Protocol
Toutes les expériences utilisant des souris doivent être effectuées en conformité avec les directives du comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle respective.
1. Observations générales pour l'expérimentation de la souris
- Gardez les souris dans des conditions exemptes d'agents pathogènes et de leur permettre l'accès à la nourriture et de l'eau ad libitum.
NOTE: Il est important d'utiliser des souris d'âge et le sexe dans les groupes expérimentaux parce que les habitudes immunologiques peuvent varier avec l'âge et le sexe.
2. Préparation des cellules T et l'activation de OVA-spécifiques CD8 + (OT-I)
- Effectuer la stimulation des cellules T OT-I comme décrit ci-dessous cinq jours avant de préparer des tranches de cerveau.
NOTE: 5 x 10 5 effectrices CD8 + activées OT-I des cellules T CD8 + (cellules T de souris transgéniques qui reconnaissent le peptide OVA seule 257-264 dans le contexte de molécules du CMH-I) sont nécessaires par tranche la concentration 5 x 10 5 a été choisi expérienceallié comme optimale une à favoriser une bonne interaction cellule-cellule une fois que les cellules commencent à migrer dans la tranche et, en même temps, la quantité de cellules ne est pas trop élevée pour induire une réaction excessive permettant cellule unique comptant 8,18. - Préparer le milieu de culture de cellules T OT-I. Supplément 500 ml de DMEM avec 5% de sérum de veau foetal (FCS), 10 mM d'HEPES, 2 mM de L-glutamine, 50 pM de 2-mercaptoéthanol, 1% acides aminés non essentiels et 25 ug / ml de gentamicine. Conserver le milieu à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Retirer la rate de souris transgéniques OT-I par référence 16. Les transférer dans le milieu préparé.
- Générer suspension cellulaire unique en écrasant les rates à travers une passoire et centrifuger la suspension de 70 um à 300 g pendant 5 min, 4 ° C.
- Incuber suspension de cellules avec 5 ml de chlorure d'ammonium-potassium (ACK) du tampon (150 mM de NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM d'EDTA, pH 7,3) pendant 5 minutes pour lyser les globules rouges.
- Arrêtez incubatiavec un milieu de 10 ml et on centrifuge à nouveau comme décrit ci-dessus.
- Diluer la suspension de cellules dans un milieu et calculer des nombres. cellules de la plaque à une densité de 3 x 10 7 cellules / puits dans une plaque à 12 puits et on les premier par incubation avec de l'OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) et de l'interleukine 2 (IL-2) (500 UI / ml) pendant 5 jours.
- Après 4 jours, ajouter l'IL-2 à une concentration de 500 UI / mL à nouveau.
- Après stimulation, les cellules T purifier OT-I de la suspension de cellules à l'aide d'une sélection négative à base de souris CD8 + kit d'isolement des cellules T suivant les instructions du fabricant. La purification est basée sur l'épuisement de toutes les cellules CD8 + non en utilisant un cocktail d'anticorps contre CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, CMH de classe II, Ter-119, et TCRy / δ qui sont ensuite mis au rebut en utilisant des colonnes magnétiques pour l'élution des cellules T CD8 + purifiées.
REMARQUE: Les étapes critiques dans ce procre sont indiqués par les constructeurs: il est important que la réaction ne implique que des cellules uniques, car la présence de touffes peut bloquer la colonne lors de l'étape d'élution; le comptage de la cellule avant l'addition du cocktail Byotin est important que le degré de pureté de l'échantillon et le test doit être réalisé sur de la glace pour minimiser les liaisons non spécifiques des anticorps.
3. Préparation des tranches de cerveau aiguë et co-culture avec des cellules T OT-I
- Avant la préparation de cerveau aiguë tranches 19, préparer une solution saline placedine glacée physiologique utilisant le saccharose 200 mM, 20 mM de PIPES, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, mM MgSO 4, 10 0,5 CaCl2 et 10 mM de dextrose et le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) en utilisant 125 mM de NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 mM de NaHCO 3, 2 mM de MgSO 4, 2 mM de CaCl2, 10 mM de dextrose. Ajuster le pH de chaque solution à 7,35 par usinNaOH g. Avant d'ajuster le pH de l'ACSF, solution doit être fait barboter avec un mélange de 95% O 2 et 5% de CO 2.
- Pré-refroidir les solutions.
- Anesthésier 8 - souris âgées 10 semaines (par exemple, C57BL / 6 que le contrôle ou transgénique ODC-OVA souris 17 à l'inhalation en utilisant 5,0% d'isoflurane, 5,0% d'halothane ou injecter 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine de poids corporel par ip Attendre pour l'anesthésie et utiliser une pincée d'orteil pour évaluer le niveau de l'anesthésie et décapiter à la fois. Euthanasier la souris selon protection des animaux et utiliser des critères du comité pour l'euthanasie.
- Mettez la souris en position ventrale. Désinfecter et couper le cuir chevelu sagittalement. Ouvrez l'os crânien sagittal, retirez rapidement le cerveau à l'aide d'une pelle et le fixer sur la plaque d'un vibratome en utilisant de la colle.
- Remplir la plaque avec la solution saline préparée placedine glacée physiologique.
- Couper 300 um coupes coronales avec le vibratome.
NOTE: Cette procédure est connuen pour obtenir des échantillons de tissus intacts viables appropriés pour des études fonctionnelles cellulaires dans un intervalle de temps d'au moins 8 h 19 à 21. En effet, après cette période de temps, commence déjà après 6 h, la préparation montre la qualité réduite, à savoir la modification des propriétés de base et fonctionnelles comme action potentielle génération et la propagation. - Après la coupe, transférer une tranche immédiatement dans chaque puits d'une plaque de 12 puits rempli d'ACSF.
- Ajouter soigneusement 5 x 10 5 cellules T OT-I par tranche.
- Incuber tranches jusqu'à 8 heures dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2).
- Après la période d'incubation, les tranches de récolte et de les intégrer en utilisant octobre composé Tissue-Tek et les congeler dans l'azote liquide. Rangez-les à -20 ° C pour de plus amples études histologiques à par exemple, évaluer la structure neuronale (par exemple, en utilisant anti-MAPII ou des anticorps anti-synaptophysine) ou l'apoptose (par exemple, en utilisant des anti-caspase-3 et des anticorps anti-NeuN anti-corps) selon des procédures standard.
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Representative Results
Après une incubation de coupes de cerveau avec des cellules T d'oligodendrocytes dirigée CD8 +, les oligodendrocytes ainsi que les neurones subissent une apoptose (figures 2A et 1C, respectivement). Signes histologiques de l'apoptose (par exemple, la caspase-3, Tunel) peuvent être détectés plus tôt après 3 heures d'incubation. La période d'incubation ne doit pas être plus long que 8 heures afin de garantir une bonne qualité de la préparation et des résultats reproductibles. Les cellules apoptotiques peuvent être trouvés partout dans la tranche avec prépondérance dans les zones myélinisées. Coloration histologique exemplaire de la tranche pour l'intégrité structurelle et les neurones apoptotiques est représenté dans la figure 1A-C.
Il existe différents moments au cours de l'incubation qui présentent un intérêt pour l'évaluation des paramètres de résultats. Un cours de temps typique effectué dans notre laboratoire comprend des paramètres des analyses, à savoir, les interactions cellule-cellule au temps 0, puis 3, 4 et 6 heures (l'interaction maximale observée) aprèsinteraction démarré. Certains essais typiques au-delà des analyses histologiques qui peuvent souvent être appliquées sont décrites très brièvement:
La récupération et l'analyse des cellules T
Après une période d'incubation allant jusqu'à 8 heures, les cellules T peuvent être récupérés à partir de tranches et peuvent être évaluées pour analyser les paramètres relatifs aux molécules effectrices intracellulaires tels que la production de cytokines ou la prolifération. Afin de récupérer les cellules T, les tranches ont été dissociées mécaniquement et regroupées pour chaque condition expérimentale. Les cellules ont été isolées à partir de l'interface de Percoll (Amersham, Fribourg, Allemagne) après centrifugation à gradient de densité de 30% à 50% pendant 30 min à 2500 rpm. De cette façon, il est possible d'obtenir des cellules mononucléaires qui ont été lavées et colorées immédiatement d'utiliser la cytométrie de flux techniques (FACS) en utilisant un nombre différent et le type d'anticorps qui varient selon l'étude que nous voulons aborder, dans ce protocole, par exemple CD8 + 18.
Informations sur la santé neuronale et la fonctionnalité peut être évaluée en effectuant l'enregistrement électrophysiologique par exemple, pour évaluer les propriétés de base des neurones tels que les potentiels d'action (PA) génération, comme le montre la figure 1D.
Figure 1. Structure morphologique de la tranche ainsi que des résultats représentatifs. (A) de la structure morphologique d'une tranche de 8 heures après incubation. La barre d'échelle indique 10 um. (B) Les neurones sont reliés entre eux par des synapses comme révélé par co-coloration pour MAPII (vert) et la synaptophysine (rouge) coloration. La barre d'échelle représente 10 um. (C) image représentative de cellules apoptotiques (Caspase-3, rouge) et les neurones (NeuN, vert) dans l'hippocampe d'unprès avoir six heures d'incubation. La barre d'échelle représente 10 um. (D) des enregistrements cellule unique patch-clamp d'action neuronale génération de potentiel suivants étapes actuelles dépolarisants dans un neurone cortical murin. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. colorations multiples effectuées pour évaluer spécificité du protocole. (A) Co-coloration des NogoA (rouge), un marqueur de oligodendrocytes matures (ADI) et caspase3 (apoptose, vert) montre que ADI sont attaqués par les cellules T CD8 +. (B) le résultat de l'interaction est négatif lorsque caspase3 (rouge) est co-coloré avec GFAP, un marqueur pour les cellules gliales (vert). La barre d'échelle représente 10 um. (C) specificiTy du protocole est supporté par le co-marquage des cellules neuronales (DAPI, bleu) avec caspase3 (rouge), à partir de la gauche: les animaux WT, WT animaux exposés à des cellules T Oti-I, ODC-Ova et ODC-Ova exposé à cellules T OTI-je. Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Différents modèles animaux ont été décrits au cours des dernières décennies pour répondre aux caractéristiques pathologiques de troubles inflammatoires démyélinisantes comme MS. In vivo des modèles de souris et de rat sont largement utilisés pour imiter les caractéristiques physiopathologiques de la maladie, à savoir, l'analyse des conséquences des processus de démyélinisation et de remyélinisation et des épisodes entremêlées de l'inflammation et de la neurodégénérescence. Néanmoins, seule une approche ex vivo permet de disséquer les mécanismes sous-jacents exactes.
Préparation des tranches de cerveau aigus est aussi un modèle largement distribué et peut être considéré comme fiable et reproductible. En combinaison avec l'isolement et l'incubation des cellules immunitaires spécifiques à l'oligodendrocytes, il peut être utilisé pour traiter des questions expérimentales spécifiques, en particulier en termes de mécanisme et la cinétique d'une attaque immunitaire cellulaire et l'étude de cellule - cellule interactions. Autres ex vivo approches sont connus et largementutilisé 22 mais la nouveauté de notre protocole dans la spécificité de la cible qui peut être contestée en effectuant différentes "exclusion" co-colorations, à savoir la vérification de l'immunoréactivité caspase3 WT exposés ou non exposés à des cellules T OT-I (voir figure 2C) .
Certains points critiques lors de la préparation doivent être prises en considération, à savoir les paramètres expérimentaux, pour se assurer que les expériences sont effectuées méthodologiquement correcte; pour la validité interne, l'isolement et la stimulation des cellules immunitaires utilisés devrait être contrôlée sur une base régulière par l'intermédiaire par exemple, la cytométrie en flux analyses (FACS). En outre, vérifier la vitalité des tranches de cerveau est fortement recommandé. Les groupes expérimentaux devraient être fonction de l'âge et le sexe. Les expériences doivent toujours être effectuées en conformité avec la réglementation de protection des animaux.
Certaines limitations du protocole doivent être gardés à l'esprit. Plus important encore, le modèle présenté estune approche ex vivo et ne est pas adapté à imiter la situation entièrement immunologique complexe de maladies auto-immunes du système nerveux central. Il convient également de considérer que le modèle utilise seulement CD8 + T-cell entraîné réponse immunologique. Lymphocytes T CD4 + et les cellules B jouent un rôle moins important. Ces autres protocoles utilisant d'autres sous-types de cellules immunitaires spécifiques oligodendrocytes devraient être pris en compte se attaquer à ces types de cellules. Le résultat attendu est oligodendrogliale histologique (voir Figure 2A) et l'apoptose neuronale (voir figure 1C). En variante, l'apoptose des autres types de cellules peut être réalisée en utilisant, par exemple, astrogliale ou cellules immunitaires spécifiques de l'antigène et des systèmes neuronaux transgéniques. Dans ce protocole spécifique l'immunoréactivité de caspase3 dans les cellules astrogliales était négative en raison de la spécificité du système (figure 2B).
Le protocole décrit peut être considéré comme une base neuroapproche expérimentale immunologique et peuvent être modifiées pour d'autres applications. La procédure expérimentale peut être facilement appliquée à d'autres protocoles par différentes tranches de cerveau (par exemple, différentes souches de souris transgéniques) en combinaison avec différents sous-types de cellules immunitaires spécifiques de l'antigène (par exemple, utiliser glycoprotéine myéline des oligodendrocytes (MOG) - lymphocytes T CD4 + spécifiques et tranches de cerveau préparés à partir de souris C57BL / 6 pour répondre à leurs effets sur l'apoptose neuronale et oligodendrogliale). In vitro l'activation des cellules immunitaires peuvent varier pour des questions immunologiques spécifiques (par exemple, la polarisation en T H T H 1 ou 17 cellules).
Parfois, l'apoptose accrue ou réduite dans des tranches de cerveau pourrait être un défi expérimental. Quelques recommandations pour le dépannage sont:
Dans un premier temps, la qualité des tranches de cerveau est fortement dépendante du temps de préparation ainsi que la valeur du pH, l'osmolarité et le statut de l'oxydation noussolution éd. Il faut se assurer que les conditions sont comparables entre les expériences indépendantes. En outre, l'activation des cellules immunitaires doit être contrôlée sur une base régulière. Concentration optimale de l'antigène peut varier. Considérons un titrage de l'antigène utilisé pour établir les expériences.
Comme décrit ci-dessus, le protocole mentionné peut être utilisé comme point de départ pour l'analyse de l'effet d'autres sous-types de cellules immunitaires (par exemple, les cellules T CD4 +, cellules B) sur l'intégrité du système nerveux central. Ces approches sont particulièrement adaptés pour la séparation de leurs effets sur les cellules neuronales oligodendrogliales et que l'analyse histologique peut être évaluée complètement.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
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