird von der koordinierenden Mikroschaltung, die gewährleistet, dass Gliedmaßen richtigen Zeiten aktiv sind, eine solche Koordinierung etabliert. Diese Mikroschaltung wird von drei identifizierten Neuronen in jedem Segment 11 bis 15 aufgebaut.
Dieses Protokoll sieht the erstmals ein Schritt-für-Schritt-Dissektion Führung, um die Kette der Ganglien (T4 bis A6, 1) zu isolieren. Wir zeigen, wie man den Stift isoliert Bauchnervenstrang und desheathe jedes Ganglion. In diesem isoliert Nervensystem Vorbereitung sind die Neuronen für swimmeret Bewegung verantwortlich bereit für den Einsatz in elektrophysiologischen und morphologischen Experimente. Der zweite Teil dieses Protokolls zeigt die Hauptmerkmale des Motor swimmeret Muster. Dies beinhaltet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum extrazellulär Rekord die Aktivität swimmeret Motoneuronen. Axone RS Motorneuronen projizieren durch den vorderen Ast von Nerven N1, während Axone PS Motorneuronen projizieren durch den hinteren Ast desselben Nerven (Abbildung 1) 4. Daher kann ihre Tätigkeit den folgenden Buchhandlungen mit Differenzstiftelektroden aufgezeichnet werden.
1: Getrenntes Nervensystems aus Brustganglion 4 (T4) zu Abdominalganglion 6 (A6) und ein schematisches Diagramm davon T4. Brustganglion 4; T5: thorakalen Ganglion 5; A1, A2 ... A6 Abdominalganglion 1, Abdominalganglion 2 ... Abdominalganglion 6; N1: Nerven N1; N2: Nerven N2; N3: Nerven N3; PS: Macht-Takt; RS: Rücktakt. Directional Abkürzungen: A = Front; P = posterior.
Diese Dissektion Verfahren und die elektrophysiologische Technik gezeigt, sind geeignet für Studenten und Schüler können Praktika in der Physiologie zu ergänzen. Die isolierte Kettenganglien wurde in einer Reihe von Versuchen verwendet worden, um Funktion des Nervensystems, Koordination oder Modulation swimmeret Mikro 6 sowie neuronalen Steuerung der adaptiven Verhaltens der Lokomotion 16, 17 untersucht werden. Das Krebs swimmeret System stellt somit einen enormen von interessanten Unterricht oder tregnet Möglichkeiten, die alle beginnen mit der Präparation der Bauchmark von Flusskrebsen und extrazelluläre Aufnahme der fiktiven Motor Muster.
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Protocol
Diese Dissektion Verfahren ist gemäß der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 22. nd September 2010 (2010/63 / EU).
1. Vorbereitung
- Erhalten Krebse, Pacifastacus leniusculus (Dana), beider Geschlechter ≥8 cm groß. Stellen Sie sicher, dass die Tiere sind von entscheidender Bedeutung und den Bauch und Bauch Gliedmaßen intakt sind.
- Achten Sie darauf, um den Panzer zu untersuchen und dass diese Schuppenschicht ist hart und steif. Vor- und postmolt Tiere haben einen weichen Panzer und werden, weil während der Häutungsprozess viele Parameter verändern nicht für Experimente geeignet (zB Verringerung der Bewegungsaktivität).
- Montieren Sie alle Werkzeuge und Materialien während der Präparation verwendet, Pinning und desheathing der Nervenstrang in Abbildung 2 dargestellt und in den Ergänzungen geliefert wurde.
(1) großen Eimer mit Eis gefüllt; (2) Krebse Kochsalzlösung; (3) Kochsalzspender; (4) Dissektionsmikroskop; (5) Dissektion Gericht; (6) starke Schere; (7) Pinzetten (8) Frühling Schere; (9) Petrischale mit klaren Sylgard gesäumten; (10) Befestigungsstifte; (11) kalt Lampenquelle. 2. Brutto-Dissektion 3. Fein Dissection 4. abstecken Nervenstrang in die Petrischale HINWEIS: Verwenden Sie kleine Stifte aus Edelstahldraht geschnitten (siehe Ergänzungsmittel), um den Nervenstrang zu befestigen. Berühren Sie nur die Nervenende mit der Zange und nicht squeezE die Verknüpfungen oder Ganglien. 5. Desheathing die Ganglien 6. extrazellulären Recordings von Motoneuronen 
Abbildung 2:
HINWEIS: In den folgenden Schritten (2,12 bis 4,8) enthalten Richtungsanweisungen, die Rechtshänder Experimentatoren anzuwenden. In den folgenden Schritten (2,12 bis 6,8) ist es wichtig, Krebse Kochsalzlösung in regelmäßigen Abständen mit kalter Kochsalzlösung zu ersetzen, alle 20-30 Minuten, um das Nervensystem gesund zu halten.
HINWEIS: Die Brustganglien und Nerven verbunden sind teilweise durch die Beinmuskulatur und kephalothorakalen sterna bedeckt. Kephalothorakalen sterna bilden ein Gerüst, das die seitlich angeordneten Hohlräume der Laufbeine voneinander und von der medialen Hohlraum, in dem die Bauchmark befindet trennt.
HINWEIS: Der Nervenstrang wird dabei beschädigt werden, vermeiden Abheben des nerve Kabel mehrmals.
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Representative Results
Mit der gleichzeitigen extrazelluläre Ableitungen von RS und PS, Motorneuronen von einem Ganglion, das Wechselaktivität dieser Motorneuronenpools, kann überwacht werden (Abbildung 18), die die fiktive Fortbewegungsmuster.
Abbildung 18: Schematische Darstellung einer Ganglien und Platzierung der Differenzstiftelektrode extrazellulären Aufzeichnung von RS Motorneuronen (obere Kurve) und PS Motorneuronen (untere Kurve)..
Die extrazelluläre PS Aktivität der ipsilateralen PS 2 bis 5 PS Motorneuronen unterstreicht interessante Aspekte der segmentale Koordination im swimmeret System (19A).
Zunächst wird die Aktivität beginnt immer mit einem PS Burst in A5 (19A, 4. Trace) und der Erregerwelle breitet sich in der vorderen Richtung (<strong> 19A, grüne Linie). Zweitens ist die Periode, in jedem Segment (das ist die Zeit bis zum Beginn des nächsten Bursts gemessen vom Beginn eines Bursts ist) konstant bleibt (19A, Cyan Pfeil). Dies gilt, solange der Informationsfluss von einem Ganglion zum nächsten intakt ist und die Versuchsbedingungen nicht verändern.
Von Perioden von 0,25 bis 1 s: In verschiedenen Zubereitungen oder unter verschiedenen experimentellen Bedingungen die Perioden und brach Einwirkzeit können sehr unterschiedlich sein. Um diese Parameter zwischen verschiedenen Präparaten zu vergleichen, müssen sie normalisiert und in einer Phase-Histogramm (Abbildung 19B) grafisch dargestellt werden. Dies zeigt die dritte interessanter Aspekt des Kraftmuster: die Phasenverzögerung zwischen den Segmenten, die segmentale Verzögerung konstant und unabhängig von der Frequenz des Rhythmus bleibt.
Um eine Phasen Histogramm berechnen, werden die folgenden Messungen und Berechnungen sind necessar:
Zuerst muss eine Referenzkurve gewählt werden. Normalerweise benutzen wir die PS Spur der hintersten Ganglions (zB PS-5) als Referenz (als Zeit 0) für eine Phase Histogramm des swimmeret Rhythmus über mehrere Segmente (19A) .Dann aufgezeichnet, messen Sie den Zeitraum (in ms ) der Rhythmus der Beginn eines PS 5 Burst (Zeit 0, 19A, orange gestrichelte Linie) zu dem Beginn der nächsten PS 5 Bursts (19A, Cyan Pfeil) .Within dieser Zyklus, messen die Latenz (in ms ) zwischen dem Beginn der PS 5 Bursts (Zeit 0) und dem Beginn (Burst-Beginn, 19A und B, orange Pfeile) und Ende (Offset 19A und B, violett Pfeile) der PS-Burst in jedem der anderen Ganglien . Deshalb, um die Phase Beginn und rechnet für jeden Burst die Latenzen durch den gleichzeitigen Zeitraum aufgeteilt. Diese Messungen werden in numerischer Folge values zwischen 0 und 1 hin und her zu plotten diese Werte in einem Phasen Histogramm wie in Figur 19B gezeigt.
Die resultierende Phasen Histogramm (19B) enthält Informationen über den Arbeitszyklus des PS in jedem Segment platzen. Und die segmentale Phasenverzögerung von ~ 0,25 zwischen benachbarten Segmenten ist deutlich sichtbar.
Abbildung 19: (A) Schematische Darstellung der Platzierung der Elektroden und der extrazellulären Aufnahme von ipsilateral PS 5 bis PS 2 (B) Messungen und Berechnungen für die Phase-Histogramm benötigt. Die Phasen Histogramms aus zehn aufeinanderfolgenden Bursts (n = 10) berechnet zeigt die segmentale Phasenverzögerung von ~ 0,25.
Für fortgeschrittene Experimentatoren können intrazelluläre Ableitungen mit scharfen Mikroelektroden aus den Dendriten von Motoneuronen nützlich sein. Die Membranpotentialeneinzelner intrazellulär aufgenommen PS Motorneuronen zeigen Inphase-Schwingungen mit dem extrazellulär Registriert aller PS Motorneuronen des gleichen hemiganglion (Abbildung 20, grau-Panels). Alternativ kann RS Motoneuronen oder Inter intrazellulär in der gleichen Weise aufgezeichnet werden (Daten nicht gezeigt).
Abb. 20: Schematische Darstellung der Elektrodenplatzierung Das Membranpotential eines intrazellulär aufgenommen PS Motor Neuron (obere Spur) schwingt in Phase (grau-Panels) mit der extrazellulär erfasst PS Aktivität (untere Kurve).
Zur Identifizierung der intrazellulär aufgenommen Neuronen (Inter oder Motoneuronen) können Zellen sein Farbstoff gefüllt mit scharfen Mikroelektroden und Iontophorese (siehe Diskussion). In Abbildung 21 sind zwei intrazellulär Farbstoffes gefüllt PS Motorneuronen dargestellt. Ihre Bauch Somatasind hinter der Basis des Nerven N1 befindet. Die primären Neuriten Projekte nach vorne (21B-2) und Niederlassungen in der Lateral Neuropil (21A und B-3); die Axon-Projekte durch den hinteren Ast des Nervus N1 an den swimmeret Muskulatur (21B-4).
Abbildung 21: (A) Schematische Darstellung eines Abdominalganglion (B) Zwei intrazellulär Bunt PS Motorneuronen.. (1) Somata; (2) Grund Neuriten; (3) dendritische Verzweigung in dem seitlichen Neuropil; (4) Axone durch den hinteren Ast des Nervus N1; Bar = 100 um.
Für weniger fortgeschrittenen Experimentatoren, oder diejenigen, die die Morphologie des Abdominalganglion studieren wollen, Hinterfüllungen aus den PS und RS Motorneuronenpools über das Nerven N1, sind eine interessante Übung. In Abbildung 22 die RS und PS Motorneuronen eines hemiganglion wurden mit Co 2+ (RS) und Ni 2+ -Ionen (PS), angefärbt. Somata PS Motoneuronen sind hinter der Basis des Nerven N1 (Figur 22-1) befindet. All somata RS Motorneuronen anterior der Basis des Nerven N1 (Figur 22-2) befindet.
Bild 22: Hinterfüllungen von der vorderen (orange, Co 2+) und hinteren (blau, Ni 2+) Zweig der Nerven N1 (1) Somata der PS Motorneuronen;. (2) Somata RS Motorneuronen. Bar = 100 um.
Abbildung 3: Entfernen der Krallen (1) und Uropoden (2). Rote Linien (1) und (2) zeigen Positionen der Schnitte. Bar = 5 cm.
Abb. 4: (A) Das Tier wird Bauchseite nach oben auf dem Telson gesteckt und fixiert (B) Die Krebse durch die Krallenöffnung mit kalter Kochsalzlösung ausgeblutet. Balken = 5 cm.
Abbildung 5: (A) Abtrennen des Kopfes und (B) Entfernen der Laufbeinen. Rote Linien zeigen Positionen der Schnitte. Balken = 1 cm.
Figur 6: (A, B, C und D) Entfernen der vorderen und den seitlichen Teilen des cephalothorax. E. Eröffnung des Bauches entlang der lateralen Seite.Rote Linien (1), (2), (4) und (5) zeigen Positionen der Schnitte. (3) Verdauungsdrüse. Rote Pfeile zeigen auf die bereits geöffnete Bauchhöhle. Balken = 1 cm.
Abbildung 7: (A) Die Probe wird an einer Öffnung der Laufbeinen (rote Pfeile) packte (B) Die Rückenmuskelstränge (1) durchtrennt, während die Probe geöffnet wird.. Der weiße Pfeil zeigt die Richtung, in der die Brustbeinplatte gezogen ist. (C) Überblick über die Bauchhöhle mit dem Brustbeinschlagader (2) und Nervenstrang (3).
Abbildung 8: Quer Blick auf die Krebse Bauch mit fester Rückenmuskelstränge (1) und Brustbeinschlagader (2); Rote Linien (3) und (4) zeigen Positionen der Schnitte. Gitter= 5 mm.
Abbildung 9: dorsale und ventrale Teile des Bauches werden voneinander getrennt (1) Rotes Linie zeigt die Position des Schnitts.. Brustbeinplatte (2) mit Bauchmark; dorsale Teil des Bauches (3).
Bild 10:.. (A) Position der Zange, um den vorderen kephalothorakalen sterna entfernen (B) Rote Linien (1) und (2) anzugeben, wo die Muskeln zwischen den verbleibenden kephalothorakalen sterna geschnitten (C) Die Brustnerven werden bei durchtrennten die roten Linien (3), um den Brustganglien aus dem umgebenden Gewebe zu isolieren. Rote Linie (4) zeigt den Schnitt zwischen T3 und T4. Balken = 5 mm.
Abbildung 11: (A und B) Blick auf die Brustbeinplatte auf A2. Der Nerv N1 aus dem Gewebe mit einem Schnitt entlang der hinteren Brustbein Kutikula Einfaltung (1) und der vorderen sowohl Brustbein Kutikula Einfaltungen (B 2) isoliert. (C) stärkere Vergrößerung der Region um A2, mit dem isolierten Nerven N1. ( D) Isolierung des Nerven N1 auf der kontralateralen Seite mit ähnlichen Schnitten. Rote Linien (2) und (3) zeigen Positionen der Schnitte; (1) vorderen und hinteren Brustbein Kutikula Einfaltungen; Balken = 5 mm.
Abbildung 12: (A und B) A6 aus dem Gewebe isoliert, und der Nervenstrang können an den Nerven des A6 angehoben werden (C). (D) Isolierte Nervenstrang wird in eine Petrischale mit klaren Sylgard gesäumten übertragen und mit Kochsalzlösung gefüllt. Rote Linien zeigen Positionen der Schnitte. Balken = 5 mm.
Abbildung 13: Seitenansicht eines Ganglien Bezeichnung des dorsalen und ventralen Seite (schwarze Linie) der Nervenstrang.. Bar = 5 mm
Abbildung 14: Der vordere Ast des Nervus N1 wird von der hinteren Ast Bar = 5 mm getrennt..
Abbildung 15: Hinweise zur desheathing eines Abdominalganglion (A) Position des ersten kleinen Schnitt durch die Hülle der Verknüpfungen (roter Pfeil), platziert seitlichen und hinteren zum Ganglion. Die anschließende Schnitt durch die Hülle über der Binde wird durch die rote Linie (1). (B) Die roten Linien (1) und (2) markieren die Schnitte entlang der seitlichen Ränder des Ganglions markiert. Die Hülle kann anschließend aus dem Ganglion gezogen werden. Balken = 1 mm.
Abb. 16: (A) Übersicht über die Aufnahme-Einstellungen (B) Materialien und Werkzeuge für die extrazelluläre Ableitungen notwendig. C. Ausrüstung, die elektrophysiologische Ableitung notwendig. (1) kalte Lampe Quelle; (2) Faraday-Käfig; (3) Stereomikroskop; (4) Klimatabelle; (5) Mikroskoptisch; (6) Spiegel; (7) Differenzstiftelektroden; (8) Spritze mit Erdöl gefülltenjelly; (9) Modelliermasse; (10) Pinzette; (11) Flüssigabfallbeseitigung; (12) Digitizer; (13) extraVerstärker; (14) Computer mit Aufnahmesoftware und Monitor ausgestattet.
Abbildung 17: (A und B) Position der Aufnahme (1) und Sollwert (2) Stiftelektrode. (C und D) Die hinteren Ast des Nervus N1 biegen um die Aufzeichnungselektrode. E. Der Boden (4) der Aufzeichnungselektrode mit Vaseline isoliert. F. Die komplette Aufnahme-Elektrode ist mit Vaseline aus dem Bad-Lösung isoliert. (3) Spritze mit Vaseline gefüllt. Balken = 2 mm.
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Discussion
Die Anatomie der Krebse und ihre Bauchganglien zuvor 5, 18, 19, 20 beschrieben, und es wird empfohlen, vor der Dissektion, um Schneiden von wichtigen Nerven zu vermeiden mit ihnen vertraut machen.
Es ist entscheidend, um die Vorbereitung bei Temperaturen unter 23 ° C zu halten, um den Abbau des isolierten Nervenstrang zu vermeiden. Dies kann einfach durch Austausch der Badlösung alle 20-30 min mit kaltem Krebse Salz erreicht werden. Unter diesen Umständen ist die Kette der Ganglien können elektrophysiologischen Experimenten für bis zu 12 h verwendet werden.
Manchmal swimmeret Motoneuronen sind inaktiv und zeigen keine spontane Zerplatzen Aktivität. Die cholinergische Agonist Carbachol wird zum Bersten Aktivität in diesen Zubereitungen induzieren. In kaltem Krebse Kochsalzlösung gelöst, Badanwendungen von 1-3 uM Carbachol ausreichen, um den Rhythmus swimmeret 21 zu aktivieren.
ove_content "> Die fiktive Fortbewegung und vor allem die Koordination der in diesem System erfasst Gliedmaßen bieten eine Vielzahl von Informationen über die zellulären Eigenschaften der rhythmischen Aktivität und Koordination. In diesem System werden die neuronalen Komponenten 8-10 der lokalen Mikroschaltungen ermittelt und zusätzlich die Koordination Netzwerk der zellulären Detail 11,14,15 bekannt. Die Ergebnisse aus den Versuchen mit extrazelluläre Ableitungen durchgeführt gezogen, ermöglichen bereits Vorhersagen für mathematische Modelle und für Roboteringenieure.Alle swimmeret Neuronen zeigen dendritischen Verzweigungen innerhalb des Lateral Neuropil und intrazellulär von diesen Dendriten aufgenommen werden. In Abbildung 20 wird ein intrazellulärer Aufnahme eines PS-Motor Neuron dargestellt. Für diese eine scharfe Mikroelektroden (siehe Beilagen) mit 1 M KAc + 0,1 M KCl (Elektrodenwiderstand zwischen 35 - 45 MOhm) gefüllt ist oberhalb des Lateral Neuropil platziert. Die oszillierenden Membranpotentialen als well Spitzen von den Dendriten PS und RS Motoneuronen können aufgezeichnet werden, wenn die Elektrode in der Nähe der Basis des Nerven N1 eingefügt.
Um einzelne Nervenzellen (zB Motorneuronen) Fleck intrazellulär wie in Abbildung 21 dargestellt, muss die scharfe Mikroelektrode zusätzlich mit Fluoreszenzfarbstoff (zB 1% Dextran Texas Red, siehe Ergänzungen) in 1 M KAc + 0,1 M KCl gelöst ausgefüllt werden. Motoneuronen intrazellulär füllen durch Iontophorese, polarisierenden Impulsen von 1 nA mit einer Dauer von 250 ms bei 2 Hz für zumindest 10 min aufgetragen. Für positiv geladene Farbstoffe verwenden depolarisierende Pulse und für negativ geladene Farbstoffe verwenden hyperpolarisierende Impulse. Mehr Füllungen führen zu einer stärkeren beschriftet Neuron. Zur Visualisierung der Nervenstrang festzusetzen, dehydriert und 22 montiert.
Eine Methode, um einen Pool von Motoneuronen Fleck ist, Hinterfüllungen von der Nerven N1 verwenden (Bild 22) 4, 23. Legen Sie eine gut Vaseline um den hinteren Ast des Nervus N1 um den Pool von PS Motorneuronen verfüllen. Um den Pool von RS Motor Fleck Neuronen eine gut ist an der vorderen Ast des Nervus N1 gelegt. Die Krebse Kochsalzlösung in den Brunnen wird durch ddH 2 O ersetzt Dann schneiden Sie diesen Nerv in der gut und lassen Sie es für 15 Minuten in ddH 2 O bei Raumtemperatur (RT). Danach ersetzt die ddH 2 O in die Vertiefungen entweder mit 5% CoCl 2 - oder 5% NiCl 2 - Lösung (in ddH 2 O gelöst) und nahe Vertiefungen mit Vaseline. Die Probe muss für mindestens 15 h bei 4 ° C inkubiert werden. Öffnen Sie die Brunnen, entfernen Sie den Farbstoff und spülen Sie die Probe 3-mal mit Kochsalzlösung. Ausfällung des Ni 2+ oder Co 2+ -Ionen mit 10 Tropfen Dithiooxamid (in 100% EtOH gelöst gesättigte Lösung) pro 10 ml Kochsalz Krebse in der Petrischale, unter der Motorhaube für 20 min bei RT. Ni 2+ - Ionen zu blau Ni (SCH) und Co 2+ ausfällen
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Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Jos Burgert für die Hilfe bei einigen der Figuren. Wir danken Ingo Selbach (und der Gruppe "Edelkrebsprojekt NRW") für seine Bemühungen um das Labor mit Versuchstieren zu versorgen. Wir danken Anna C. Schneider für das Korrekturlesen ersten Versionen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Emmy Noether-Stipendium der DFG SM 206 / 3-1 und dem Start Gewährung der Universität zu Köln für weibliche Dozenten unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-channel extracellular amplifier: MA 102 | Amplifier | Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany | |
| air-table | Technical Manufacturing Corporation (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA |
63-534 | |
| Axon Digidata 1440A | Digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA | DD1440A |
| big bucket | |||
| Clampex & Clampfit | pClamp 10, recording and analysis software | Molecular Devices Design, Union City, CA | pClamps 10 Standard |
| cold lamp source | with flexible light guide (fiber optic bundle) | Euromex microscopes holland, Arnhem, BD | LE.5211 & LE.5235 |
| computer and monitor | equipped with recording software | ||
| container and pipette for liquid waste | |||
| crayfish saline | contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. | ||
| dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) | fluorescent dye, lysine fixable | Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | D3328 |
| dissection dish | (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone | ||
| faraday cage | |||
| fixing pins | |||
| forceps (biology, Dumont #5) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11252-20 |
| forceps (biology, Dumont #55) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11255-20 |
| forceps (electronic, Dumont #5) | Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11251-20 |
| intracellular electrode | Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament | Sutter Instruments, Novato, CA | BF100-50-10 |
| Leica S8 Apo StereoZoom | Dissection Microscope Zoom 1x - 8x | Leica, Germany | 10446298 |
| microscope table | |||
| mirror | to illuminate preparation from below | ||
| modeling clay | |||
| Olympus SZ61 | Dissection Microscope Zoom 0.67x - 4.5x | Olympus, Germany | |
| petri dish | 94 x 16 mm; lined with clear silicone | Greiner bio-one, Germany | 633180 |
| ring scissors | ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 14054-13 |
| spring scissors or alternative: Vannas spring scissors | cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 15024-10 or 15000-08 |
| student Vannas spring scissors or alternative: Moria Spring Scissors | cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 91500-09 or 15396-00 |
| sylgard | 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon | Dow Corning, Midland, MI, USA | |
| syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip |
References
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