Protocol
マウスを用いた実験はすべて、それぞれの機関の動物管理使用委員会のガイドラインに従って行われるべきである。
マウスの実験のために1。一般的なコメント
- 病原体を含まない条件下でマウスを維持し、それらに食物と水を自由にアクセスできるようにする。
注：免疫学的パターンは、年齢や性別に応じて変化することができますので、それは実験群における年齢および性別をマッチさせたマウスを使用することが重要です。
2. OVA特異的CD8 + T細胞（OT-I）の調製及び活性化
- 脳スライスを準備する前に、5日以下に説明するようにOT-I T細胞の刺激を実行します。
注：5×10 5活性化エフェクターCD8 + OT-I T細胞（CD8 + T細胞はMHC-I分子の状況においてのみOVA 257-264ペプチドを認識するトランスジェニックマウス）は、スライス毎に必要とされる濃度5× 10 図5は、実験を選ばれました細胞は、同時に、スライスに移行し始めていることをいったん良好な細胞-細胞相互作用を有利にするために最適なものとして味方は、細胞の量は、単一の細胞が8,18をカウントできるように過剰反応を誘発するために高すぎない。 - OT-I T細胞を培養するための培地を準備します。 、5％ウシ胎仔血清（FCS）、10mMのHEPES、2mMのL-グルタミン、50μM2-メルカプトエタノール、1％非必須アミノ酸および25μg/ mlのゲンタマイシンを500mlのDMEMを補う。使用するまで4℃でメディアを保管してください。
- 参照16に従ってOT-Iトランスジェニックマウスの脾臓を削除します。準備中にそれらを転送します。
- 5分、4℃、300×gで70μmのストレーナーと遠心サスペンションを通じて脾臓をすりつぶすことによって、単一細胞懸濁液を生成します。
- 赤血球を溶解するために5分間、5ミリリットル塩化アンモニウム-カリウム（ACK）緩衝液（150mMのNH 4 Clを、10mMのKHCO 3、0.1mMのEDTA、pH7.3）中で細胞懸濁液をインキュベートする。
- incubati停止再度の10ml培地遠心分離機を持つに上記のように。
- 培地中で細胞懸濁液を希釈し、数値を計算する。プレート3×10 7細胞の密度で細胞/ウェルで12ウェルプレートプライムそれらインキュベーションによるOVA 257 - 264（SIINFEKL; 1nMの）およびインターロイキン2（IL-2）（500 IU / ml）のための5日。
- 4日後、500 IU / mlの濃度で再度のIL-2を追加する。
- 刺激に続いて、製造者の指示に従って負の選択ベースのマウスCD8 + T細胞単離キットを使用して、細胞懸濁液からのOT-I T細胞を精製する。精製は、CD4、のCD11b、CD11cの、CD19、CD45R（B220）、CD49b（DX5）、CD105、MHCクラスII、テル-119、およびTCRγに対する抗体のカクテルを使用して、すべての非CD8 +細胞の枯渇に基づいています/δその後、精製CD8 + T細胞の溶出に磁気カラムを使用して、破棄される。
注：この。手順で重要なステップREが製造してによって示されている：それは塊の存在は、溶出ステップの間に列をブロックする可能性があるため、反応は、単一の細胞が関与することが重要です。サンプルおよび手順の純度は非特異的抗体バインディングを最小限に抑えるために氷上で行われるべきであるためにByotinカクテルを添加する前に細胞をカウントすることが重要である。
OT-I T細胞急性脳スライスとの共培養の調製
- 急性脳スライス19の製造の前に、200mMのスクロースを用いplacedine氷冷生理食塩水を調製し、20mMのPIPES、2.5mMのKCL、1.25ミリモルのNaH 2 PO 4、10mMのMgSO 4を、0.5のCaCl 2及び10mMデキストロースそして人工脳脊髄液（ACSF）125のNaCl、2.5のKClを使用して1.25のNaH 2 PO 4、24mMのNaHCO 3を、2mMのMgSO 4を、10mMのデキストロース2のCaCl 2、。使うによって7.35に各溶液のpHを調整するgのNaOHを。 ACSFのpHを調整する前に、溶液を、95％O 2および5％CO 2の混合物でバブリングされなければならない。
- 解決策を事前に冷却する。
- 8麻酔- （10週齢のマウスを、例えば、のC57Bl 5.0％イソフルラン、5.0％ハロタンまたは待ち 腹腔内を介して100mg / kgのケタミンおよび10mg / kg体重のキシラジンを注入を使用してコントロールまたは吸入トランスジェニックODC-OVAマウス17のような/ 6麻酔のための麻酔のレベルを評価し、一度にそれらを斬首するためにつま先のピンチを使用しています。制度的動物のケアに従ってマウスを安楽死させると安楽死のための委員会の基準を使用。
- 腹の位置にマウスを置く。駆除と矢状頭皮をカット。 、矢状頭蓋骨を開き、スクープの助けを借りてすぐに脳を除去し、接着剤を使用してビブラトームの板の上にそれを修正。
- 準備placedine氷冷生理食塩水でプレートを埋める。
- ビブラトームで300μmの冠状切片をカットします。
注：この手順は、知られているnは、少なくとも8時間19-21の時間間隔内で機能的な細胞研究のための適切な実行可能な無傷の組織標本を得た。この期間の後、すでに6時間後に開始し、準備は品質の低下を示している事実、すなわち、活動電位発生と伝播などの基本的および機能的特性が変化する。 - 切片化した後、ACSFで満たされた12ウェルプレートの各ウェルに直ちにつのスライスを転送する。
- スライスごとに慎重に5×10 5 OT-I T細胞を追加します。
- インキュベーター（37℃、5％CO 2）中で、最大8時間スライスをインキュベートする。
- インキュベーション期間の後、収穫スライスおよびOCT化合組織-tekのを使用してそれらを埋め込み、液体窒素中でそれらを凍結する。 例えばへの更なる組織学的研究のために-20℃で保管してください（抗MAPIIまたは抗シナプトフィジン抗体を使用するなど、）ニューロンの構造を評価するか、アポトーシス（ 例えば、抗カスパーゼ3抗体を使用し、抗NeuNの抗体）を、標準的な手順に従って。
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Representative Results
オリゴデンドロサイト特異的CD8 + T細胞による脳切片をインキュベートした後、希突起膠細胞、ならびに神経細胞（それぞれ図2Aおよび図1C）、アポトーシスを受ける。アポトーシス（ 例えば、カスパーゼ-3、TUNEL）の組織学的徴候が早いインキュベーションの3時間後に検出することができる。潜伏期間は準備と再現性のある結果の良い品質を保証するために、8時間より長くてはならない。アポトーシス細胞は髄地域で優勢ですべてのスライスの上に見つけることができます。構造的完全性およびアポトーシスニューロンスライスの代表的な組織学的染色は、 図1A-Cに示されている。
結果パラメータを評価するために重要であるインキュベーションの間の種々の時点がある。我々の研究室で行われる典型的な時間経過後に、すなわち、細胞 - 細胞相互作用は、時間0で、その後3,4および6時間（最大の相互作用が観察された）、分析パラメータを含む相互作用が開始されました。多くの場合、非常に簡単に説明されて適用することができる組織学的分析を超えていくつかの典型的なアッセイ：
T細胞の回収及び分析
8時間までのインキュベーション期間の後、T細胞は、切片から回収することができ、そのようなサイトカインの産生又は増殖のような細胞内エフェクター分子の相対パラメータを分析するために評価することができる。 T細胞を取得するために、切片を、機械的に解離させ、すべての実験条件について一緒にプールした。細胞を2500 rpmで30分間の密度勾配遠心分離後、インターフェイス30％〜50％パーコール（アマシャム、フライブルク、ドイツ）から単離した。このようにして、すぐに、例えばCD8ために、このプロトコルでは、我々が対処する研究に依存して変化した抗体の異なる数及びタイプを使用してフローサイトメトリー技術（FACS）を用いて洗浄し、染色した単核細胞を得ることが可能である+ 18。
図1Dに示すように、ニューロンの健康と機能についての情報は、そのような活動電位（APの）生成などのニューロンの基本的な特性を評価するために、電気生理学的記録等を行うことにより評価することができる。
図1スライスの形態学的構造、ならびに代表的な結果。インキュベーション後のスライス8時間の（A）の形態学的構造。スケールバーは、10μmを示す。 MAPII（緑）、シナプトフィジン（赤）染色の共染色によって明らかにされた（B）ニューロンがシナプス相互接続されている。スケールバーは、10μmを表します。 （C）海馬aのアポトーシス細胞（カスパーゼ3、赤）およびニューロン（NeuNの、緑）の代表的な画像FTER 6時間のインキュベーション。スケールバーは、10μmを表します。 （D）は、マウス皮質ニューロンにおける脱分極電流ステップを次のニューロンの活動電位の世代のシングルセルパッチクランプ記録。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.複数の染色プロトコルの特異性を評価するために行った。 （A）のNogoA（赤色）の同時染色は、成熟オリゴデンドロサイト（のODC）およびカスパーゼ（アポトーシス、緑）のためのマーカーのODCがCD8 + T細胞によって攻撃されることを示している。カスパーゼ（赤）GFAP、グリア細胞（緑）のためのマーカーで共染色されたとき（B）の相互作用の結果が否定的である。スケールバーは、10μmを表す。 （C）Specificiプロトコルのティが左から、カスパーゼ（赤）と神経細胞の共染色（青色DAPI）によって支持されている：WT動物は、WT動物はOTI-I T細胞に曝露し、ODC-卵子およびODC-のOva OTI-I T細胞に曝露した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
別の動物モデルは、MSのような炎症性脱髄性疾患の病理学的特徴に対処するために、最後の数十年にわたって記載されている。 インビボでのマウス及びラットモデルは広く疾患の病態生理学的特徴を模倣するために使用される、すなわち、脱髄及び髄鞘再形成のプロセスの結果の分析炎症および神経変性の混在エピソードの。それにもかかわらず、唯一のex vivoでのアプローチは、正確な基礎となるメカニズムを分析することができます。
急性脳切片の調製物はまた、広く分布したモデルであり、信頼性が高く、複製可能と考えることができる。細胞間相互作用 - の単離およびオリゴデンドロサイト特異的免疫細胞のインキュベーションとの組合せでは、特にメカニズムおよび免疫細胞の攻撃および細胞の動態を研究するという点で、特定の実験的な問題に対処するために使用することができる。他のex vivoでのアプローチが知られており、広くている22を使用するが、すなわち、WTにおいてカスパーゼ3免疫反応性を検証する別の「排除」の同時染色を行うことにより、挑戦することができ、標的の特異性の我々のプロトコルの新規性は、暴露またはOT-I T細胞に曝露されていない（ 図2Cを参照） 。
調製中のいくつかの重要な点は実験方法論正しい実行されることを確実にするために、すなわち実験的な設定、考慮されるべきである。内部妥当性のために、使用される免疫細胞の単離および刺激は例えば、フローサイトメトリー分析（FACS）を介して、定期的に制御されるべきである。また、脳スライスの活力をチェックすることを強くお勧めします。実験群は、年齢および性別を一致させる必要があります。実験は常に、動物福祉の規制を遵守して行われるべきである。
プロトコルのいくつかの制限が念頭に置いておく必要がある。最も重要なことは、提示されたモデルであるex vivoでのアプローチとは完全に自己免疫の中枢神経系障害の複雑な免疫学的状況を模倣するために適していない。また、モデルのみCD8 + T細胞は、免疫応答を駆動し使用することを考慮すべきである。 CD4 + T細胞およびB細胞は、それほど顕著な役割を果たしている。これらの細胞型に対処する際に、他のオリゴデンドロサイト特異的免疫細胞サブタイプを使用して、代替のプロトコルが考慮されるべきである。予想される組織学的所見は乏突起膠細胞（ 図2Aを参照）、神経細胞アポトーシス（ 図1Cを参照）。あるいは、他の細胞型のアポトーシスは、例えば、アストログリアまたはニューロン抗原特異的免疫細胞およびトランスジェニック系を用いて達成することができる。この特定のプロトコルではアストログリア細胞におけるカスパーゼの免疫反応が原因システム（ 図2B）の特異性に否定的だった。
説明されたプロトコルは、基本的な神経と考えることができる免疫学的な実験的アプローチ及び他の用途のために修飾することができる。特異的CD4 + T細胞および-実験手順は、簡単に別の抗原特異的免疫細胞のサブタイプ（ 例えば、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）を使用するとの組み合わせで変化する脳切片（ 例えば、異なるトランスジェニックマウス系統）で他のプロトコルにも適用することができる乏突起膠細胞およびニューロンのアポトーシスに及ぼす影響に対処するためのC57Bl / 6マウスから調製した脳切片）。免疫細胞のインビトロ活性化は、特異的な免疫学的問題（ 例えば、T H 1またはT H 17細胞への偏光）が変化させることができる。
時には、脳スライスで増強または減少したアポトーシスは、実験的な課題かもしれません。トラブルシューティングのためのいくつかの推奨事項は次のとおりです。
まず、脳切片の品質は私達のpH、浸透圧モル濃度と酸化状態と同様に準備時間の非常に依存してEDソリューション。これは、条件が独立した実験の間で同等であることが保証されるべきである。さらに、免疫細胞の活性化は、定期的に制御されるべきである。最適な抗原濃度は異なる場合があります。実験を確立するときに使用した抗原の滴定を考えてみましょう。
上述したように、上記プロトコルは、中枢神経系の完全性に関する更なる免疫細胞のサブタイプ（ 例えば、CD4 + T細胞、B細胞）の効果を分析するための出発点として使用することができる。これらのアプローチは、組織学的分析を徹底的に評価することができるように、オリゴデンドログリア及び神経細胞への影響を分離するために特に適している。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
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