Abstract
flüorometrik analiz amacı fagositozunu ve diğer hücresel süreçleri analiz verimli, düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi olarak hizmet etmektir. Bu teknik, hücre çeşitli özelliklerini incelemek için, yapışkan ve yapışkan olmayan, her iki hücre tipinde, çeşitli kullanılabilir. Fagositozu okuyan zaman flüorometrik tekniği gibi makrofajlar ve kimin floresan tripan mavisi varlığında sönmüş olabilir floresan etiketli opsonize edilmiş parçacıklar gibi fagositik hücre tiplerini kullanır. 96 oyuklu plakalar, floresan parçacıkların (yeşil veya kırmızı) yapışkan makrofaj kaplama izlenerek tatbik edilmektedir ve hücreler, zaman çeşitli miktarlarda fagosite izin verilir. Floresan parçacıkların içselleştirme sonra hücreler içsel olmayan, ya da sadece hücre yüzeyine yapışan bakterilerden floresan sinyalin yok olmasına olanak tripan mavisi ile yıkanır. Tripan yıkamayı takiben, hücreler, sabit, PBS ile yıkanır, birnd hücrelerin çekirdekleri etiketlemek için hizmet veren DAPI (nükleer mavi floresan etiket) ile boyandı. Levha çekirdek (mavi) okunması ya da bir parçacık içinde basit bir florometrik miktar olarak (kırmızı / yeşil) floresans yeşil nispi floresan birimlerinin oranı inceleyebilir: mavi ve hücre başına içsel floresan bakteri miktarının göstergesi olan bir fagositik endeksinin belirlenmesi. yıkama için 96 çukurlu bir yöntem ve çok kanallı pipet kullanılarak tahlil süresi, veri toplama sonuna fagositoz sonundan, 45 dakikadan daha azdır. Akış sitometrisi, benzer bir şekilde kullanılabilir, ancak fluorometri avantajı, yüksek verim, numune en az bir manipülasyon ve hücre başına floresan yoğunluğu hızlı ölçümü ile değerlendirme olarak hızlı bir yöntemdir edilebilir. Benzer stratejiler, esasen yapışkan hücreler, canlı etiketli bakteriler, aktin polimerizasyonu, ve floresan kullanılarak herhangi bir işlem uygulanabilir. Bu nedenle, fluorometri düşük maliyetli, yüksek throughp için umut verici bir yöntemdirhücresel süreçlerin çalışmada ut yetenekleri.
Introduction
Floresan sinyal miktarının belirlenmesi yaygın, akım sitometri konfokal mikroskopi ve ELISA multiplex için analiz FRET, PCR kadar bilimsel yöntemlerle çok sayıda kullanılmıştır. Floresan görüntüleme ve miktar geniş bir uygulama vardır ve çeşitli hücresel süreçlerin kantitatif analiz için harika bir araç olabilir. Floresan belirteçleri ve sinyal kullanımı son on yılda devrim olmuştur, ve floresan plaka okuyucu çıkması hücresel süreçleri sırasında yayılan floresan yüksek verim miktarının kolaylaştırmıştır.
Florimetrik analiz fagositoz miktarının büyük bir araç olarak hizmet verebilir. Fagositoz, 1800 1 Metchnikoff tarafından fagositoz keşfinden bu yana çalışılmıştır. Yıllar geçtikçe, çeşitli yöntemler bakteriyel, viral, fungal ve parazitik patojenler 2-5 istila karşı doğal bağışıklık savunma için gerekli bu önemli süreci incelemek için kullanılmıştır. Sırayla miktar kullanılan mikroskopi ve Stereolojik tekniklerin Önceki yöntemler daha sonra içselleştirilmiş parçacıklar (manuel veya yazılım kullanımı ile) 6-8 sayılarak ölçüldü phagocytosing hücreleri, görselleştirmek için. Kantitatif analiz için yalnız mikroskopi kullanılarak bazı dezavantajları bakterilerin manuel sayım emek yoğun ve gözlemci önyargı daha eğilimli olduğunu vardır. Fagositoz belirlenmesinde kullanılan diğer bir yöntem, bakteriyel kültür tabakalarına (fagositoz sonra) hücre lizatları bakterilerin kaplama mikrobiyolojik bir tekniktir, ancak bu yöntem bakteri mekanizmaları ve kısmen içsel bakterilerin varlığı hesaba başarısız olabilir. Bu yöntem mikroskopi göre daha emek yoğun ve analiz için birkaç gün sürer. Akış sitometri fagositoz ölçmek için hızlı, en etkili yolu olarak görünmektedir ve birçok grup 9-11 tarafından kullanılmıştır, ancak yüksek maliyet yaygın in ile ilgiliDaha önce de belirtildiği deneylere göre analiz için gerekli gösterge en pahalı bir yöntem sağlar.
flüorometrik yöntem engelleyici maliyeti olarak değil floresan kullanarak ekipman tarafsız ölçümü sunar beri parçacık içselleştirilmesi analizi için flow sitometri için iyi bir alternatiftir. Fluorometri diğer katma faydaları, yüksek verimlilik ve etiketli içselleştirilmiş parçacıklar tarafından yayılan floresan ölçülmesi için yüksek verimlilik yetenekleri vardır.
Fluorometri Faydaları fagositoz dışındaki süreçlerin ölçümü için çıkarım olabilir. Örneğin, florometrik analiz aktin polimerizasyonunda hücre içi ya da zar bağlı reseptör, hücre geçirgenliği / canlılığı, transfeksiyon etkinliği değişiklikler ve modülasyon ifadesi değişikliklere yol açan herhangi bir işlem çalışma uygulanabilir. Florometrik tekniğin bir dezavantajı kullanılan etiketlerin bağlı olarak, yüksek olabilir, yaniDeney genellikle kat değişikliği veya kontrolden oranında artış göreli miktar üzerinden veri, göstererek çözülebilir değişkenliği deneme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: daha önce yayınlanan çalışma 12 kullanılan Bu protokol, fagositoz ve aktin polimerizasyonu miktar gibi birden fazla uygulama için de kullanılabilir. protokol değişikliği çeşitli kendisini ödünç, ve Tablo 1 hücre tipleri ve parçacıklar başarıyla geçmiş çalışmalarda kullanılan. Fagositoz veya aktin polimerizasyonu ölçümü için bu protokolün standart kullanımı Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şema 1:. Hücreler, kaplama muamele edilmiş ve yapışmaya bırakılmış sonra Şeması fagositoz aktin polimerizasyonu ve miktar tayini için flüorometrik tahlil yeşil floresan (FITC) ile etiketlenir parçacıklar fagositosis için hücrelere ilave edilir. Reaksiyon trypan veya antibi tarafından durdurulurotik yıkama (olmayan içsel parçacıkları elimine etmek için) ve tespit% 4 paraformaldehit ile gerçekleştirilir. Hücreler, daha sonra kırmızı floresan aktin etiket (rodamin falloidin) ve mavi floresan-etiketi (DAPI) ile boyanır. Fagositoz aktin polimerizasyonu ve endeksler yeşil / mavi (FITC / DAPI) ya da kırmızı / mavi (rodamin / DAPI) floresansın nispi floresan birimlerinin oranı olarak ölçülür.
1. Kaplama ve Tedavisi Hücreler
NOT: Başlamadan önce, plaka düzeni aşağıdaki kontrolleri en az 4 teknik tekrarlı tedaviler çalışan düşünün, ve şunlardır: sadece ve parçacık hücreleri sadece (tek başına ya da DAPI rodamin yalnız ile, lekesiz).
- Kontaminasyondan örnekleri korumak amacıyla, steril hücre kültürü kaputu 1-4 adımda reaktiflerin tamamı ilave yürütmek için.
- (Kuyu başına), 50 ul 1-5 x 10 4 hücre 96 oyuklu bir plaka içerisinde Plaka makrofajlar (sıçangil J 774 hücre çizgisi) ve önceden ısıtılmış medya desteklenmiştir. Bu yöntem için ideal plakaları okuyucu özelliklerine bağlı olarak, şeffaf veya siyah dipleri siyah 96-kuyu plakalar vardır.
- (Fagositosis için canlı bakteri kullanılmıyorsa) takviye edilmiş bir ortam için, tamamlayıcı çağlayanının bir girişimi engellemek için FBS,% 10 ısı ve% 1 penisilin / streptomisin kullanın. Ile yapışmayan hücreler 1-2 yapışma saat ve yapışkan olmayan hücreler için izin verirse, 500 x g'de 10 dakika için hücreler ile plaka aşağı doğru döndürün.
- 100 ul (1 x) bir son hacim için 50 ul 2x konsantrasyonda (takviye edilmiş ortam içinde, daha tercihen PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ya da) istenilen agonistleri / antagonistleri ya da araç kontrolü ekleyin ve bir zaman arzu edilen bir miktarda inkübe edilir. Çok kanallı pipet ve reaktif rezervuarları hızlı işleme kolaylaştıracaktır.
Floresan Parçacıkların 2. Opsonizasyon
ftp_upload / 52.195 / 52195table1.jpg "width =" 500 "/>
Tablo 1: Test edilen hücre tipleri ve fluorometrik olarak analiz floresan parçacıkların olmadığı, fagositoz ve aktin polimerizasyon Tablo 1 hücre tiplerinin kombinasyonu (hücre hatları ve primer hücreler) göstermektedir grup florometrik yöntemi ile kullanılan bildirildi.. Vahşi tip hücreler tarafından fagositoz ve aktin polimerizasyonu şu an dışında, aynı zamanda, bir GFP (yeşil flüoresan protein) ifade eden transfekte edilmiş hücreler tarafından fagositoz incelenmesi için, bu parçacıkların bir kısmı kullanmışlardır. . Floresan haberci ihtiva eden plasmidler ile transfekte edilmiş hücrelerin floresans da DAPI Tablo Efsaneye ek olarak hücresel marker olarak kullanılabilir: A - aktin polimerizasyonu; P - fagositoz; PT - GFP tarafından fagositoz transfekte hücreleri etiketli; OPDex - dekstran boncuk opsonize; HKOP - Isı opsonize öldürülen.
- Floresan parçacıkların olmadığı ve etiketler her zaman ışıktan korunduğu, dur sağlamakışıkla ağartma önlemek için, hem de inkübasyon sırasında işleme, yıkama ing
- Üreticinin teknik özelliklerini kullanarak,: (E. coli K-12 suşu E2861) kuru parçacıklar için, floresan ısı öldürülmüş opsonize (HKOP) bakterileri dışarı tartın. 10 Herhalde kitle hesapları yapmak için özen: 1-20: 1 bakteri: hücre oranı (ya da en azından 10: 1 oranı - yaygın fagositoz miktarının kullanılır) 13,14. Parçacıkların sayısı üreticisi tarafından sağlanan veya 1 mg / ml stok çözeltisi seri dilüsyonları couting ile tespit edilebilir.
- 50 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve en yüksek ayarda 1 dakika vorteksleyin. Doğru vorteks (burada ve protokol boyunca) parçacıklar opsonitasyonunu etkinliğini etkileyebilecek bir araya eğilimi gibi olun.
- Süspansiyon içinde olan zerrelerin gibi floresan etiketli dekstran boncuk (Dex boncuklar) için, 1 dakika vorteksleyin, stok çözeltisi, birim d boncuk konsantrasyonuna süspansiyon ya da bağlı olarak 50 ul alır1 boncuk: boncuk etermine montaj 10 kolaylaştırmak için hücre oranı.
- Parçacıklara opsonizasyon reaktif eşit hacimde eklenir ve güçlü bir şekilde bir dakika girdap.
- 1 saat boyunca 37 ° C'de bir reaktif opsonizasyon sahip partiküller inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra 500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj parçacıkları ve fazla opsonizasyon reaktifi ihtiva eden üstte yüzen çıkarın. 100 ul PBS ilave edilmesiyle parçacıklar yıkanır, girdap 500 x g'de 5 dakika boyunca pelet ve santrifüjatın tekrar süspansiyon.
- Uygun opsonizasyonunu ve bağlanmamış antikor kaldırılmasını sağlamak için bu adımları iki kez tekrarlayın.
- (Bir 96-delikli plaka için yeterli) ortam 5 ml bunları yeniden süspanse edilmesi suretiyle opsonize parçacıkların çalışma çözeltisi hazırlayın ve hücrelere ilave edilene kadar ışıktan uzakta depolamak.
3. Fagositoz
- Steril reaktif rezervuar içindeki parçacıkların çalışma çözeltisi yerleştirin. Buradan, 50 ekleyin56 (50 ng / ml'lik bir son konsantrasyon için) aşama 1 'de hazırlanan hücrelere opsonize parçacıkların L ve fagositoz standart hücre kültür koşullarında oluşmasına izin verir. Bu yöntem (Şema 2) kullanılarak değerlendirilebilir fagositoz iki yöntem aşağıda görüntülenmiştir.
Şema 2:. Onlar yavaş yavaş iyi altındaki hücreleri ulaşmak gibi sürekli karşı senkronize fagositoz karşılaştırılması Sürekli fagositoz zamanla parçacıkların sürekli içselleşmesini gösterir. Bir tezat senkronizasyon adımı (santrifüj) hücre ile partikül temas artırılması ve hücreler tarafından derhal içselleştirilmesi lider, dibine çöker parçacıkları zorlar. Senkronize fagositoz daha hızlı bir bölümünü içselleştiren hızlı bir süreçtirparçacık temas: artmış hücre nedeniyle icles.
- Bakteri kuyunun dibine ulaşmak ve elde etmek için yavaş yavaş dibe batar ve hücreler ile temas, izin daha uzun zaman dilimlerini kullanmak gibi hücreler sürekli opsonize bakterileri fagosite izin Sürekli fagositoz yöntemiyle (Şekil 2) için hücrelerle dokunun. Bir zamanlaması, deney yapılması halinde, farklı zaman aralıklarında bakteri ekleyebilir ve işleme hızını artırmak için, aynı zamanda reaksiyonların tüm plaka durdurun.
- Parçacık artırır senkronize fagositoz yöntemiyle (Şekil 2) için: santrifüj yoluyla hücre teması, her zaman noktalarında senkronizasyonunu kolaylaştırmak için hücreleri ve parçacıklar (500 xg'de 5 dakika) kısa sürede parçacıklar ilave olarak içeren tüm plaka aşağı spin ve Hücre etkileşimi: parçacık hızlandırmak için.
- Sağ merkezkaç tamamlanmasından sonra başlayan süresi kursu ölçünfugation adım. Zamana yayılmış bir deneyi yürütülmesi durumunda aşağıda tarif edildiği gibi, farklı zaman aralıklarında bağımsız olarak her zaman noktasını durdurun.
NOT: senkronize fagositoz yöntemi biraz daha zahmetli bir öncekinden olduğunu, ancak daha kısa sürede daha yüksek fagositik indeksi sağlar.
4. Durdurma Fagositoz
- Yapışkan hücreler için, süpernatant kaldırmak ve PBS ile seyreltildi tripan mavisi 50 ul: olmayan içsel bakteri floresan söndürmek için, (2: 1 seyreltme).
- Yapışmayan hücreler için, plaka aşağı spin ve süpernatant kaldırmak. Seyreltilmiş tripan mavisi 50 ul ekleyin. Hücre kaybını en aza indirmek ve yeterli yıkama sağlamak için, her bir yıkama arasında en plaka (500 x g'de 5-10 dakika) santrifüj emin olun.
- Tripan inkübasyon sonrasında, (de açık döner PBS kaldırılana kadar) herhangi bir kalıntı numuneler Tripan kaldırmak için PBS ile hücreleri iki kez yıkayın. Trypan fakat canlı bir bakteri ya da OPDex boncuk, floresan etiketli olmayan içsel ısı öldürülmüş bakteriyel parçacıkların floresan 15,16 söndürmek için gösterilmiştir. Canlı bakteri için, penisilin, streptomisin, veya gentamisin yerine olmayan içsel partiküllerden floresan karıştırıcı etkilerini önlemek için tripan yıkama gibi antibiyotikler ile bir yıkama içerir.
- PBS ile yıkayın, sonra% 4 paraformaldehid, 100 ul hücreleri saptamak, ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir (her bir yıkama için oyuk başına 100 ul). Bu adımda, bir haftaya kadar 4 ° C 'de hücreler, kaydetme ve boyama ve miktar, doğrudan devam edin.
NOT: Tüm sonraki adımlar bu nokta önsöz hücre kültürü kaputu dışında yapılabilir oluştururlar. - Tüm sıvı çıkarın ve PBS içinde yeniden 5 ng / ml DAPI 50 ul ekle. Boyama için 5 dakika izin verin ve daha sonra iki kez PBS ile yıkayın. Yıkama adımından sonra, her bir kuyunun ve kayıt fagositozu PBS 50 ul ekleyin.
5. Aktin Boyama
Not: fagositoz ek olarak, florometrik yöntem lamellipodia, pseudopodiae inhibisyonu sırasında azalır aktin, yoğunluğunu ölçmek ve membran bir inhibitör (Şekil 1A) ile muamele sonucu olarak kabarması ile aktin polimerizasyonu miktarının sağlayacaktır. Bu fagositoz ek olarak aktin polimerizasyonu ölçümü ilgilenen varsa isteğe bağlı bir adımdır. Aktin polimerizasyon fagositoz için floresan parçacıklar kullanılarak, nihai hedefi ise isteğe bağlıdır.
- Paraformaldehit sabitleme (adım 4.3) takiben, her bir yıkama için oyuk başına 100 ul PBS ile iki kez plakayı yıkayın. Nüfuziyet kabiliyeti PBS içinde% 0.1 Triton X-100, 50 ul ilave edin ve oda sıcaklığında -5 dakika inkübe edilir.
- (Yukarıdaki gibi) PBS ile% 0.1 Triton X-100, 2 kez yıkayın ve Labe spesifik olmayan bağlanmanın olmaması için 20 dakika boyunca,% 1 sığır serum albümini (BSA) ile blokel.
- Engelleme ardından, BSA çözüm kaldırmak ve hemen rodamin Phalloidin ekleyin. , Rodamin leke çalışma çözeltisi hazırlamak (bir plaka için yeterli) PBS, 5 ml (üretici tarafından sağlanan) metanoik çözeltisi 100 ul kullanın. Çalışma çözeltisinden oyuk başına 50 ul ilave edildi ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
NOT: adımda çamaşır adımları ve DAPI boyama takiben 4.4 hücreleri ölçümü için hazır olacak.
6. sayısallaştırılması
- Λ = 460 nm λ = 355 nm ve emisyon filtresi uyarma filtresi kullanılarak λ = 518 nm, mavi floresan de λ = 488 nm ve emisyon filtresi uyarma filtresi kullanılarak floresan plak okuyucu kayıt yeşil floresan ile fagositozu ölçmek için.
- Λ = 355 nm ve λ = 460 nm (yukarıdaki gibi), ve kırmızı grip ile bir floresan plaka okuyucu kayıt mavi floresan kullanılarak aktin polimerizasyonu ölçmek içinλ = 584 nm ve emisyon filtresi λ = 620 nm uyarma filtresi üzerinden orescence.
NOT: Orbital veya merkezi algılama kayıt için kabul edilebilir. Bazı hücre tiplerinin vaka yörünge kayıt avantaj olabilir hangi merkeze daha kuyudan, kenarına daha toplamak. Özellikle, yörünge etrafında üç nokta, ortalama aynı zamanda daha hassas sonuçlar elde etmek için kullanılabilir. - Aktin ölçümü (Grafik 1) vs parçacık etiket veya fagositik bağlı, (DAPI itibaren) mavi floresan okuma yeşil veya kırmızı floresan toplam RFU bölün. Yüksek olması nedeniyle plaka için plaka varyans, en iyi gözlenen eğilimleri göstermek ve daha güvenilir istatistiksel analiz kolaylaştırmak için, (örneğin = 0 kontrolü t göreceli olarak) göreceli indeksleri kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kullanılarak fagositozunu ve sonraki aktin polimerizasyonu miktarının iki önemli yolu, sürekli veya senkronize fagositoz gözlemlemektir.
Mikroskopik analiz (Şekil 1B) florimetre kayıt ne karşılaştırılabilir floresan görüntüleri göstermektedir (ayrıca Diagram 1). Şekil 1B aktin kırmızı floresan, FITC yeşil floresan 268 HKOP E. etiketleri vardır coli, nükleer DAPI leke ve üç 269 birleştirilmiş görüntü bir araya flüoroforlar. Bu görüntü etkili fagositoz, aktin polimerizasyonunu ve olmayan içsel parçacıkların 270 etkin tripan söndürme gösterir.
J 774 hücrelerinde dekstran boncuk içe nerede sırasıyla Şekil 2A'da ve C görüldüğü gibi opsonize ve unopsonized parçacıkların sürekli fagositoz oldukça karşılaştırılabilir. İlginç bir şekilde, aktin polimerizasyonu aşağıdaki opsonophunopsonized parçacıkların aktin polimerizasyonu aşağıdaki içselleştirme (Şekil 2D) arttırmazken, agocytosis artar, daha sonraki zaman noktalarında (Şekil 2B) yavaşlatan. Bu opsonofagositozdur opsonize olmayan parçacıkların içselleştirilmesi çok daha fazla aktin polimerizasyonu yol açar çünkü bu süreçleri inceleyerek gelecekteki çalışmalar için dikkate almak önemlidir. MTT analizi (Şekil 2E) ile teyit edilmiştir dekstran partiküller kullanılarak fagositik iki yöntemle de hücre yaşamı sürdürme kabiliyetinde bir değişiklik ile sonuçlanır.
Sürekli sürekli fagositoz (Şekil 2) sırasında gözlenen eğilimleri artan aksine, opsonize dekstran boncuk senkronize fagositoz 30 dakika aşağıdaki içselleştirme azalma gösteren, bir çan şeklinde bir eğilim (Şekil 3A) sahiptir. Bu işlem süresini ve protokol niteliğini göz önünde bulundurarak beklenebilir. Bu eğilim aynı zamanda aktin pol tarafından onaylandıktanEn yüksek polimerizasyon zaman noktası timecourse erken verildi, bu hücrelerin ymerization verileri (Şekil 3B), ise taban çizgisine 30 dakika polimerizasyon dönülür. Daha fazla emek yoğun olmasına rağmen, bu yöntem, bu nedenle hemen fagositik etkilerini inceleyen, doğru senkronizasyon sonra fagositozunu inceleyerek bir değere sahiptir.
Şekil 1:. 1 damla: fagositoz ve aktin polimerizasyonu mikroskopisi Hücreler 20 FITC konjüge OPDex boncuk (yeşil) özümseme izin verildi, 60 dakika boyunca hücre oranı, o zaman hücreler, paraforlmaldehyde sabit tripan ve PBS ile yıkanmıştır ile geçirgen hale getirilirler aseton ve rodamin Phalloidin (kırmızı) ile F-aktin için, lekeli ve DAPI (mavi). Görüntüler ek dijital büyütme 60X de konfokal mikroskopik analizi göstermektedir; (A) katiyene bar = 10 mikron (B) beyaz çubuk = 50 mikron. (A) inhibitörü eklenmesi aşağıdaki aktin polimerizasyonu değişiklikleri örnekler. Ok uçları Yalancı ayak oluşumunu gösterir, ve oklar. Şekil 1A Ninkovic ve Roy 12 modifiye edilmiş membran ruffling değişiklikleri gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Şekil 2: Sürekli fagositoz J774 sıçangil makrofaj aşağıdaki flüorometrik analizi bir 96-çukurlu plaka üzerine ekildi ve 90, 60, 45, 30, ve 15 dakika ile başlayan zaman içinde değişen miktarlarda dekstran boncuk maruz bırakıldı. Boncuk farklı zamanlarda ve bütün reaksiyonlar, aynı zamanda durduruldu için fagositik işlemler ilave edildi. Hücrelersabit, tripan ile yıkandı, boyanmış ve farklı her (B, D) mevcuttur. (E) MTT deneyi yapılmıştır hemen sonra fagositoz ile bağlantılı opsonize (A) 'nın fagositoz veya unopsonized (C)' dekstran parçacıklar ve aktin polimerizasyonu için analiz edildi zaman noktalarında. Bu rakam Ninkovic ve Roy 12 modifiye edilmiştir.
Şekil 3:. Senkronize fagositoz aşağıdaki flüorometrik analiz FITC OPDex boncuk / oyuk 10 4 hücrelik bir hücre yoğunluğunda, 96 yuvalı plakalara kaplanmıştır J774 sıçangil makrofaj hücreleri ilave edildi etiketli. 30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, plaka 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüje edildi. Fagositoz PBS yıkama, paraformaldehid fixati ardından tripan yıkama göre x-ekseni, belirtilen zaman noktalarında, bir seferde bir durdurulduve aktin boyama. Bu rakam Ninkovic ve Roy 12 modifiye edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Florometrik tekniğin başlıca kısıtlamaları deney varyans yanı sıra geniş bir yıkama ve yapışkan olmayan hücrelerin kullanımı ile ortaya çıkan hücre kaybı vardır.
Varyans nedeniyle hazır çözeltinin hazırlanması sırasında tartım ve pipetleme gibi floresan parçacıkların varyasyon büyük ölçüde görülmektedir deney için deney parçacıkların aynı sayıda muhafaza tam bir yol değildir. (-; Parçacıklar hemen eklenen ve kaldırılan t = 0 kontrol) deneyler arasındaki varyans sorunu çözmek için, veri,% fagositoz örneğin, nispi olarak ifade veya kontrol değişikliği kat edilebilir. Bu analiz formu tekrarlanabilir eğilimleri üretir, ve kontrolden% fagositoz değerleri deneme deneyden benzer. Veri analizi Bu tür 3-6 deneysel çoğaltır istatistiksel olarak anlamlı kolaylaştıracaktır. Florimetrik tekniği etkili bir incelemek ve gözlenen trendleri d üretmek için kullanılabilirYeterli veri analizi kullanılarak eğer onun değişkenlik espite. Tek bir bilim adamı, yaklaşık altı 96-yuvalı plakalar, ya da bir gün içinde 600 tedaviler çalıştırmak için tekniğin hakim ile mümkündür.
Hücre kaybı büyük ölçüde yapışmayan hücre tipleri ile çalışmalarda tespit edilmiştir. Yapışkan hücre tipleri bu gibi onların çok sayıda ve yoğun yıkama adımları dayanabildiği bu bir yöntemlerde kullanmak en iyisidir.
Başlıca kritik adımlar fotoğraf beyazlatma önlemek için doğrudan ışıktan floresan bileşenleri uzak tutmak için önlemler alınmalıdır. Partiküller, etiketler, ve her biri ya da tüm bileşenleri ihtiva eden plaka karanlıkta muhafaza (ya da sadece alüminyum folyo içine sarılmış) olmalıdır. Başka bir temel bileşeni, bir plaka içinde teknik çoğaltır önemidir. Nedeniyle kuyusu varyans yükseğe o m için, pipetleme önce çok iyi tüm reaktifler karıştırmak ve (bir satır eşdeğer) tedavi başına 6-8 teknik çoğaltır olması esastırdoğru veri eğilimleri gözlemlemek Ost.
Bu gibi plakası kullanımıyla önemli Dikkat edilecek diğer plaka kuyuları reaktifler nispeten küçük miktarlar içeren ve genellikle, buharlaştırma eğilimli olmasıdır. Tedaviler uzun 24 saat olan, bu nemlendiriciler olarak hizmet etmek ve hücre kültür ortamı ve agonistleri buharlaşmasını azaltmak için, tek başına PBS içeren (bir sonraki kenarına satır ve sütun) plaka çevresel kuyu kullanılması tavsiye edilir.
Bu teknik usta oldukça basit ve ilgili sorun giderme düzeydedir. Bu çalışma için doğru fagositik yöntemini seçmek ve hücre kaybını önlemek için (yapışkan olmayan hücreler kullanılarak özellikle) yıkarken dikkatli olmak önemlidir.
Florometrik tekniğin başlıca önemi, floresan parçacık içselleştirme veya aktin polimerizasyonu taranması için yüksek verimli bir yöntem sağlamasıdır. En tBöyle mikroskopi veya mikrobiyoloji gibi bugüne kadar kullanılan tekniki daha emek yoğun ve daha fazla zaman karşılaştırıldığında alıcıdır. Akış sitometri fluorometri olarak çok benzer ilkeleri kullanır, ancak fluorometri gerektirdiği dakika karşılaştırıldığında ölçmek için saat sürer. Bu nedenle, flüorometrik yöntemi, yüksek verimli yetenekleri büyük ölçüde fagositik miktar mevcut yöntemlere iyi bir alternatif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers: | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use | |
| Fluorescent plate reader - Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96-well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom - black plates |
| Multichannel pipette (8 - 12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
- Murphy, K. Janeway's Immunobiology. , 8th edn, Garland Science. New York, NY. (2012).
- Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. Micromotion of cemented and uncemented femoral components. The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).
- Duan, X., et al. Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice. PloS One. 8 (3), 59633 (2013).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PloS One. 7 (3), 32621 (2012).
- Al-Bader, N., et al. Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence. Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).
- Acosta-Iborra, B., et al. Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor. Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).
- Ojielo, C. I., et al. Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation. Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).
- Neu, C., et al. CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages. PloS One. 8 (6), 66898 (2013).
- Sokolovska, A., et al. Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function. Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).
- Janko, C., et al. CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation. Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).
- Clatworthy, M. R., et al. Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).
- Ninkovic, J., Roy, S. Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms. The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).
- Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection. PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).
- Xue, X., et al. Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system. Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).
- Hed, J. Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology. 132. , 198-204 (1986).
- Scott, A. J., Woods, J. P. Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay. Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).
