Introduction
Eine Vielzahl von Säugetier-Proteine sind stark durch die Wirkung von Enzymen nach der Biosynthese von Proteinen durch das Ribosom modifiziert. Diese post-translationale Modifikationen (PTM) kann die Funktionsvielfalt des Proteoms stark erhöhen, indem Sie die Größe, Ladung, Struktur und Oligomerisierungszustand (neben weiteren Funktionen) von Proteinen 1-3. Als Ergebnis kann die Änderung in der Proteinstruktur zu physiologischen Folgen, wie Protein-Abbau, Zelldifferenzierung, die Signalisierung, die Modulation der Genexpression und Protein-Protein-Wechselwirkungen führen. Obwohl diese Modifikationen sind weit verbreitet in einer großen Prozentsatz aller menschlichen Proteine, die Anschlußenden von Histonen eine ungewöhnlich hohe Anzahl von kovalenten Modifikationen 4 unterzogen. Histon-Proteine sind eine Familie von Strukturproteinen, die die Kondensation von genomischer DNA erleichtern. Kovalente Modifikationen der unstrukturierten Histone werden durch eine Serie durchgeführt und geregelts von Enzymen, die die kovalente Modifikation von Rückständen (Schriftsteller) katalysieren können, kehren Sie die gleichen Modifikationen (Radiergummis) und unterscheiden zwischen den Veränderungen, die auf die Histon-Enden (Leser) 5-7 druckt. Tatsächlich sind die meisten der bekannten PTMs kann innerhalb dieses kurzen Segment des Histon einschließlich Methylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, sumoylation, Ubiquitinierung und Citrullinierung 8 beobachtet werden.
Citrullinierung beinhaltet die Umwandlung von Peptidyl-Arginin in den nicht t-RNA kodiert Peptidyl-Citrullin (1A). Die Proteine, für diese Seitenketten Neutralisierung verantwortlich sind Mitglieder der PAD (p eptide eine rginine d eiminase) Proteinfamilie, die alle calciumabhängigen Enzymen. 9,10. Bisher fünf Mitglieder der PAD-Familie beschrieben (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 und PAD6). Jedes Mitglied dieser Familie scheint deutliche zelluläre Zielproteine und zeigt auch unique Gewebeverteilungsprofile. PAD4 ist das einzige Mitglied dieser Proteinfamilie bekannt, innerhalb des Kerns über eine Kernlokalisierungssequenz 11 lokalisiert werden. Dementsprechend wurde gezeigt, um eine Anzahl von Kern Ziele, einschließlich Arginin-Seitenketten an den N-Termini von Histonen H2A Argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 und H3R26) und H4 (H4R3) 12 deiminate, 13. Während jede der PAD-Isoenzyme haben spezielle und kritische physiologische Funktionen hat PAD4 erheblich mehr Aufmerksamkeit aufgrund seiner Rolle bei einer Anzahl von menschlichen Prozesse sowohl in kranken und gesunden Zellen erhalten. Vor kurzem wurde gezeigt, PAD4 Mitglied der Pluripotenz Transkriptionsnetzwerk 14 ist. Beide PAD4 Expressionsniveaus und Aktivität wurde gezeigt, dass während der Umprogrammierung und Grundzustands pluripotenten Zustände bei Mäusen erhöht werden. Durch die Steuerung der Regulierung der Stammzellen Genen kann PAD4 eine zentrale Rolle in der zellulären Anpassung Effizienz beizubehalten. PAD4 wurde auch in den in Verbindung gebrachtBildung von neutrophilen Extracellular Traps, die bei der Bindung von Krankheitserregern ermöglichen ihr System-Clearance. Die hypercitrullination von Histon-Proteinen durch PAD4 induziert Dekondensation des Chromatins, die als Basismaterial für die Verkapselung von pathogenen Bakterien, die durch die extrazelluläre Falle dient, wodurch die Abwehr von bakteriellen Infektionen 15,16.
Zusätzlich PAD4 wurde gefunden, daß eine aktive Rolle bei einer Reihe von Krankheiten beim Menschen spielen. Es wurde zuvor gezeigt, dass aberrante Expression PAD4 wird mit dem Beginn und die Schwere von rheumatoider Arthritis, Alzheimer, Parkinson-Krankheit und Multiple Sklerose 17. In der Tat ist die Anwesenheit von Anti-Protein-Antikörper citrullinated ist einer der verlässlichsten und definitive diagnostische und prognostische Biomarker von rheumatoider Arthritis 18. Ebenso hat dysreguliert PAD4 Aktivität kürzlich in einer Reihe von menschlichen Krebsarten, einschließlich Eierstock-, Brust-, Lungen-, einer beobachtetd Speiseröhrenkrebs 19-22. Die Verbindung zwischen PAD4 und Krebs wurde gezeigt, dass durch die ELK1 Onkogen oder über das p53-Tumorsuppressor-Protein 22,23 vermittelt werden und frühere Arbeiten vorgeschlagen, PAD4 konnte eine neuartige Anti-Krebs therapeutisches Ziel 17,24,25 sein. Als Beweis des Prinzips Studie wurde die Erschöpfung der PAD4 über shRNA in kolorektalen Krebszelllinie HCT116 ergab ausreichend zur Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest 26 zu sein. Eine kürzlich entwickelte irreversible PAD4 Inhibitor zu einer siebzig Prozent Reduktion der Tumormasse bei Mäusen 27. Bemerkenswerterweise erschien PAD4 Hemmung als zielgerichtete Therapie, die in selektiven Abtötung von Krebszellen führte unter Schonung nicht transformierten Zellen wirken.
Die Verwendung von kleinen Molekülen zum Ausschalten der Funktion PAD4 könnte sich als eine leistungsfähige neue Strategie gezielt Krebszellen oder an bestehende Krebschemotherapeutika 28 erweitern können. Leider ist ein poZelt reversible PAD4 Inhibitor wurde noch entdeckt zu werden. Eine Reihe von kovalenten Inhibitoren mit der Chlor / Fluor imidine Griff, die Arginin Substrat 27,29,30 nachahmt und haben sich als praktische Instrumente für das Verständnis der Rolle der PAD4 sowohl bei gesunden und kranken Zustand Zellen entwickelt. Allerdings sind diese Moleküle inhibieren alle aktiven Pads mit ähnlicher Potenz. Daher ist die Notwendigkeit für einen einfachen Test, der auf die Aktivität des PAD4 berichtet entscheidend. Bisher wurden PAD4 Assays beschrieben worden, die die Freisetzung von Ammoniak aus der Reaktion auf einen kolorimetrischen Anzeige 31 zu verbinden, verwenden einen fluoreszierend markierten Substrates chloroamidine analog zur Fluoreszenzpolarisationsassay 32, sich auf die Säure-katalysierten Reaktion zwischen Glyoxal und Citrullin 33 und Koppeln der PAD4 Aktivität zu einer Fluoreszenz Dequenching Schritt 34. Davon sind nur die kovalente Modifizierungs haloacetamidine Strategie hat sich mit High-Throughput SCRE kompatibel zu seinkung Plattformen 32,35,36. Wir beschreiben eine einfache fluoreszenzbasierten Assays, die die Aktivität PAD4 misst zuverlässig. Der Assay, der ein starkes Signal-zu-Rauschverhältnis, die Geschwindigkeit der Analyse und Robustheit der Messung zeigt, hat das Potential, ein wirklich wirksamer und selektiver Inhibitor PAD4 entdecken.
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Protocol
1. PAD4 Transformation, Expression und Reinigung
- Für PAD4 Transformation, verwandeln den pGEX-Plasmid, das PAD4 GST-Fusions in chemisch kompetente E. Coli (BL21 (DE3)) Zellen zur Proteinexpression unter Verwendung des folgenden Verfahrens. Bereiten chemisch kompetente (Calciumchlorid) E. Coli (BL21 (DE3) Zellen) nach Standardprotokollen.
- Tau 50 & mgr; l eines zuvor hergestellten chemisch kompetente BL21 (DE3) Zellen auf Eis und mit 1 & mgr; l der Plasmid pGEX enthält PAD4 Gens in einer 5 ml-Kulturröhrchen gemischt. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 10 min unter leichtem Schütteln alle 2 min.
- Hitzeschock der Zellen, indem die Mischung in einem 42 ° C Wasserbad für 40 sec. Unmittelbar danach ist die Zell-Plasmid-Gemisch wieder auf Eis für 2 min, damit die Zellen sich zu erholen. 1 ml steriles LB-Medium zu der Mischung und auf Eis für 1 min.
- Inkubiere die Zellen einem Hitzeschock bei 37 ° C, unter Schütteln bei 250 rpm für 1hr. Je 75 ul der transformierten Zellen auf einer Ampicillin-resistenten Agarplatte und bei 37 ° C für 15 Stunden. Store Platte bei 4 ° C.
- PAD4 Expression.
- Wählen 1 Kolonie von BL21 (DE3) Zellen aus dem Ampicillin-Agar-Platte und in 5 ml LB aus 1x Ampicillin. Platz in Inkubator und schütteln O / N bei 37 ° C.
- Übertragen Sie die 5 ml LB (Starter) in 1 l sterilem LB aus 1x Ampicillintrihydrat (MW 403,45 g / mol). Ort Wachstum in einem 37 ° C Schüttelinkubator. Überwachen Sie die OD 600 des Wachstums. Wenn das Wachstum einer OD 600 von 0,3 erreicht, bewegen Wachstum in 16 ° C Schüttelinkubator.
- Bei Erreichen einer OD 600 von 0,6 induziert, die Zellen mit 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Sodass die Zellen 15 h bei 16 ° C geschüttelt.
- Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 xg für 20 min bei 0 ° C. Überstand abgießen und speichern Pellet bei -80 ° C.
- PAD4 Reinigung
- Re-suspendieren des Pellets, welches das exprimierte PAD4 in BL21 (DE3) Zellen in einem Puffer von 50 mM NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM Imidazol (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) und 1 mM Dithiothreitol (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0.
- Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung für 15 min bei 4 ° C. Folgende Beschallung, zentrifugieren Zelllysat bei 20000 × g für 20 min bei 0 ° C. Abgießen und den Überstand. Batch der Überstand mit Glutathion (GSH) Agaroseperlen für 30 min bei RT.
- Ablassen Stand von GST Perlen / Kolonne über die Schwerkraft. Mit 4 x 25 ml 1x PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH = 8,0) bei RT Waschen Perlen.
- Eluieren PAD4 mit 2 x 10 ml Elutionspuffer, 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM Glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0.
- Konzentrieren PAD4 mit 100k MW cut-off Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 4.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Aliquot Protein in 200 ul Volumen in 1,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C.
2. Vorbereiten Lizenzlösungen für Puffer
- Abwiegen Natriumchlorid (NaCl, MW 58,44 g / mol) und bereiten eine 2 M Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar.
- Abwiegen Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-Base, MW 121,14 g / mol) und bereiten eine 2 M Lösung, pH = 8,0. Mix-Lösung, bis sie klar.
- Abwiegen Calciumchloriddihydrat (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) und bereiten eine 500 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar.
- Abwiegen Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP, MW 250,19 g / mol) und bereiten eine 200 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C.
- Abwiegen Dithiothreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) und bereiten eine 1 M Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C.
- Vorbereiteneine 0,5% ige Lösung von Triton X-100.
- Abwiegen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, MW 292,24 g / mol) und bereiten eine 100 mM Lösung. Mix-Lösung, bis sie klar.
- Abwiegen Z- Arg- Arg- 7- amido- 4- methylcoumarin Hydrochlorid (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) und bereiten eine 10 mM Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO).
3. PAD4 Assay bei 37 ° C
- Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 125 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 125 um ZRcoum Lösung Lösung A sein
- Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT und 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein
- Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, und 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen
- Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20° C. Dies wird Lösung D. sein
- Besorgen Sie sich eine 96-Well-Platte und Benennung einer Anzahl von Vertiefungen für die Kontrollen (kein PAD4) und Aufschlussbohrungen (+ PAD4).
- Pipette 160 ul der Lösung B in Testbrunnen und Pipette 160 ul Lösung C in Kontrollvertiefungen. Inkubation für 15 min bei 37 ° C.
- Pipette 40 ul der Lösung A in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 45 min.
- Je 10 ul dH 2 O, die Hälfte der Kontrollvertiefungen und die Hälfte der Testschächte. Auf die andere Hälfte der Kontrollvertiefungen und Testkontrollen Pipette 10 ul Lösung D. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C.
- Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm.
4. PAD4 Assay bei RT
- Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 50 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 50 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein
- Bereiten Sie einen Puffer von 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 und 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein
- Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP und 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen
- Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung D. sein
- Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte und benennen Vertiefungen für Kontrollen (kein PAD4) und Aufschlussbohrungen (+ PAD4).
- Je 25 ul der Lösung B in Testbrunnen und Pipette 25 ul Lösung C in Kontrollvertiefungen. Ermöglichen Puffer mit / ohne PAD4 in Vertiefungen für 20 min bei RT inkubiert.
- Je 25 ul der Lösung C in alle Vertiefungen und Inkubation für 45 min bei RT.
- Je 10 ul dH 2 O, die Hälfte der Kontrollvertiefungen und die Hälfte der Testschächte. Um die andere Hälfte der Kontrollvertiefungen und Testkontrollen, pipettE 10 ul Lösung D. Inkubation bei RT für 10 min.
- Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm.
5. PAD4 Zeitverlauf Assays bei 37 ° C und RT
- Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 125 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 125 um ZRcoum Lösung Lösung A sein
- Bereiten Sie einen Puffer von 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT und 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein
- Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung C liegen
- Wobei 2 Platten mit 96 Vertiefungen und einer Pipette 160 ul der Lösung B in # Menge von Vertiefungen (# Vertiefungen wird, wie viele Zeitpunkten abhängen).
- Inkubieren einer 96-Well-Platte bei 37 ° C. Inkubieren Sie die anderen 96-Well-Platte bei RT.
- Pipette 40 ul der Lösung A in alle Vertiefungen in beiden 96-Well-Platten und sofort Pipette 10 ul Lösung C in die t = 0 min Brunnen. Fügen Sie weitere 10 ul Lösung C zu bestimmten Zeitpunkten, bis alle Vertiefungen wurden abgeschreckt.
- Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm.
6. PAD4 Inhibitionsassay bei RT
- Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 83 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 83 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein
- Abwiegen Cl-Amidin (MW 424,8 g / mol) und bereiten eine 100 uM Stammlösung. Dies wird Lösung B sein
- Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100 und 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dies wird Lösung C liegen
- Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP und 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Thist wird Lösung D. sein
- Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung E. sein
- Besorgen Sie sich eine 384-Well-Platte und benennen Vertiefungen für Kontrollen (kein PAD4), Testbohrungen (+ PAD4) und Hemmung Brunnen (PAD4 + Cl-Amidin).
- Je 25 ul der Lösung C in die Testbohrungen und Pipette 25 ul Lösung D in Kontrollvertiefungen. Ermöglichen Puffer mit / ohne PAD4 in Vertiefungen für 20 min bei RT inkubiert.
- Je 10 ul der Lösung B in Hemmung Vertiefungen pipettieren und für 20 min bei RTE.
- Pipette 15 ul Lösung A in alle Vertiefungen und Inkubation für 45 min bei RT.
- Je 10 ul Lösung E in alle Vertiefungen. Inkubation bei RT für 10 min.
- Erhalten ein Fluoreszenzmesswert auf einer multimodalen Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm.
7. Rohzelllysat Assaybei RT
- Nach Ernten der Zellen aus PAD4 1 L Wachstum, Zellen in 10 ml 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, MW 174,94 g / mol) und 1 mM Dithiothreitol (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0.
- Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung für 15 min bei 4 ° C. Zentrifugieren Sie die Zelllysat bei 20.000 × g für 20 min bei 0 ° C. Konzentrieren des klaren Überstandes auf das halbe Volumen durch Zentrifugation bei 4.000 rpm bei 4 ° C unter Verwendung von 100K MW cut-off-Zentrifugenröhrchen.
- Von 10 mM ZRcoum Lager, bereiten eine 250 uM Lösung von ZRcoum in Wasser. Diese 250 uM ZRcoum Lösung Lösung A sein
- Vorbereitung eines Puffers aus 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2 und 2 mM TCEP (pH = 8,0). Dies wird Lösung B sein
- Abwiegen Trypsin, kristallinen (aus Rinderpankreas) und bereiten eine 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Mix-Lösung, bis sie klar und bei -20 ° C. Dies wird Lösung C liegen
- Besorgen Sie sich einen schwarzen 384-Well-Platte und Designaß Vertiefungen für Kontrollen (kein Zelllysat) und Aufschlussbohrungen (+ Zelllysat).
- Je 100 ul der Lösung B in alle Vertiefungen und Pipetten 60 ul Zelllysat in Testbohrungen. Inkubation für 20 min bei RT.
- Pipette 40 ul der Lösung A in jede Vertiefung und Inkubation für 45 min bei RT.
- Je 10 ul der Lösung C in alle Vertiefungen. Inkubation bei RT für 10 min.
- Besorgen Sie sich eine Fluoreszenz Lesen auf multimodale Leser mit einer Anregungswellenlänge von 345 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm.
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Representative Results
Ursprünglich wurde gezeigt, dass ZRcoum kann auf die Aktivität des PAD4 in einer 96-Well-Plattenformat melden. Vertiefungen wurden mit dem Substrat ZRcoum und in der Gegenwart / Abwesenheit von PAD4 inkubiert. 475/15 nm-Filter (2A) - Nach einer Inkubationszeit von 45 min bei 37 ° C wurde die Fluoreszenz mit einem 340/40 gemessen. Wie erwartet, werden die Fluoreszenzniveaus niedrig blieb als Fluorophor innerhalb ZRcoum (oder der citrullinated ZRcoum) blieb im verriegelten Zustand. Nach Zugabe eines Überschusses von Trypsin / EDTA zu der Lösung waren die Fluorophore befreit von ZRcoum blieb jedoch weitgehend unverändert in Gegenwart PAD4. Die Zugabe von EDTA ist beabsichtigt, in dem Aufhören der PAD4 Reaktions unterstützen aufgrund ihrer Fähigkeit, die wesentlichen Calciumionen chelatisieren. Aus diesen Daten wurde eine 5,2-fache Abnahme der Fluoreszenzausgabe in Gegenwart PAD4 beobachtet. Als nächstes wird die Datei herunterladenatibility des neu entwickelten Assay mit hohem Durchsatz Plattformen wurde demonstriert. Es war von Interesse zu vier primäre Reaktionsvariablen, die am günstigsten für Screeningzwecke wäre Analyse (1) die weitere Miniaturisierung des Assay-Volumen (2) die Möglichkeit der Durchführung des Assays bei RT (3) die Stabilität des Proteins und Puffergemisch vor dem Abschluss der Assay und (4) das potenzielle Störungen von organischen Lösungsmitteln / Reinigungsmittel.
Für mittlere oder Hochdurchsatz-Screening Anstrengungen werden hohe Dichte und Platten häufig in kleinen Moleküls Bildschirmen verwendet. Es wurde bestätigt, dass der Test kann fast identisch in einer 384-Well-Platte im Vergleich zu einer 96-Well-Platte (2B) durchgeführt werden. In weiteren Bestimmung der Arbeitsbedingungen für den Test in einem Format mit hohem Durchsatz, war es wichtig zu untersuchen, ob PAD4 Aktivität kann in einem vernünftigen Zeitrahmen bei RT überwacht werden. Da nicht alle Liquid-Handling-Geräte habeneinen Temperaturregler, kann es umständlich und kostspielig, einen Inkubationsschritt bei erhöhter Temperatur geworden. Weiterhin entfallen Temperaturschwankungen kann eine Ursache für Diskrepanz zwischen Platten und läuft. Um den Effekt der niedrigeren Temperaturen für den hier beschriebenen Assays zu bestimmen, wurde ein ähnlicher Test bei RT durchgeführt. Es wurde gefunden, daß die Signale nahezu unverändert zwischen 37 ° C und RT (3) waren. Zur weiteren Optimierung der Assay-Leistung durch Minimierung der erforderlichen Inkubationszeit zwischen PAD4 und dem Substrat wurde die Kinetik der Reaktion untersucht. PAD4 Aktivität wurde im Laufe der Zeit sowohl bei Raumtemperatur und 37 ° C überwacht. Wie zu erwarten, zeigt sich, dass PAD4 ist bei 37 ° C (im Einklang mit der menschlichen physiologischen Temperatur) mit der Reaktion weitgehend abgeschlossen durch 20 min aktiver. Zufriedenstellend, die Reaktion nicht stark von der Verringerung der Temperatur auf RT beeinflusst. Die Reaktion läuft bei etwa der Hälfte der Geschwindigkeit bei dererhöhter Temperatur und im wesentlichen abgeschlossen ist 40-45 min nach Einleitung. Aus dem zeitlichen Verlauf analysiert wurden kinetische Konstanten berechnet, und die Parameter (K M = 397 & mgr; M, k cat = 2,98 s -1, k cat / K M = 7.400 sec -1 M -1) gefunden wurden ähnlich zu anderen PAD4 sein Substraten. 31 mit der Kinetik der Reaktion ist, wurden alle anschließenden Assays bis 1 h vom Beginn bis zum Messpunkt verringert.
Anschließend wurde die Stabilität der PAD4 wenn im Reaktionspuffer über einen längeren Zeitraum ausgewertet gelöst. Realistisch wird Hochdurchsatz-Screening-Reagenzien erfordern, dass in der Regel für viele Stunden stabil, während das Gerät die Vollendung des Bildschirms. Wenn bestimmte Reagenzien eine relative Haltbarkeit von Minuten, kann es ziemlich teuer und zeitaufwendig, um den Bildschirm, um frischen Reagenzien vorbereiten beenden. In Abhängigkeit von den Testbedingungen ist es nichtungewöhnlich für einige Assays unvereinbar mit Hochdurchsatz-Screening aus diesem Grund sein. Mit dieser Idee im Hinterkopf, wurde die Stabilität PAD4 in Puffer über mehrere Stunden überwacht. Fast keinen Verlust der enzymatischen Aktivität wurde während der gesamten Zeitdauer beobachtet, was anzeigt, daß das Protein selbst nach Stehenlassen bei RT über 15 h (4A) stabil. Als nächstes wurde untersucht, ob der Test unter Bedingungen und bei miniaturisierten RT laufen würde immer noch angemessen auf die Anwesenheit eines PAD4 reagieren. Nach der Inkubation der bekannten PAD4 Inhibitor chloroamidine (Cl-Amidin), führte zu einer vollständigen Wiederherstellung des Fluoreszenzsignals mit dem vollständigen Hemmung PAD4 (4B). Schließlich wurde auch überprüft, dass die Anwesenheit des organischen Lösungsmittels DMSO, üblicherweise in Vorratslösungen von kleinen Molekülen zu 3% Endvolumen verwendet, oben nicht mit dem Assay interferieren (Daten nicht gezeigt). Ebenso ist die Zugabe von 0,01% Triton X-100 in Folge simIlar Fluoreszenz Trends (Daten nicht gezeigt).
Nachdem gezeigt wurde, dass der Assay ist tolerant für eine Vielzahl von Bedingungen, die typischerweise in kleinen Moleküls Arzneimittelforschung angetroffen werden, wurde ein vorläufiges Screening von Verbindungen 80 durchgeführt und eine stabile Z "Wert von 0,71 ermittelt wurde. Bei der Förderung des Potentials des Assays wurde die Selektivität der PAD4 / ZRcoum Reaktion durch Durchführung der Reaktion in rohen Ganzzelllysaten hervorgehoben. E. coli Zellen, die das GST-PAD4 Expressionsvektor wurden mit IPTG, ähnlich dem für die Isolierung von GST-PAD4 verwendete Verfahren induziert. Nach der Zerstörung der Zellmembran durch Beschallung wurde die Zelltrümmer durch Zentrifugation abgetrennt, um eine geklärte Zelllysat zu erhalten. Wenn die PAD4 enthaltenden Zelllysats wurde den gleichen Testbedingungen wie das gereinigte GST-PAD4 Assay, Fluoreszenz-Signal in Übereinstimmung mit dem Vorhandensein aktiver PAD4 in Lösung (variiert eingereicht
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Abbildung 1 PAD4 und das Design der Fluoreszenz basierenden Assay. (A) Cartoon Darstellung der Histon-Baugruppen, aus denen die Grundeinheit einer Nukleosomen. PAD4 katalysiert die Citrullinierung einer Anzahl von Argininresten am Histon-Proteine. (B) ZRcoum überlagert mit dem nativen Substrat (aus Gründen der Übersichtlichkeit ausgeblendet) von PAD4 (Zugangscode 2DW5). (C) Darstellung der Schritte in einem typischen Assay PAD4. Citrullinierung durch PAD4 des Substrats ZRcoum reduziert seine Anfälligkeit für Trypsin-vermittelte Amidhydrolyse, wodurch eine Veränderung der Fluoreszenz Ebenen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Figur zu sehen.
Abbildung 2. PAD4 Assay in 96-Well und 384-Well-Platte-Formate. Die Fluoreszenz wurde gemessen (Anregung 345 nm / Emission 465 nm) sowohl in einer 96-Well-Format (A) und 384-Well-Format (B) mit den dafür vorgesehenen Bedingungen (37 ° C). Die Zugabe von Protease Trypsin führt zu einem großen Anstieg in der Fluoreszenz von in Vertiefungen ohne PAD4 und bleibt für die Vertiefungen mit PAD4 nahezu unverändert. Daten sind als Mittelwert + SD dargestellt (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Figur zu sehen.
Figur 3 Zeitlicher Verlauf der Analyse PAD4 Assay. Die Fluoreszenz wurde gemessen (Anregung 345 nm / Emission 465 nm) periodisch in einem 96-Well-Plattenformat über 70 min mit dem Protein, das entweder bei 37 inkubiert° C (A) oder bei RT (B). Die Daten sind dargestellt als Mittelwert +/- SD (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Figur zu sehen.
Abbildung 4. Proteinstabilität und Hemmung. (A) Die Aktivität PAD4 wurde nach den dafür vorgesehenen Zeitintervallen gemessen. Zum Vergleich werden die Fluoreszenzniveaus in Abwesenheit PAD4 dargestellt. Fluoreszenzniveaus vor (rot) und nach (grün) die Zugabe von Trypsin gezeigt. (B) Einleitung des bekannten PAD4 Inhibitor Cl-Amidin (100 uM) führte zu einer Wiederherstellung des Fluoreszenzsignals in einer 384-Well-Plattenformat bei RT. Fluoreszenzniveaus vor (rot) und nach (grün) die Zugabe von Trypsin gezeigt. Alle Daten sind represented als Mittelwert +/- SD (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Figur zu sehen.
Abbildung 5 Rohzelllysat Assay. Der Test wurde in Abwesenheit und Anwesenheit von Zelllysat in einer 384-Well-Plattenformat bei RT. Fluoreszenzniveaus vor (rot) und nach (grün) die Zugabe von Trypsin gezeigt. Cl-Amidin (100 & mgr; M) verursachte auch einen Anstieg in der Fluoreszenzsignal unter diesen Bedingungen. Alle Daten werden dargestellt als Mittelwert +/- SD (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Figur zu sehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | http://www.amresco-inc.com |
| Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
| Isopropylthiagalactonse (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| All Buffer Salts | Fisher Scientific | Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc. | |
| Protino Glutathione (GSH) agarose | Machery-Nagel | 745500.10 | Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/ |
| Chloroamidine | Cayman Chemical | 10599 | Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | www.sigmaaldrich.com |
| Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) | Purchase from Corning; Sigma-Aldrich | ||
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software | www.tecan.com | ||
| Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter | http://www.perkinelmer.com |
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