Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Swimmeret Система Раки: Практическое руководство для рассечения нервной цепочки и внеклеточной регистрацию структуры Motor

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52109
Automatic Translation
1, 1, 1
1Emmy Noether Group, Institute of Zoology, University of Cologne

Abstract

Здесь мы демонстрируем рассечение раков брюшной нервной цепочки. Препарат содержит две последние грудных ганглиев (T4, T5) и цепь брюшной ганглиях (А1-А6). Эта цепочка ганглиев включает в себя часть центральной нервной системы (ЦНС), что приводит скоординированной локомоции плеоподов (swimmerets): системы swimmeret. Он известен более пяти десятилетий, что в раков друг swimmeret управляется своим собственным независимым картины генерации ядра, который генерирует ритмичные переменного Задание 1-3. Моторные нейроны, иннервирующие мускулатуру каждого swimmeret состоять из двух анатомически и функционально различных групп населения 4. Один отвечает за отвода мощности (инсульт, PS) в swimmeret. Другие диски затяжного (обратный ход, RS) в swimmeret. Моторные нейроны swimmeret системы способны производить спонтанно фиктивный двигателя узор, который идентичен образцу, записанной в естественных условиях 1.

Целью данного отчета является ознакомление интересный и удобный модельную систему для изучения ритма генерирующих сетей и координации независимых микросхем для практических лабораторных курсов студентов. Протокол условии включает в себя шаг за шагом инструкции для вскрытия брюшной нервной цепочки раков, в пиннинга изолированной цепи ганглиев, desheathing ганглиев и записи swimmerets фиктивный шаблон двигателя внеклеточно от изолированных нервной системы.

Кроме того, мы можем контролировать деятельность swimmeret нейронов, записанных внутриклеточно из дендритов. Здесь мы также кратко описать эти методы и приведем несколько примеров. Кроме того, морфология swimmeret нейронов может быть оценена с помощью различных методов окрашивания. Здесь мы приводим примеры внутриклеточных (ионтофорезом) красителя заполнено нейронов и backfills бассейнов в swimmeret двигательных нейронов. В нашей лабораториимы используем этот препарат для изучения основных функций фиктивного передвижения, эффект сенсорной обратной связи о деятельности ЦНС и координации между микросхемами на клеточном уровне.

Introduction

В swimmerets раков выполнять функцию в контроле позы и бить ритмично, когда животные плавать вперед, проветрите их норы или женщины проветрить свои яйца 5, 6. The swimmerets сигнала раков, Pacifastacus leniusculus, встречаются парами из второго по пятое брюшной сегмент, с одной конечности на каждой стороне брюшной полости 7. Центральной нервной системы производит на собственной ритмической двигателя стук, который приводит в движение swimmeret в интактных животных, а также в изолированном препарате нервной цепочки. Когда нет сенсорная обратная связь или убывания вход настоящее ритмичный двигатель модели производятся называется фиктивным передвижение 1, 2. В системе swimmeret этот двигатель модели не отличается какого-либо параметра от деятельности swimmerets, измеренных в интактных животных.

Движение каждого swimmeret управляется микросхемой, который находится в и ограничивается одной сorresponding hemiganglion 1 -. 3 В каждой микросхемы есть шаблон генерации ядра, включает в себя пять выявленных удобства всплески интернейронов. Они могут быть функционально характеризуется либо как ингибитор хода силы (IPS) или ингибитор обратного хода (IRS) 8. Эти IPS и IRS интернейронов не являются эндогенными генераторы, а их переменный деятельность обусловлена ​​взаимного ингибирования 9. Потому что эти интернейронов ингибировать swimmeret моторные нейроны напрямую, переменное движение PS-RS генерируется 10. Передвижение однако, не только требуют создания деятельности, но и координации различных независимых микросхем. В системе swimmeret такая координация устанавливается координационного микросхемы, которая гарантирует, что конечности являются активными в правильное время. Эта микросхема построена на трех определенных нейронов в каждом сегменте 11-15.

Этот протокол предусматривает гое первый раз шаг за шагом рассечение руководство, чтобы изолировать цепь ганглиев (T4 до A6, рис 1). Мы покажем, как прикрепить Изолированная абдоминальная нервный тяж и desheathe каждый ганглий. В этом изолированном препарате нервной системы, нейроны, отвечающие за движения swimmeret готовы для использования в электрофизиологических и морфологических экспериментов. Вторая часть этого протокола демонстрирует основные особенности swimmeret узором двигателя. Это включает в себя шаг за шагом руководство для внеклеточно записи активности swimmeret двигательных нейронов. Аксоны двигательных RS нейроны проецируются через передней ветви нерва N1, в то время как аксоны PS двигательных нейронов проекта через заднюю ветви одного и того же нерва (рис 1) 4. Поэтому их деятельность может быть записано от этих отраслей с помощью дифференциальных контактных электродов.

Рисунок 1
Рисунок 1: Изолированные нервной системы от грудного ганглия 4 (Т4) в брюшной ганглий 6 (A6) и принципиальная схема, что Т4.: Грудной ганглий 4; T5: грудной ганглий 5; A1, A2 ... A6 брюшной ганглий 1, брюшной ганглий 2 ... брюшной ганглий 6; N1: нерв N1; N2: нерв N2; N3: нерв N3; PS: рабочий ход; RS: возвращение-тактный. Направленные сокращения: = Передняя; P = задний.

Эта процедура рассечение и электрофизиологические техника продемонстрировала удобны для студентов и могут дополнять студентов практические занятия по физиологии. Изолированные цепи ганглиев был использован в ряде экспериментов по изучению функции нервной системы, координацию, или модуляцию swimmeret микросхем 6, а также нейронную контроль адаптивного поведения в локомоции 16, 17. Таким образом, система раков swimmeret обеспечивает огромное количество интересной преподавательской или тдождь возможности, которые все начинаются с рассечением брюшной нервной раков и внеклеточной записи фиктивного узором двигателя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эта процедура рассечение в соответствии с Директивой Европейского сообщества совета 22 сентября 2010 года (2010/63 / ЕС).

1. Подготовка

  1. Получить раков, Pacifastacus leniusculus (Дана), обоих полов ≥8 см в размере. Убедитесь, что животные имеют жизненно важное значение и для живота и брюшной конечности целы.
  2. Позаботьтесь, чтобы проверить панцирь, и что это кутикула жесткий и жестким. До и postmolt животные имеют мягкую панцирь и не подходит для экспериментов, потому что в процессе линьки многие Изменить параметры (например, снижение двигательной активности).
  3. Соберите все инструменты и материалы, используемые во время вскрытия, закрепления и desheathing нервного мозга показано на рисунке 2 и приведены в дополнениях услуг.

Фиг.2
На рисунке 2:

(1) большое ведро со льдом; (2) раки соленую воду; (3) физиологический раствор распылитель; (4) рассечение микроскоп; (5) рассечение блюдо; (6) сильные ножницы; (7) щипцы (8) весной ножницы; (9) Чашка Петри выстроились с четким Sylgard; (10) крепежных стержней; (11) холодный источник лампа.

2. Валовой Препарирование

  1. Обезболить животное на льду в течение 15 - 20 мин. Осуществить первую часть валового вскрытия на лабораторном столе возле раковины, так как он включает стадию обескровливания и образец необходимо регулярно промывать с раками физиологического раствора во время процедуры.
  2. Держите животных вентральной стороной вверх и использовать сильные ножницы, чтобы обрезать когти на своих базах в районе грудной клетки (рис 3-1). Снять левую и правую Уропод (рис 3-2).
  3. Поместите животных вентральной стороной вверх в рассечение блюдо выстроились с черным Sylgard. ElevaTE головогрудь, вставив лед снизу и закрепить брюшко на тельсона (рис 4а).
  4. Заполните солевой дозатор ~ 60 мл охлажденной раков физиологического раствора. Заливать раков с холодным физиологическим раствором через отверстие вильчатой ​​(фиг.4В). Избыток физиологического раствора будет стекать через порезы на уроподов. Обложка раков со льдом в течение обескровливания
  5. Обезглавить животное с одного поперечный разрез только позади глаза животного, используя сильные ножницы (рис 5а). Удалить все ходильных ног рядом с базой суставов, как указано на рисунке 5B.
  6. Изолировать живота с последних грудных сегментов из остальной части головогруди. Сделать первым разрез на уровне второго пешеходных ног (грудного сегмента 3), вставив кончик ножниц в отверстие второго минутах ноге и резки на противоположную сторону. (6А-1).
  7. Продлить этот первый срез для обеих сторон через тОн головогруди (6А-2).
  8. Переверните животного, открытого, чтобы некоторые из внутренних органов видно. Нажмите видное пищеварительной железе (рис 6В-3) к передней части образца и использовать пинцет, чтобы удалить репродуктивные органы из брюшной полости.
  9. Снимите переднюю часть головогруди (6С). Использование боковые разрезы, чтобы удалить боковые части панциря, которые охватывают жабры, по обе стороны от оставшейся грудной клетки (фиг 6D-4). Удалить жабры и промыть образца с холодной физиологического раствора.
  10. Продолжить рассечение с разрезом по всей длине грудины пластину, как показано на рис 6Е-5. Сделать это сокращение на максимальных боковых позициях между pleuron и swimmerets (рис 6E красной маркировкой). Перейдите на другую сторону с одной и той же разреза. Промыть образец с холодной физиологического раствора.
  11. Выполните оставшиеся рассечение под dissectioп микроскоп. Поместите живота брюшной стороне раки в в рассечение блюдо выстроились с черным Sylgard и заполненной с раками физиологическим раствором так, чтобы она покрывала образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги (2.12-4.8) содержат направленные инструкцию для правшей экспериментаторов. В следующих шагах (2.12-6.8) важно, чтобы заменить раков физиологический раствор равномерно, каждые 20-30 мин в холодной солевой раствор, чтобы сохранить нервную систему здоровой.
  12. Закрепите образец булавками насекомых сзади на тельсона и вперед на остатки панциря. Поместите образец, так что тельсона точки слева и параллельно краю стола.
  13. Используйте грубые щипцы в левую руку, чтобы схватить через отверстие ходьба ног (рис 7А) и потяните образца открытый (7В белая стрелка). Определить большие два спинных сгибателя пряди (рис 7b-1 и С-1) и сократить свои вентральнойосновы, как показано на фиг.7В.
  14. Определить грудины артерии (7С-2), которая спускается от спинного (сердца) к брюху, на 4-й грудной сегмент. Это артерия находится прямо над нерва мозга (7С-3), прежде чем она проектов в рамках нервной цепочки, образуя вентральный артерии.
  15. Трансекта грудины артерии. Как показано на рисунке 7С, поднимите артерии во-первых, с помощью одного лезвия ножниц, и только вырезать, когда вентрально находится нервный тяж видна.
  16. Закрепите спинной сгибателей спереди (с правой стороны). Это должно быть сделано в максимально вытянутом положении булавками, чтобы они не загораживать обзор и образец остается растягивается. Когда спинной мышцы пряди крепятся (8-1), первый брюшной ганглий, A1 и A2, с соответствующими нервами N1, N2, и N3 могут видеть (рисунок 8).
  17. Используйте пинцет, в левой руке, чтобы захватить спецификацииИмен на одном открытия ходильных ног. На протяжении следующей вскрытия шаги осторожно потяните, чтобы сохранить образец открытой.
  18. Трансекта нервы N3 в самой отдаленной позиции от нервного тяжа. (Рисунок 8-3).
  19. Сокращение мышц сгибателей, близкие к вентральной аподеме, как показано на рисунке 8-4. Позаботьтесь, чтобы не повредить нерв шнур или N2 нервы.
  20. Повторите шаги 2,18 и 2,19 для N3 нервов и мышц сгибателей оставшегося брюшной ганглиях A2 до A5.
  21. На последнем брюшной ганглий, A6, вырезать спинной сгибателей из брюшной аподеме и образец должен выглядеть так, как показано на рисунке 9.
  22. Вырезать грудины пластину кзади от нервов A6 (9-1) и держать брюшную часть (9-2). Откажитесь от спинной части с сгибателей (рис 9-3). Fix грудины пластину вперед с контактами через отверстия в ходильных ног,и сзади А6.

3. Точная Вскрытие

  1. Поместите образец под микроскопом с передней части, направленной в сторону и задней части к краю таблиц.
  2. Используйте пинцет, как показано на рисунке 10А для удаления наиболее передних отделах cephalothoracic Sterna.
    ПРИМЕЧАНИЕ: грудных ганглиев и связанных с ними нервы частично покрываются за счет мускулатуры ног и cephalothoracic Sterna. Cephalothoracic Стерна образуют скелет, который отделяет боков, расположенных полостей ходильных ног друг от друга и от медиальной полостью, в которой брюшной нервной проживает.
  3. Сокращение мышцы между оставшимися экзоскелетонных структур, как указано на рисунке 10B-1 и В2. Используйте пинцет, чтобы захватить и поднять передний конец брюшной нервной (рис 10С).
    ПРИМЕЧАНИЕ: нервный тяж будет поврежден в процессе таким образом избежать поднимая NERVе шнур несколько раз.
  4. Разрежьте грудной нервы боков, одновременно поднимая нервный тяж (рис 10C-3). Храните эти нервы на подходящей длины для закрепления. Удалить выжатый часть цепочки ганглиев, который был подобран с пинцетом, путем срезания все ткани кпереди Т4 (рис 10C-4).
  5. Поместите образец с передней части слева и сосредоточиться на А1. Отрежьте N1 нервы и N2 A1 на подходящей длины (макс. 1 см) для закрепления их.
  6. Сосредоточьтесь на A2 и определить нервы N1, N2, и N3 этого сегмента (рисунок 11). Нервы N1 брюшной ганглиев А2-А5 находятся между двумя грудных кутикулы infoldings в каждом сегменте (рис 11A-1) и покрыты мускулатуры. Сделайте один разрез вдоль задней грудины кутикулы клубящийся. Начало в поперечной кромки живота и приступить к средней линии, как показано на рисунке 11А.
  7. Если цель N1-прежнему бухтакрасный с тканью, как показано на рисунке 11B (красная стрелка), вырезать по мышечного пучка, но на этот раз впереди оба грудины кутикулы infoldings и нервов N1 (рис 11B-2).
  8. Сокращение нерва N1 в дистальном направлении, насколько это возможно (рис 11C-3). Нерв N1 является полностью видны и передняя и задняя ветвь может быть идентифицирован (рис 11C).
  9. Перейдите к противоположной нерва N1 и в первую сократить мышцы вдоль задней грудины кутикулы клубящийся, начиная медиально, недалеко от ганглия (рис 11d). Если нерв еще покрыты тканью, разрезать поперек мышечного пучка, но на этот раз впереди оба грудины кутикулы infoldings и нервов N1, как на рисунке 11B-2. Перерезать нерв N1 в дистальном насколько это возможно.
  10. Вырезать нервы N2 этого ганглия до нужной длины (ок. 0,5 см) для закрепления.
  11. Повторите шаги 3.7-3.11 для нервов A3-A5.
  12. Вырезать нерVES ганглиозных A6, как дистально, как это возможно (рис 12а). Используйте пинцет, чтобы захватить несколько нервы A6 поднять эту ганглий и изолируют цепи ганглиев от грудины пластины.
  13. Поднимая нервный тяж, осторожно потяните ее в передней направлении, как показано на рисунке 12B (белая стрелка). Как отдельные ганглии сняты, удалить вентральной артерии, что может быть присоединен к брюшной стороне нервной цепочки (рис 12С). Продолжайте эту (мягко) тянуть-Cut последовательность до тех пор, нервный тяж не полностью изолированы.
  14. Передача изолированных цепь ганглиев на чашку Петри выложены прозрачного Sylgard и наполненной раков физиологического раствора (рис 12D).

4. Закрепление нервных шнура питания в чашке Петри

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте небольшие булавки, вырезанные из нержавеющей стальной проволоки (см добавок), чтобы прикрепить нервный тяж. Только прикоснуться к нервным окончанием пинцетом и не SqueezЕ связок или ганглиев.

  1. Прикрепите цепь ганглиев прямой линии, в то время как применение нежный участок.
  2. Упорядочить нервный тяж в чашку Петри с спинной стороной вверх (рис 13, черная линия). Брюшная сторона ганглиях, можно определить по его выпуклости; спинной стороны плоская. Pin грудной нервы сторон. Продолжить с нервами A6, растягивая нервных шнура вдоль своей продольной оси.
  3. Разъем для нервов A1 на 90 ° по отношению к нервной цепочки.
  4. Перейдите к A2 и прикрепить N2 нервы под углом 35-45 ° по отношению к нервной цепочки (рис 1А).
  5. Отделите нервы N1 в их переднюю и заднюю ветви до закрепления как показано на рисунке 14. Используйте две пары тонких щипцов, чтобы забрать с одной парой щипцов передней и другой на задней ветви нерва N1. Будьте осторожны, чтобы выбрать только наиболее дистального концас нервных ветвей. Теперь потяните их тщательно друг от друга.
  6. Прикрепите переднюю ветвь нерва N1 в 90 ° по отношению к нервной цепочки (рис 1А). Прикрепите заднюю ветвь нерва N1 между передней N1 отрасли и нерва N2.
  7. Повторите шаги 4.4-4.6 для нервов ганглиев A3-A5. Хотя фиксации нервных шнур растянуть его в продольном, так и поперечном направлениях.

5. Desheathing ганглиях

  1. Поместите препарат таким образом, что руки экспериментатора всегда опираясь на стабильном плоскости, чтобы избежать тряски. Для того, чтобы desheath ганглиях осветить нервный тяж снизу.
  2. Сосредоточьтесь на любой брюшной ганглий A1 до A5. Используйте прекрасным весенним ножницы, чтобы сделать небольшой боковой разрез через ганглий оболочки, позади ганглия и между нервы N2 и N3 (15А красная стрелка).
  3. Возьмите ганглиев оболочку, используя очень Fап пара та щипцы и вырезать поперек над связок влагалища, как показано на рис 15A-1. Будьте осторожны, не сжимайте и не перерезать нерв шнур с ножницами.
  4. Все еще ​​держа и подъема ганглиев оболочку с пинцетом продолжают сокращать его вдоль боковых границ ганглии (рис 15В-2 и -3). Снимите оболочку. В качестве альтернативы контактный его с обеих сторон связок таким образом, что она зафиксирована, но нерв шнур не сжатом.
  5. Повторите шаги 5.2-5.4 для всех брюшной ганглиях A1 до A5.
  6. Desheathe грудной ганглий и ганглии A6 подобным способом. Для того, чтобы desheathe A6 начала кпереди ганглии и перейти в заднем направлении. Pin ганглии оболочку А6 до заднего конца цепи ганглиев.

6. внеклеточной записи с двигательных нейронов

  1. Соберите все инструменты и материалы, используемые для внеклеточных записей, показанных Iн Рис 16В и перечислены в дополнениях. Обзор установки записи показано на фиг.16А. Начать все электронного оборудования, используемого в этом эксперименте (рис 16С), так что усилитель может прогреться в течение, по крайней мере 30 минут до записи. Включите компьютер и запустите программное обеспечение для записи.
  2. Поместите цепь ганглиев на столе микроскопа и освещают снизу. Вставьте записи электрод в Sylgard близко к цели нерва и электрода сравнения в положении рядом, но на боковой ганглиев (рис 17A и B). Согните целевой нерв вокруг записи электрода (рис 17С).
  3. Стретч нерв чуть-чуть, чтобы обеспечить контакт между электродом и нервом и вывод его на стороне (F igure 17D). Закрепите кабели электрода стола микроскопа с помощью пластилина, поэтому они остаются в нужном положении.
  4. Используйтешприц, наполненный вазелина и 20 иглы (с закругленным кончиком) (рис 17E-3), чтобы изолировать целевой нерв от растворе ванны. Во-первых тыкать некоторые вазелин на Sylgard вокруг регистрирующего электрода. В результате слой вазелина охватывающий Sylgard в непосредственной близости от регистрирующего электрода (фиг 17E-4). Будьте осторожны, не непосредственно промокните на нерв и избежать воздушных пузырей в этом слое.
  5. Уплотнение записи электрод с вазелином со всех сторон до уровня поверхности солевого раствора (рис 17F).
  6. Повторите эту процедуру для всех целевых нервов, чья деятельность должна контролироваться.
  7. Начало записи. Используйте непрерывную или разрыв свободный режим приема, и частоту дискретизации 5 кГц. Установите внеклеточный усилитель к следующим параметрам; получить в 1000 (усиливает сигнал 1000 раз, позаботиться, чтобы включить этот параметр усиления в настройках программного обеспечения приобретения)да полосовой фильтр от 300 Гц (НЧ) до 2000 Гц (High Cut).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При одновременном внеклеточных записей с РС и ПС, моторных нейронов одного ганглия, переменный активность этих бассейнов двигательных нейронов, можно контролировать (рисунок 18), представляющая собой фиктивную картину передвижения.

Рисунок 18
Рисунок 18: Схема одного ганглия и размещения дифференциального контактный электрод внеклеточной записи RS двигательных нейронов (верхняя кривая) и PS моторные нейроны (нижняя кривая)..

Внеклеточный PS деятельность ипсилатеральном PS 2 в PS 5 моторных нейронов подчеркивает интересные аспекты межсегментного координации в swimmeret системы (рис 19а).

Во-первых, деятельность всегда начинается с PS взрыва в А5 (рис 19А, 4-й трассы) и волна возбуждения распространяется в передней направлении (<STRONG> Рисунок 19А, зеленая линия). Во-вторых, период (который является время, отсчитываемое от начала одного пакета в начале следующего пакета) в каждом сегменте остается постоянным (рис 19A, голубой стрелкой). Это верно, если поток информации от одного ганглия в следующем нетронутыми и экспериментальные условия не меняются.

В разных препаратах или в различных экспериментальных условиях периоды и взрыв длительности могут существенно различаться: от периодов 0,25 до 1 сек. Для того чтобы сравнить эти параметры между различными препаратами, они должны быть нормализованы, и графически в фазовом гистограммы (рис 19b). Это показывает третий интересный аспект шаблона двигателя: фаза-запаздывания между сегментами, межсегментных задержки, остается постоянным и не зависит от частоты ритма.

Для расчета фазового гистограмму, следующие измерения и расчеты neceмируется необходимый:

Во-первых, опорной трассы должна быть выбрана. Обычно мы используем PS след самого заднего ганглии (например, PS 5) в качестве эталона (будучи раз 0) для фазового гистограммы swimmeret ритма, записанного в нескольких сегментах (рис 19а) .Затем измерить период (в мс ) ритма от начала одной ПС 5 всплеска (время 0, рис 19А, оранжевый пунктир) в начале следующего пакета PS 5 (фиг 19А, голубой стрелкой) Не познее этот цикл, измерение задержки (в мс ) между началом PS 5 серии (время 0) и началом (Burst начала, рис 19А и В, оранжевые стрелки) и в конце (смещение Рисунок 19A и B, фиолетовые стрелки) из PS ворвались в каждом из других ганглиев , Поэтому вычислить фазовый начало и смещение для каждого пакета задержкам делятся на одновременное период. Эти измерения приведет к числового Values ​​между 0 и 1. В конце концов, построить эти значения в фазовом гистограммы, как показано на рисунке 19б.

Полученную фазу гистограммы (рис 19b) содержит информацию о рабочем цикле ПС пакетному сигналу в каждом сегменте. И операций между фазой отставание ~ 0,25 между соседними сегментами четко виден.

Рисунок 19
Рисунок 19: (А) Схема размещения электродов и внеклеточной записи ипсилатеральной PS 5 к ПС 2. (В) измерений и расчетов, необходимых для фазового гистограммы. Фаза гистограммы вычисляется из десяти последовательных вспышек (N = 10) показывает фазовую задержку между сегментами из ~ 0,25.

Для более продвинутых экспериментаторов, внутриклеточных записей с острыми микроэлектродов из дендритов моторных нейронов могут быть полезны. Мембранные потенциалыиндивидуального внутриклеточно, записанные нейроны PS автосалоне в фазе колебания с внеклеточно записанного деятельности всех PS двигательных нейронов одной и той же hemiganglion (рис 20, серых панелей). В качестве альтернативы, двигатель RS нейроны или интернейроны могут быть записаны внутриклеточно таким же образом (данные не показаны).

Рисунок 20
Рисунок 20:. Схема размещения электродов мембранного потенциала одной внутриклеточно записанного PS двигательного нейрона (верхняя кривая) колеблется в одной фазе (серых панелей) с внеклеточной записанного PS деятельности (нижняя кривая).

Для идентификации внутри клетки, записанных нейронов (интернейронов или моторных нейронов), клетки могут быть краситель заполнено помощью острых микроэлектродов и ионофорез (см обсуждение). На рисунке 21, два внутриклеточно краситель, заполненные нейроны PS двигателя представлены. Их вентральный somataрасположены кзади от основания нерва N1. Первичные нейритов выступает спереди (фиг 21B-2) и ветви в пределах боковых нейропиля (рис 21А и В-3); Аксон проекты через заднюю ветви нерва N1 к swimmeret мускулатуры (рис 21B-4).

Рисунок 21
Рисунок 21: () Схема брюшной ганглий (B) Два внутриклеточно окрашенных моторные нейроны PS.. (1) somata; (2) первичные невриты; (3) дендритных ветвлений в боковой нейропиля; (4) аксоны проекта через заднюю ветви нерва N1; Бар = 100 мкм.

Для менее развитых экспериментаторов, или тех, кто хочет изучить морфологию брюшной ганглий, backfills от PS и моторных RS нейронных пулов через нервные N1, являются интересным упражнением. На рисунке 22, РС и ПС моторные нейроны одного hemiganglion окрашивали Co 2+ (RS) и Ni 2+ (PS), соответственно. Somata ПС двигательных нейронов расположены кзади от основания нерва N1 (рис 22-1). Все somata из RS двигательных нейронов расположены кпереди от основания нерва N1 (рис 22-2).

Рисунок 22
Рисунок 22: Backfills от переднего (оранжевый, Co 2+) и задней (синий, Ni 2+) филиала нерва N1 (1) Somata ПС двигательных нейронов;. (2) somata моторных RS нейронов. Бар = 100 мкм.

Рисунок 3
Рисунок 3: Удаление когтей (1) и уроподы (2). Красные линии (1) и (2) показывают положение разрезов. Bar = 5 см.


Рисунок 4:. (А) животное возлагали вентральной стороне и фиксируется на тельсона (В) раков обескровлены через отверстие вильчатой ​​с холодным физиологическим раствором. Бары = 5 см.

Рисунок 5
Фиг.5 (A) обезглавливание и (В) удаление, идущих ног. Красные линии указывают положение разрезов. Бары = 1 см.

Рисунок 6
Рисунок 6: (A, B, C и D) Удаление передней и боковых частях головогруди. Е. Открытие брюшной полости вдоль боковой стороны.Красные линии (1), (2), (4) и (5) указывают позиции сокращений. (3) пищеварительная железа. Красные стрелки указывают на уже открытой брюшной полости. Бары = 1 см.

Рисунок 7
Рисунок 7: () образец схватил на открытии пешеходных ног (красные стрелки) (B) спинной мышцы нити (1) пересекаются в то время как образец открыт.. Белая стрелка изображает направление, в котором грудины пластина вытягивается. (С) Обзор брюшной полости с грудины артерии (2) и нервной цепочки (3).

Рисунок 8
Рисунок 8: Поперечный вид раков живота с фиксированным спинных мышц нитей (1) и грудных артерий (2); Красные линии (3) и (4) указывают положение разрезов. Брусья= 5 мм.

Рисунок 9
Рисунок 9: спинной и брюшной части живота отделены друг от друга (1) Красная линия показывает положение среза.. Sternal пластина (2) с брюшной нервной; спинной части брюшной полости (3).

Рисунок 10
Рис. 10:. (А) Позиции щипцов для удаления передней cephalothoracic Sterna (B) Красные линии (1) и (2) показывают, где резать мышцы между остальными cephalothoracic Sterna (в) грудной нервы пересекаются в красные линии (3), чтобы изолировать грудных ганглиев от окружающих тканей. Красная линия (4) показывает разрез между Т3 и Т4. Бары = 5 мм.


Рисунок 11: (А и Б) Посмотреть грудины пластины на А2. Нерв N1 выделяют из ткани с разрезом вдоль задней грудины кутикулы клубящийся (1) и передней для обеих грудины кутикулы infoldings (B 2). (C) Высшее увеличения области вокруг А2, с изолированным нерва N1. ( D) Выделение нерва N1 на контралатеральной стороне с аналогичными сокращений. Красные линии (2) и (3) указывают положение разрезов; (1) передний и задний грудины кутикулы infoldings; Бары = 5 мм.

Рисунок 12
Рисунок 12: (А и В) A6 выделяют из ткани и нервной цепочки может быть поднят на нервах A6 (С). (D), изолированных нервных шнур переносят в чашку Петри выстроились с четким Sylgard и наполнен физиологическим раствором. Красные линии указывают положение разрезов. Бары = 5 мм.

Рисунок 13
Рисунок 13: Вид сбоку одной ганглий идентификации спинного и брюшной стороне (черная линия) нервного мозга.. Бар = 5 мм

Рисунок 14
Рисунок 14: Передняя ветвь нерва N1 отделена от задней ветви бар = 5 мм..

Рисунок 15
Рисунок 15: Направления desheathing брюшной ганглий () положение первого небольшого надреза по оболочке связок (красная стрелка), расположенный боковая и задняя на ганглии. Последующее прорезать выше соединительной оболочки отмечен красной линией (1). (B) Красные линии (1) и (2) Добавить разрезы вдоль боковых границ ганглии. Оболочка может впоследствии быть вытащил из ганглия. Полоски = 1 мм.

Рисунок 16
Рисунок 16:. () Обзор настройках записи (B) Материалы и инструменты, необходимые для внеклеточных записей. C. Оборудование, необходимое для электрофизиологических записи. (1) холодный источник лампы; (2) Клетка Фарадея; (3) стерео микроскоп; (4) воздушно-столик; (5) микроскоп столик; (6) Зеркало; (7) дифференциального контактный электродов; (8) шприц, наполненный нефтижеле; (9) лепка из глины; (10) Щипцы; (11) утилизация жидких отходов; (12) дигитайзер; (13) внеклеточный усилитель; (14) компьютер, оснащенный программным обеспечением для записи и монитора.

Рисунок 17
Рисунок 17: (А и Б) Положение записи (1) и опорный (2) контактный электрод. (C и D) Задняя ветвь нерва N1 является огибают регистрирующего электрода. Е. основание (4) регистрирующего электрода изолирован вазелином. F. полное записи электрод изолирован вазелином из раствора ванны. (3) шприц с вазелином. Бары = 2 мм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анатомия рака и их животе ганглии было описано ранее 5, 18, ​​19, 20, и рекомендуется, чтобы ознакомиться с ними до вскрытия для того, чтобы избежать сокращения важных нервов.

Очень важно, чтобы препарат при температуре ниже 23 ° C для предотвращения деградации изолированной нервной цепочки. Это может быть достигнуто легко путем замены растворе ванны каждые 20-30 мин холодной раков физиологического раствора. В этих условиях цепь ганглиев может использоваться для электрофизиологических экспериментов в течение 12 ч.

Иногда swimmeret моторные нейроны неактивны и не показывают спонтанное разрывной деятельности. Холинергических агонистов карбахол используется, чтобы вызвать разрывной активность в этих препаратах. Растворенного в холодной раков солевым раствором, ванна приложения 1-3 мкМ карбахола достаточно, чтобы активировать swimmeret ритм 21.

ove_content "> фиктивный передвижения и особенно координации конечностей, записанных в этой системе обеспечивают много информации о сотовых свойств ритмической активности и координации. В этой системе нейронов компоненты 8-10 из местных микросхем идентифицируются и дополнительно координации сети известен в сотовой подробно 11,14,15. Результаты взяты из экспериментов, выполненных с внеклеточной записей, позволяют уже прогнозы на математических моделях, так и для робототехники.

Все swimmeret нейроны показывают дендритных разветвлений в пределах боковых нейропиля и может быть записано внутриклеточно из этих дендритов. На фиг 20, внутриклеточной регистрации в PS двигательного нейрона показано. Для этого резкий микроэлектродом (см добавок), заполненной 1 М Каца + 0,1 М KCl (сопротивление электрода между 35 - 45 МОм) помещается над боковыми нейропиля. Колеблющиеся мембранных потенциалов, как WELL шипы из дендритов PS и RS моторных нейронов могут быть записаны, когда электрод вставляется у основания нерва N1.

Для окрашивания отдельные нейроны (например, двигательные нейроны) внутриклеточно, как показано на рисунке 21, острый микроэлектрод должны быть дополнительно наполнен флуоресцентного красителя (например, 1% декстрана Texas Red см добавок), растворенного в 1 М Каца + 0,1 M KCl. Чтобы заполнить двигательные нейроны внутри клетки путем ионофореза, поляризационные импульсы 1 нА с длительностью 250 мс при 2 Гц, применяются, по крайней мере, 10 мин. Для положительно заряженные красители использовать деполяризующими импульсов и для отрицательно заряженных красителей использовать гиперполяризационные импульсов. Более длинные заливки приводить к более сильному надписью нейрона. Для визуализации нервов провод должен быть закреплен, обезвоженной, и установлен 22.

Один из способов, чтобы окрасить бассейн моторных нейронов является использование backfills от нервного N1 (Рисунок 22) 4, 23, Поставьте хорошо вазелина вокруг задней ветви нерва N1 в обратной засыпки пул PS моторных нейронов. Для окрашивания пул двигателя RS нейронов и помещают на передней ветви нерва N1. Раки солевой в колодце заменяется DDh 2 O. Затем вырежьте этот нерв внутри скважины и оставить на 15 мин в DDh 2 O при комнатной температуре (RT). После этого, замените DDh 2 O в скважинах с любым 5% CoCl 2 - или 5% NiCl 2 - раствор (растворенного в DDh 2 O) и близких скважин с вазелином. Образец должен быть инкубировали в течение по меньшей мере 15 ч при 4 ° С. Откройте скважин, удалите краску и промыть образца 3 раза солевым раствором. Осадить Ni 2+ или ионы Со 2+ с 10 капель Dithiooxamid (насыщенный раствор ют в 100% этаноле) на каждые 10 мл раков физиологический раствор в чашки Петри, под капотом в течение 20 мин при комнатной температуре. Ni 2+ - ионы осаждаются на синий Ni (SCH) и Co 2+

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы благодарим Jos Бургерт за помощь некоторые цифры. Мы благодарны Инго Selbach (и группы "Edelkrebsprojekt NRW") за его усилия на поставку в лабораторию с экспериментальными животными. Мы благодарим Анну К. Шнайдер за вычитку первые версии рукописи. Это исследование было поддержано грант Эмми Нётер DFG SM 206 / 3-1 и запуска гранта университета Кельна для женской факультета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-channel extracellular amplifier: MA 102  Amplifier Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany
air-table Technical Manufacturing Corporation
(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA		 63-534
Axon Digidata 1440A Digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA DD1440A
big bucket 
Clampex & Clampfit pClamp 10, recording and analysis software Molecular Devices Design, Union City, CA pClamps 10 Standard
cold lamp source with flexible light guide (fiber optic bundle)  Euromex microscopes holland, Arnhem, BD LE.5211 & LE.5235
computer and monitor equipped with recording software
container and pipette for liquid waste 
crayfish saline  contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. 
dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) fluorescent dye, lysine fixable Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany D3328
dissection dish  (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone
faraday cage
fixing pins
forceps (biology, Dumont #5) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11252-20
forceps (biology, Dumont #55) Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11255-20
forceps (electronic, Dumont #5) Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX Fine Science Tools (FST), Germany 11251-20
intracellular electrode Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament Sutter Instruments, Novato, CA BF100-50-10
Leica S8 Apo StereoZoom Dissection Microscope                       Zoom 1x - 8x Leica, Germany 10446298
microscope table
mirror to illuminate preparation from below
modeling clay
Olympus SZ61 Dissection Microscope                       Zoom 0.67x - 4.5x Olympus, Germany
petri dish  94 x 16 mm; lined with clear silicone Greiner bio-one, Germany 633180
ring scissors ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm Fine Science Tools (FST), Germany 14054-13
spring scissors or alternative: Vannas spring scissors cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm Fine Science Tools (FST), Germany 15024-10 or          15000-08
student Vannas  spring scissors or alternative:  Moria Spring Scissors cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm Fine Science Tools (FST), Germany 91500-09 or           15396-00
sylgard 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon Dow Corning, Midland, MI, USA
syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
  2. Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).
  3. Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
  4. Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
  5. Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
  6. Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
  7. Huxley, T. H. The crayfish: An introduction to the study of zoology. , MIT Press. Cambridge, MA. (1980).
  8. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
  9. Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
  10. Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
  11. Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
  12. Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
  13. Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
  14. Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
  15. Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
  16. Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
  17. Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
  18. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
  19. Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
  20. Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
  21. Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
  22. Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts - Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
  23. Altman, J. S., Tyrer, N. M. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. Strausfeld, N. J., Miller, T. A. , Springer. New York, NY. 373-402 (1980).

Tags

Нейробиология выпуск 93 ракообразных рассечение внеклеточный записи фиктивный передвижения двигательные нейроны передвижения
Swimmeret Система Раки: Практическое руководство для рассечения нервной цепочки и внеклеточной регистрацию структуры Motor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seichter, H. A., Blumenthal, F.,… More

Seichter, H. A., Blumenthal, F., Smarandache-Wellmann, C. R. The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern. J. Vis. Exp. (93), e52109, doi:10.3791/52109 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter