Abstract
Målet med fluorometrisk analys är att fungera som en effektiv, kostnadseffektiv, hög genomströmning metod för att analysera fagocytos och andra cellulära processer. Denna teknik kan användas på en mängd olika celltyper, både vidhäftande och icke vidhäftande, för att undersöka en mängd cellulära egenskaper. När man studerar fagocytos, utnyttjar fluorometrisk teknik fagocytiska celltyper såsom makrofager och fluorescerande opsoniserade partiklar vars fluorescens kan släckas i närvaro av trypanblått. Efter plätering av vidhäftande makrofager i 96-hålsplattor, fluorescerande partiklar (gröna eller röda) administreras och cellerna får fagocytera för varierande mängder av tid. Efter internalisering av fluorescerande partiklar, tvättas cellerna med trypanblått, vilket underlättar utrotning av fluorescerande signal från bakterier som inte är internaliserade, eller är enbart vidhäftar till cellytan. Efter trypan tvätt, tvättas cellerna med PBS, fixerades, ennd färgades med DAPI (kärnkraft blå fluorescerande märkning), som tjänar till att märka cellkärnor. Genom en enkel fluorometrisk kvantifiering genom platt läsning av nukleär (blå) eller partikel (röd / grön) fluorescens vi kan undersöka förhållandet mellan relativa fluorescensenheter av grönt: blått och bestämma en fagocytisk index som indikerar mängden fluorescerande bakterier intern per cell. Varaktigheten av analysen med hjälp av en 96-håls metod och flerkanalspipetter för tvätt, från slutet av fagocytos till slutet av datainsamling, är mindre än 45 min. Flödescytometri kan användas på ett liknande sätt men fördelen med fluorometri är dess hög genomströmning, snabb metod för bedömning med minimal manipulation av prover och snabb kvantifiering av fluorescensintensiteten per cell. Liknande strategier kan tillämpas på icke vidhäftande celler, levande märkta bakterier, aktin polymerisation, och i huvudsak alla processer som utnyttjar fluorescens. Därför är fluorometri en lovande metod för dess låga kostnader, hög throughpUT kapacitet i studiet av cellulära processer.
Introduction
Kvantifiering av fluorescerande signalen har ofta används i en mängd olika vetenskapliga metoder som spänner från PCR, flödescytometri, konfokalmikroskopi och FRET analyser att multiplexa ELISA. Fluorescens avbildning och kvantifiering har en bred tillämpning och kan vara ett bra verktyg för kvantitativ analys av olika cellulära processer. Användning av fluorescerande markörer och deras signal har revolution under det senaste decenniet, och uppkomsten av fluorescerande plattläsare har underlättat den höga genomströmningen kvantifiering av fluorescens som emitteras under cellulära processer.
Fluorometrisk analys kan fungera som ett bra verktyg i kvantifiering av fagocytos. Fagocytos har studerats sedan upptäckten av fagocyter från metchnikoff 1800 1. Under årens lopp har en mängd olika metoder använts för att undersöka denna viktiga process viktigt för medfödda immunförsvaret mot invaderande bakterier, virus, svamp och parasit patogener 2-5. Tidigare metoder för kvantifiering utnyttjad mikroskopi och stereologisk tekniker för att visualisera celler som phagocytosing, som sedan kvantifierade genom räkning av internaliserade partiklar (manuellt eller med användning av programvara) 6-8. Vissa nackdelar med att använda mikroskopi enbart för kvantitativ analys är att manuell räkning av bakterier är arbetsintensiv och mer benägna att observatörs partiskhet. En annan metod som används i kvantifiering av fagocytos är den mikrobiologiska tekniken med plätering av bakterier från cellysat (efter fagocytos) på bakterieodlingsplattor, men denna metod kan misslyckas med att redogöra för bakteriedödande mekanismer och förekomst av delvis interna bakterier. Denna metod är ännu mer arbetsintensiv jämfört med mikroskopi och tar flera dagar att analysera. Flödescytometri verkar vara den snabbaste, mest effektiva sättet att kvantifiera fagocytos och har använts av många grupper 9-11, men de höga kostnaderna som vanligtvis förknippas med istrument som behövs för analysen gör det den dyraste metoden jämfört med de tidigare nämnda analyser.
Den fluorometriska metoden är ett bra alternativ till flödescytometri för analys av partikelinterna eftersom det ger opartisk kvantifiering av fluorescens använda utrustning som inte är så kostnads oöverkomliga. Andra extra fördelar av fluorometri är hög effektivitet och hög genomströmning kapacitet för att kvantifiera fluorescens som avges av de märkta interna partiklarna.
Fördelar med fluorometri kan extrapoleras till kvantifiering av andra än fagocytos processer. Till exempel kan fluorometrisk analys tillämpas för att studera eventuella process som leder till förändringar i uttryck av intracellulära eller membranbundna receptorer, förändringar i cell permeabilitet / viabilitet, transfektion effektivitet, och modulering i aktin polymerisation. En nackdel med fluorometrisk teknik är att, beroende på vilka etiketter som används, kan det finnas en högexperiment experimentera variabilitet som vanligtvis kan lösas genom att visa data genom relativ kvantifiering, såsom faldig förändring eller procentig ökning från kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll kan användas för flera tillämpningar såsom kvantifiering av fagocytos och aktin polymerisation som används i våra tidigare publicerade arbeten 12. Protokollet lämpar sig för en mängd olika modifikation, och typer Tabell 1 listor cell och partiklar med framgång används i tidigare studier. Standard användning av detta protokoll för kvantifiering av fagocytos eller aktin polymerisation illustreras i diagram 1.
Diagram 1:. Diagram över fluorometrisk analys för kvantifiering av fagocytos och aktin polymerisation Efter cellerna pläterade, behandlas, och får följa, partiklar märkta med grön fluorescens (FITC) läggs till cellerna för fagocytos. Reaktionen stoppas genom trypan eller antibiörontvätt (för att eliminera icke-interna partiklar) och fixering utförs med 4% paraformaldehyd. Celler därefter färgas med röd fluorescerande aktin etikett (rhodamin phalloidin) och blått fluorescerande märkning (DAPI). Index för fagocytos och aktin polymerisation kvantifieras som ett förhållande mellan relativa fluorescensenheter av grönt / blått (FITC / DAPI), eller röd / blå (rhodamin / DAPI) fluorescens.
1. Plating och behandla celler
OBS: Innan du börjar, överväga att köra behandlingarna med minst fyra tekniska replikat, och inkludera följande kontroller i plattan layout: Endast celler (ofärgade, med DAPI ensam eller rodamin ensam) och partikel bara.
- Genomför alla tillsats av reagens i steg 1-4 i en steril cellodlings huva för att skydda proverna från föroreningar.
- Plate makrofager (murin J774 cellinje) i en 96-brunnars platta vid 1-5 x 10 4 celler i 50 | il (per brunn) av kompletterade förvärmd medier. Ideala plattor för denna metod är svarta 96-brunnars plattor med klara eller svarta bottnar, beroende på läsar kapacitet.
- För kompletterade media, använder 10% värmeinaktiv FBS för att undvika störningar av komplementkaskaden och 1% penicillin / streptomycin (om du inte använder levande bakterier för fagocytos). Om använder vidhäftande celler tillåter 1-2 h för vidhäftning, och för icke-adherenta celler, centrifugera ner plattan med celler i 10 min vid 500 x g.
- Lägg önskade agonister / antagonister eller vehikelkontroll vid 2x koncentration (återsuspenderades i PBS eller mer föredraget, i kompletterat medium) i 50 | il för en slutlig volym av 100 | il (1x) och inkubera under en önskad tid. Multikanalpipett och reagensbehållare kommer att underlätta snabbaste bearbetningen.
2. opsonisering av fluorescerande partiklar
ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg "width =" 500 "/>
Tabell 1: Testade celltyper och fluorescerande partiklar i fluorometrisk analys av fagocytos och aktin polymerisation Tabell 1 visar kombinationer av celltyper (cellinjer och primära celler) som vår grupp har använt via fluorometriska metoden.. Annat än att titta på fagocytos och aktin polymerisation av vildtypsceller, har vi också utnyttjat en del av dessa partiklar för undersökning av fagocytos av transfekterade celler som uttrycker en GFP (grönt fluorescerande protein). Fluorescens av cellerna transfekterade med plasmider innehållande fluorescerande reportrar kan också användas som en cellulär markör utöver DAPI Tabell legend:. A - aktin polymerisation; P - fagocytos; PT - fagocytos av GFP märkta transfekterade celler; OPDex - opsoniserad dextran vulst; HKOP - värme dödade opsoniserad.
- Säkerställ att fluorescerande partiklar och etiketter är skyddade från ljus vid alla tidpunkter, during bearbetning, tvätt, liksom under inkubationen för att förhindra fotoblekning
- För torra partiklar, väg upp fluorescerande värme dödade opsoniserad (HKOP) bakterier (E2861: E. coli K-12 stam), med hjälp av tillverkarens specifikationer. Var noga med att se till att de mass står för 10: 1 - 20: 1 bakterier: cellförhållande (eller åtminstone en 10: 1-förhållande - som vanligen används i kvantifiering av fagocytos) 13,14. Antal partiklar kan tillhandahållas av tillverkaren eller fastslås genom couting serieutspädningar av 1 mg / ml förrådslösning.
- Resuspendera i 50 pl PBS och vortexas i 1 minut vid högsta inställning. Säkerställa korrekt vortexa (här och i hela protokollet) eftersom partiklarna tenderar att aggregera som kan påverka effekten av opsonisering.
- För partiklar i suspension sådana som fluorescerande dextran pärlor (DEX pärlor), virvel stamlösningen under 1 minut, ta 50 pl suspension eller beroende på pärlan koncentrationen i volymen determine mount pärlor för att underlätta 10: 1 pärla: cellförhållande.
- Tillsätt en lika volym av opsoniserande reagenset till partiklarna och kraftfullt vortexblanda i ytterligare en minut.
- Inkubera partiklarna med opsoniserande reagens vid 37 ° C under 1 h.
- Efter inkubationen centrifugeras partiklarna under 5 min vid 500 xg, och avlägsna supernant innehållande överskott opsoniserande reagens. Tvätta partiklarna genom att tillsätta 100 | il PBS, till virvel suspendera pelleten, och centrifugatet i 5 min vid 500 x g.
- Upprepa dessa steg två gånger för att säkerställa korrekt opsonisering och avlägsnande av obundna antikroppar.
- Bered arbets lösning opsoniserad partiklar genom resuspending dem i 5 ml medium (tillräckligt för en 96-brunnar) och borta från ljus tills utöver cellerna.
3. Fagocytos
- Placera arbetslösning av partiklar i en steril reagensbehållare. Härifrån lägga 5056; il av opsoniserad partiklar till cellerna som framställts i steg 1 (för en slutlig koncentration på 50 ng / ml) och låt fagocytos inträffa vid standardcellodlingsbetingelser. Illustreras nedan finns två metoder för fagocytos som kan utvärderas med hjälp av denna metod (diagram 2).
Diagram 2:. Jämförelse av kontinuerlig kontra synkronisera fagocytos Kontinuerlig fagocytos indikerar kontinuerlig intemalisering av partiklar över tiden eftersom de långsamt nå cellerna på botten av brunnen. En kontrasterande synkroniseringssteget (centrifugering) tvingar partiklarna att sjunka till botten, vilket förbättrar partikel kontakt med cellen, och som leder till omedelbar intemalisering av cellerna. Synkroniserad fagocytos är en snabbare process som snabbare internaliserar delicles grund av ökad cell: partikelkontakt.
- För den kontinuerliga fagocytos metoden (diagram 2) som tillåter celler att kontinuerligt fagocytera opsoniserad bakterier som de sakta sjunka till botten och kommer i kontakt med celler, använda längre tidsramar för att möjliggöra för bakterierna att nå botten av brunnen och få in Rör med cellerna. Om genomföra ett tidsförlopp experiment, lägga bakterier vid olika tidsintervall och stoppa hela plattan av reaktioner samtidigt att öka hastigheten på behandlingen.
- För den synkroniserade fagocytos metoden (diagram 2) som förbättrar partikel: kontaktcell via centrifugering, spinn ner hela plattan innehåller celler och partiklar (5 min vid 500 xg) så snart som partiklarna läggs, för att underlätta synkronisering av alla tidpunkter och att påskynda partikeln: interaktionscell.
- Mät tidsförloppet startar direkt efter slutförandet av centrifugation steget. Om genomföra ett tidsförlopp experiment stoppa varje tidpunkt oberoende vid olika tidsintervall som beskrivs nedan.
OBS: Den synkroniserade fagocytos metod är något mera arbetskrävande från den föregående, men ger högre fagocytiska index i en kortare tid.
4. Stoppa Fagocytos
- För vidhäftande celler, avlägsna supernatanten och tillsätt 50 pl av utspätt trypanblått med PBS (1: 2 spädning), i syfte att släcka fluorescens av icke-interna bakterier.
- För icke-vidhäftande celler, centrifugera ner plattan och avlägsna supernatanten. Lägg 50 fil utspätt trypanblått. Se till att centrifugera plattan vid (5-10 min vid 500 xg) mellan varje tvätt, för att minimera cellförlust och möjliggöra adekvat tvättning.
- Efter trypan inkubation, tvätta cellerna två gånger med PBS för att avlägsna eventuellt kvarvarande trypan (tills PBS avlägsnas från brunnen blir klar). Trypan har visat att släcka fluorescens 15,16 av icke-internaliserade fluorescerande, värme dödades, bakteriella partiklar, men inte för levande bakterier eller OPDex pärlor. För levande bakterier, inkluderar en tvätt med antibiotika såsom penicillin, streptomycin eller gentamicin stället för trypan tvätt för att undvika felkällor effekter av fluorescens från icke-interna partiklar.
- Fix celler med 100 pl av 4% paraformaldehyd, och inkubera under 15 minuter vid rumstemperatur, tvätta sedan med PBS (vid 100 | il per brunn för varje tvätt). Vid detta steg, spara cellerna vid 4 ° C i upp till en vecka, eller fortsätta direkt till färgning och kvantifiering.
NOTERA: Alla de efterföljande stegen att bilda denna punkt förord kan göras utanför cellkultur huva. - Avlägsna all vätska och tillsätt 50 | il DAPI vid 5 ng / ml rekonstitueras i PBS. Låt 5 min för färgning, och sedan tvätta två gånger med PBS. Efter tvättningssteget, tillsätt 50 | il av PBS till varje brunn och spela in fagocytos.
5. Actin Färgning
OBS: Förutom fagocytos kommer fluorometrisk metod möjliggöra kvantifiering av aktin polymerisation genom att mäta intensiteten av aktin, som reduceras under inhibering av lamellipodia, pseudopodiae, och membranruffling som ett resultat av behandling med en inhibitor (Figur 1A). Detta är ett valfritt steg om intresse i kvantifiering av aktin polymerisation förutom fagocytos. Om aktin polymerisation är slutmålet, med hjälp av fluorescerande partiklar för fagocytos är valfritt.
- Efter paraformaldehyd fixering (steg 4,3), tvätta plattan två gånger med PBS vid 100 ul per brunn för varje tvätt. Lägg 50 pl av 0,1% Triton X-100 i PBS för permeabilisering och inkubera under -5 min vid RT.
- Tvätta ur 0,1% Triton X-100 2 gånger med PBS (som ovan), och blockera med 1% bovint serumalbumin (BSA) under 20 minuter för att undvika icke-specifik bindning av label.
- Efter blockering, avlägsna BSA-lösning och omedelbart lägga rhodamin phalloidin. För att förbereda arbetslösning av rodamin fläcken, använd 100 ^ metanlösning (tillhandahålls av tillverkaren) i 5 ml PBS (tillräckligt för en platta). Från arbetslösn lägga 50 ul per brunn och inkubera under 20 min vid rumstemperatur.
OBS: Efter tvättsteg och DAPI färgning som i steg 4.4 celler kommer att vara redo för kvantifiering.
6. Kvantifiering
- För att kvantifiera fagocytos med hjälp av en fluorescerande plattläsare, spela grön fluorescens med användning av exciteringsfilter vid λ = 488 nm och emissionsfilter vid λ = 518 nm, och blå fluorescens med användning av exciteringsfilter vid λ = 355 nm och emissionsfilter vid λ = 460 nm.
- För att kvantifiera aktin polymerisation med användning av en fluorescerande plattläsare, rekord blå fluorescens via λ = 355 nm och λ = 460 nm (som ovan), och röd influensaorescence via excitationsfilter på λ = 584 nm och emissionsfilter λ = 620 nm.
OBS: Orbital eller central upptäckt är acceptabelt för inspelning. Vissa celltyper samla mer till kanten av brunnen än mitten, i vilket fall orbital inspelning kan vara en fördel. I synnerhet skulle genomsnittet av tre punkter runt bana också användas för att erhålla mer exakta resultat. - Dela upp den totala RFU av grön eller röd fluorescens från blå fluorescens avläsning (från DAPI), beroende på etiketten partikeln eller fagocytiska vs. aktin kvantifiering (Diagram 1). På grund av hög platta till platta varians, använder relativa index (t.ex. i förhållande till t = 0 kontroll), för att bäst illustrera trender som observerats och underlätta mer tillförlitlig statistisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Två stora sätt att kvantifiera fagocytos och den efterföljande aktin polymerisation genom användning av detta protokoll är att observera kontinuerlig eller synkroniserad fagocytos.
Mikroskopisk analys (Figur 1B) illustrerar fluorescerande bilder jämförbara med vad fluorometern spelar in (se även diagram 1). I figur 1B är röda fluorescens av aktin, grön 268 fluorescens av FITC etiketter HKOP E. coli, kärn DAPI fläcken, och den sammanslagna bilden av alla tre 269 fluoroforema tillsammans. Denna bild visar effektiv fagocytos, aktin polymerisation, och 270 effektiva trypan släckning av icke-interna partiklar.
Kontinuerlig fagocytos av opsoniserad och unopsonized partiklar är helt jämförbara såsom framgår av fig 2A och C respektive, där J774 celler internalisera dextrankorn. Intressant aktin polymerisation efter opsonophagocytosis ökar, saktar ner vid senare tidpunkter (Figur 2B), medan aktin polymerisation efter internalisering av unopsonized partiklar inte ökar (figur 2D). Detta är viktigt att tänka på för framtida studier undersöka dessa processer eftersom opsonofagocytos leder till mycket större aktin polymerisation än internalisering av partiklar som inte är opsoniserad. Ingen av de fagocytiska metoder med användning av dextranpartiklar resultera i förändringar i cellviabilitet som bekräftades via MTT-analys (Figur 2E).
Till skillnad ständigt ökande trender som observerats under kontinuerlig fagocytos (Figur 2), synkroniserad fagocytos av opsoniserad dextranpärlor har en klockformad trend (Figur 3A), som visar minskad interna efter 30 min. Detta är att vänta med tanke på handläggningstiden och naturen av protokollet. Denna trend bekräftas också av aktin polymerization data (Figur 3B) av dessa celler där den högsta polymeriseringstiden punkten är tidigt i tidsförloppet, medan på 30 min polymerisations återgår till baslinjen. Även om mer arbetsintensiv, har denna metod ett värde att undersöka fagocytos direkt efter synkroniseringen, därför undersöka omedelbara fagocytiska effekter.
Figur 1:. Konfokalmikroskopi av fagocytos och aktin polymerisation Cellerna fick internalisera FITC konjugerad OPDex pärla (grön) vid 20: 1 pärla: cellförhållande i 60 minuter, sedan tvättades cellerna med trypan och PBS, fast med paraforlmaldehyde, permeabiliserades med aceton och färgades för f-aktin med användning av rodamin phalloidin (röd), och DAPI (blå). Bilder visar konfokala mikroskopisk analys vid 60X med extra digital förstoring, (A) Annandage bar = 10 ^ m (B) vit bar = 50 ^ m. (A) visar förändringar i aktin polymerisation efter tillsats av inhibitor. Pilspetsar indikerar pseudopodia bildning, och pilarna visar förändringar i membranruffling. Figur 1A har ändrats från Ninkovic och Roy 12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Fluorometrisk analys efter kontinuerliga fagocytos J774 murina makrofager ströks på en 96-brunnar och utsattes för dextrankorn vid varierande mängder tid, börjar med 90, 60, 45, 30, och 15 min. Pärlor tillsattes vid olika tidpunkter och de fagocytiska processer för alla Reaktionerna stoppades vid samma tidpunkt. Cellertvättades med trypan, fast, färgas, och analyseras för fagocytos av opsoniserad (A) eller unopsonized (C) dextran partiklar och aktin polymerisation associerad med varje (B, D respektive). (E) MTT-analysen utfördes omedelbart efter fagocytos vid olika tidpunkter. Denna siffra har modifierats Ninkovic och Roy 12.
Figur 3:. Fluorometrisk analys följande synkroniserade fagocytos FITC-märkt OPDex pärlor sattes till J774 murina makrofagceller pläterade i 96-brunnsplattor vid en celltäthet av 10 4 celler / brunn. Efter en 30 min inkubation plattan centrifugerades vid 500 xg under 5 minuter. Fagocytos stoppades en i taget, vid tidpunkterna angivna i x-axeln genom trypan tvätt, följt av PBS-tvättar, paraformaldehyd fixatipå och aktin-färgning. Denna siffra har modifierats Ninkovic och Roy 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Större begränsningar av den fluorometriska tekniken är experimentella variansen liksom cellförlust associerad med omfattande tvättning och användning av icke-adherenta celler.
Varians observeras beror till stor del av variationen i fluorescerande partiklar som vägning och pipettering under beredning av stamlösning är inte en exakt sätt att bibehålla identiska nummer av partiklar från experiment till experiment. För att lösa problemet med variansen mellan experiment, kan uppgifterna uttryckas i relativa termer, till exempel som% fagocytos eller lägga förändring från kontroll (kontroll - t = 0; partiklar sätts och tas bort omedelbart). Denna form av analys genererar reproducerbara trender och värderingar% fagocytos från kontroll är lika från experiment till experiment. Denna typ av dataanalys kommer att underlätta statistisk signifikans med 3-6 experimentella replikat. Fluorometrisk teknik kan användas för att på ett effektivt sätt undersöka och reproducera observerade trender drots sin föränderlighet om utnyttjande adekvat dataanalys. Med maste av tekniken är det möjligt för en enskild forskare att köra cirka sex 96-brunnars plattor, eller 600 behandlingar i en dag.
Cell förlust har till stor del observerats i studier med icke-vidhäftande celltyper. Adherenta celltyper är det bäst att använda i metoder som denna, eftersom de tål de många och omfattande tvättsteg.
Stora kritiska åtgärder bör vidtas för att hålla de fluorescerande komponenter från direkt ljus för att undvika fotoblekning. Partiklar, etiketter och plattan innehåller vardera eller alla komponenter bör hållas i mörker (eller helt enkelt insvept i aluminiumfolie). En annan viktig del är vikten av tekniska replikat inom en tallrik. På grund av hög brunn till brunn variansen är det viktigt att blanda alla reagensen mycket väl före pipettering och ha 6-8 tekniska replikat per behandling (motsvarande en rad), i syfte att mOst exakt observera trender i data.
Ytterligare överväganden är viktiga för användning av plattformat såsom dessa, är att de plattbrunnarna innehålla relativt små volymer av reagens och är ofta utsatta för avdunstning. Om behandlingarna är längre än 24 timmar, är det tillrådligt att använda de perifera brunnarna i plattan (rader och kolumner bredvid kanten) innehållande enbart PBS, i syfte att tjäna som luftfuktare och för att minska avdunstningen av cellodlingsmedia och agonister.
Denna teknik är ganska enkel att behärska och felsökning inblandade är minimal. Det är viktigt att välja rätt fagocytiska metod för studien och att vara försiktig medan tvätta (speciellt när du använder icke-vidhäftande celler) för att undvika cellförlust.
Större betydelse fluorometriska tekniken är att den ger en hög genomströmning metod för screening av fluorescerande partiklar interna eller aktin polymerisation. Mest techniques som hittills såsom mikroskopi eller mikrobiologi är mer arbetsintensiv och mer tidskrävande i jämförelse. Flow utnyttjar cytometry mycket liknande principer som fluorometri, men tar timmar att kvantifiera jämfört med minuter som krävs av fluorometri. Därför är den fluorometriska metoden ett bra alternativ till nuvarande metoderna för fagocytisk kvantifiering stor del på grund av dess höga genomströmning kapacitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers: | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use | |
| Fluorescent plate reader - Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96-well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom - black plates |
| Multichannel pipette (8 - 12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
- Murphy, K. Janeway's Immunobiology. , 8th edn, Garland Science. New York, NY. (2012).
- Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. Micromotion of cemented and uncemented femoral components. The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).
- Duan, X., et al. Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice. PloS One. 8 (3), 59633 (2013).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PloS One. 7 (3), 32621 (2012).
- Al-Bader, N., et al. Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence. Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).
- Acosta-Iborra, B., et al. Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor. Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).
- Ojielo, C. I., et al. Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation. Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).
- Neu, C., et al. CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages. PloS One. 8 (6), 66898 (2013).
- Sokolovska, A., et al. Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function. Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).
- Janko, C., et al. CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation. Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).
- Clatworthy, M. R., et al. Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).
- Ninkovic, J., Roy, S. Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms. The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).
- Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection. PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).
- Xue, X., et al. Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system. Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).
- Hed, J. Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology. 132. , 198-204 (1986).
- Scott, A. J., Woods, J. P. Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay. Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).
