Protocol
使用小鼠所有实验应根据各自的机构动物护理和使用委员会的指导方针进行。
1.一般注释小鼠实验
- 保持小鼠无病原体的条件下，使它们获得食物和水随意。
注：由于免疫模式可以与年龄和性别的不同是非常重要的使用年龄和性别匹配的小鼠实验组。
2.制备和活化的OVA特异性CD8 + T细胞（OT-I）
- 为准备脑片之前描述如下5天执行OT-I T细胞的刺激。
注：5×10 5活化的效应的CD8 + OT-I的T细胞（CD8 + T细胞的转基因小鼠识别只有OVA 257-264肽的MHC-I类分子的上下文中），需要每片的浓度为5× 10 5被选为实验同盟作为最佳的一种以有利于一个良好的细胞-细胞相互作用，一旦这些细胞开始迁移到切片，并在同一时间，细胞的量不太高，以诱发过度反应，允许单细胞计数8,18。 - 备的OT-I的T细胞培养的培养基。补充500毫升DMEM，5％胎牛血清（FCS），10mM的HEPES，2mM的L-谷氨酰胺，50μM2-巯基乙醇，1％非必需氨基酸和25微克/毫升庆大霉素。储存在4℃直至使用的介质。
- 除去的OT-I转基因小鼠的脾按照参考16。他们转移到准备好的媒介。
- 通过一个70微米的过滤器和离心机悬浮糖化脾脏，在300×g离心5分钟，4℃产生单细胞悬浮液。
- 孵育细胞悬浮液用5ml铵氯化物-钾（ACK），缓冲液（150mM的氯化铵 ，10mM的KHCO 3，0.1mM的EDTA，pH7.3）中进行5分钟，以裂解红细胞。
- 停止incubati上用10毫升培养基并离心再次如上所述。
- 稀释细胞悬浮在培养基中，并计算数字。板的细胞以3×10 7个细胞的密度/孔在12孔板和素它们温育以OVA 257 - 264（SIINFEKL;为1nM）和白细胞介素-2（IL-2）（500国际单位/毫升），用于5天。
- 4天后，/毫升再次添加的IL-2在500国际单位的浓度。
- 随后，以刺激，纯化的OT-I的T细胞，从细胞悬浮液通过使用负选择基于小鼠的CD8 + T细胞分离试剂盒按照生产商的说明。纯化是通过用抗CD4，细胞CD11b，CD11c的，CD19，CD45R（B220），CD49b（DX5），CD105，MHC II类，泰尔-119，和TCRγ的鸡尾酒基于所有非CD8 +细胞的耗竭/δ其中通过使用磁列，用于纯化的CD8 + T细胞的洗脱然后丢弃。
注意：在此程序，可以关键步骤再指示由所述生产：重要的是，该反应仅涉及单个细胞，因为团块的存在可能在洗脱步骤阻止柱;小区添加Byotin鸡尾酒之前计数是用于样品的纯度程度重要并且过程应在冰上进行，以尽量减少非特异性抗体绑定。
3.准备急性脑切片和共培养与OT-I T细胞
- 现有急性脑的制备切片19，制备用200mM的蔗糖，20毫摩尔PIPES，2.5mM的氯化钾，1.25毫的NaH 2 PO 4，10mM的硫酸镁 ，0.5 氯化钙和10mM葡萄糖placedine冰冷的生理盐水溶液和人工脑脊液（ACSF）通过使用125 mM氯化钠，2.5氯化钾，1.25的NaH 2 PO 4，24 mM的碳酸氢钠 ，2毫硫酸镁 ，2毫的CaCl 2，10mM的葡萄糖。由全光照pH调节各溶液，以7.35克NaOH。前调节pH值ACSF的，溶液必须通入95％O 2和5％ 的 CO 2的混合物。
- 预冷却的解决方案。
- 麻醉8 - 10周大的小鼠（ 例如，C57BL / 6对照或转基因的ODC-OVA小鼠17与吸入用5.0％异氟烷，5.0％氟烷或通过IP注射100mg / kg的氯胺酮和10mg / kg体重甲苯噻嗪等待麻醉，并使用脚趾捏来评估麻醉水平和斩首一次他们。安乐死小鼠按照机构动物护理和使用委员会标准安乐死。
- 把鼠标腹位置。消毒，切头皮矢状。打开颅骨矢，迅速用瓢的帮助下取出脑并用胶水将其固定到一个的vibratome的板块。
- 填充板与制备placedine冰冷的生理盐水溶液。
- 削减300微米冠状切片用的vibratome。
注意：这个程序是知道n至得到适合于至少8小时19-21的时间间隔内功能性细胞的研究活完整的组织标本。事实上，在这一段时间内，6小时后已经开始，该制剂显示质量降低的，即改变像动作电位的产生和传播的基本和功能性质。 - 切片后，立即传送一个片成12孔板填充ACSF的每个孔中。
- 每片加小心5×10 5的OT-I的T细胞。
- 孵育切片在培养箱多达8小时（37℃，5％的CO 2）。
- 潜伏期，收获切片后嵌入他们通过使用十月复合组织-TEK，并冻结他们在液氮。存储它们在-20℃用于进一步的组织学研究，以例如评估神经结构（ 例如，使用抗MAPII或抗突触抗体）或细胞凋亡（ 例如，使用抗Caspase-3的抗体和抗的NeuN反体）按照标准方法。
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Representative Results
脑切片与少突胶质细胞定向的CD8 + T细胞的培养后，少突胶质细胞以及神经元凋亡（ 图2A和图1C，分别）。 （ 例如，胱天蛋白酶-3，TUNEL）可以最早3小时孵育后检测细胞凋亡的组织学迹象。潜伏期不应该长于8小时，以保证在制备和可再现的结果的一个良好的品质。细胞凋亡，可以发现全国各地有优势的领域髓切片。片的结构的完整性和凋亡神经元的示例性组织染色中描绘了图1A-C。
有它们的评估结果参数兴趣孵育期间不同的时间点。在我们的实验室中进行的一个典型的时间过程包括分析参数，即，细胞 - 细胞相互作用在时间0时，则图3,4和6小时（最大相互作用观察）后互动开始。以外都非常简单地说明其可以经常被应用于的组织学分析的一些典型分析：
T细胞的恢复和分析
后的潜伏期长达8小时后，T细胞可以从切片中回收，并且可以进行评估，以分析相对于细胞内效应分子的参数如细胞因子产生或细胞增殖。为了检索T细胞，切片分离机械和凝聚为每个实验条件。细胞从界面中分离出30％至50％的Percoll（Amersham公司，弗赖堡，德国）后密度梯度离心30分钟，在2500转。以这种方式，有可能获得一种洗涤并用流式细胞术使用不同数目和类型，它取决于我们想要解决的问题，在这个协议的研究抗体的技术（FACS）立即染色的单核细胞，例如CD8 + 18。
关于神经元的健康和功能的信息可以通过执行电生理记录例如进行评估，以评估神经元的基本性质，如动作电位（接入点）的产生， 如图1D。
图1.切片的形态结构，以及代表性结果。孵育后的片8小时（A） 的形态结构。比例尺为10微米。 （B）的神经元突触被互连所揭示的共染色MAPII（绿色）和突触素（红色）染色。比例尺条为10微米。 （C）的凋亡细胞（Caspase-3的，红色）和神经元（神经元核抗原，绿色）在海马一个的代表性图像压脚提升6小时孵化。比例尺条为10微米。 （D）的神经动作电位的产生遵循小鼠皮层神经元的去极化电流的步骤单细胞膜片钳记录。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.多重染色以评估协议的特异性。 （A） 的共染色NogoA（红），一个标记为成熟少突胶质细胞（ODCS）和Caspase3（凋亡，绿色）显示ODCS由CD8 + T细胞的攻击。 （B）的相互作用的结果是否定的时的Caspase3（红色）是共沾上GFAP，标记为神经胶质细胞（绿色）。比例尺代表10微米。 （C）Specifici该协议的TY用的Caspase3（红色）支持神经元细胞的共染色（DAPI，蓝色），从左边开始：WT动物，野生动物暴露于OTI-I的T细胞，ODC-OVA和ODC-OVA暴露在OTI-I T细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
不同的动物模型已经描述在过去的几十年来解决的炎性脱髓鞘疾病如MS的病理特征。 体内小鼠和大鼠模型被广泛用于模拟疾病的病理生理特征，即，脱髓鞘和髓鞘再生过程的后果分析和炎症和神经退行性疾病的混合体发作。然而，只有一个离体方法允许解剖确切基本机制。
也是急性脑切片制备一个广泛分布的模型，并可以被认为是可靠的和可复制的。在与隔离和少突胶质细胞特异性免疫细胞温育结合，它可用于处理特定的实验问题，特别是在研究机构和免疫细胞攻击和细胞的动力学方面 - 细胞相互作用。其它体外方法是已知的和广泛使用22但我们可以通过执行不同的“排斥”共染色，即验证的Caspase3免疫反应中的WT暴露或不暴露于的OT-I的T细胞被挑战目标的特异性协议的新颖性（ 见图2C） 。
在制备过程中的一些关键点，应考虑到，即该实验设置，以确保试验被执行方法论正确;对内部效度，隔离和所使用的免疫细胞的刺激应控制在经由例如定期，流式细胞术分析（FACS）。此外，脑切片检查的生命力强烈推荐。实验组应该是年龄和性别匹配的。实验中应始终遵循动物福利法规的规定执行。
该协议的一些限制需要牢记。最重要的是，所提出的模型是离体方法，不适合于完全模仿的自身免疫性中枢神经系统疾病的复杂的免疫状况。还应当考虑到该模型仅使用CD8 + T细胞驱动的免疫应答。 CD4 + T细胞和B细胞中发挥以下显着的作用。使用其他的少突胶质细胞特异性免疫细胞亚型的替代方案应针对这些类型的细胞时予以考虑。预期的组织学发现是少突胶质细胞（参见图2A）和神经细胞凋亡（参见图1C）。可替代地，其它类型的细胞的凋亡可使用例如，星形胶质细胞或神经元的抗原特异性免疫细胞和转基因系统来实现。在这个特定的协议的Caspase3在星形胶质细胞中的免疫反应性为阴性，由于系统（ 图2B）的特异性。
所描述的协议可以被认为是一个基本神经免疫学实验方法，并且可以被修改为其它的应用程序。特异性CD4 + T-细胞和-的实验程序可以与不同抗原特异性免疫细胞亚群（ 例如，使用髓鞘少突胶质糖蛋白（MOG）的组合很容易地应用到其他协议，通过改变脑切片（ 例如，不同的转基因小鼠品系）从C57BL / 6小鼠制备，以解决对少突胶质细胞和神经元细胞凋亡的作用的脑切片）， 在体外激活免疫细胞可以被改变为特定的免疫学的问题（ 例如，偏振成T H 1或T H 17细胞）。
有时，在脑切片的增强或降低的细胞凋亡可能是一个实验的挑战。故障排除一些建议：
起初，脑切片的质量高度依赖的准备时间，以及我们的pH值，同渗容摩和氧化状态编辑解决方案。它应当确保条件可比的独立实验之间。此外，活化免疫细胞应定期进行控制。最佳抗原浓度可以变化。考虑所使用的抗原的滴定建立实验时。
如上所述，所提到的协议可以用作起始点，用于分析的进一步的免疫细胞亚群（ 例如，CD4 + T细胞，B细胞）对中枢神经系统的完整性的影响。这些方法是特别适合用于分离其上少突胶质细胞和神经细胞的效果的组织学分析可以彻底评估。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
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