Protocol
כל הניסויים באמצעות עכברים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית, בהתאמה.
1. הערות כלליות לניסויים בעכבר
- שמור על העכברים בתנאי הפתוגן ללא ולאפשר להם גישה כלרצונך מזון ומים.
הערה: חשוב להשתמש בעכברי גיל והתאמת מין בקבוצות ניסוי כי דפוסים חיסוניים יכולים להשתנות עם גיל ומין.
2. CD8 + T לתאי הכנה והפעלה של OVA ספציפי (OT-I)
- לבצע גירוי של תאי OT-T אני כמתואר להלן 5 ימים לפני הכנת פרוסות מוח.
הערה: 5 x 10 5 מפעיל מופעל CD8 + OT-אני תאי T ריכוז 5 x (CD8 + T-תאים של עכברים הטרנסגניים הכרת פפטיד OVA 257-264 רק בהקשר של מולקולות MHC-I) יש צורך לכל פרוסה 10 5 נבחר ניסויברית כאופטימלית לטובת אינטראקציה תאי תאים טובה ברגע שהתאים מתחילים נודדים לפרוסה ו, באותו הזמן, את כמות התאים היא לא גבוהה מדי כדי לגרום לתגובת יתר המאפשר תא בודד ספירת 8,18. - הכן את המדיום לculturing OT-T-תאים. להשלים DMEM 500 מיליליטר עם 5% עוברי עגל בסרום (FCS), 10 מ"מ HEPES, L-גלוטמין 2 מ"מ, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, חומצות אמינו החיוני 1% ו- 25 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. אחסן הבינוני על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- הסר את הטחול של עכברים הטרנסגניים OT-כמו לכל התייחסות 16. העבר אותם למדיום מוכן.
- צור השעיה תא בודדת על ידי רסוק טחולים דרך מסננת השעיה ו צנטריפוגות 70 מיקרומטר ב XG 300 דקות 5, 4 ° C.
- דגירה השעיה תא עם 5 מיליליטר אמוניום כלוריד, אשלגן (ACK) חיץ (150 מ"מ NH 4 Cl, 10 מ"מ KHCO 3, 0.1 מ"מ EDTA, pH 7.3) במשך 5 דקות כדי lyse תאי דם אדומים.
- להפסיק incubatiעל עם מדיום 10 מיליליטר ו צנטריפוגות זה שוב כפי שתואר לעיל.
- לדלל השעיה התא בינוני ולחשב מספרים. פלייט תאים בצפיפות של 3 x 10 7 תאים / גם בצלחת 12 גם ו ראש על ידי דגירה עם OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 ננומטר) ואינטרלוקין 2 (IL-2) (500 IU / ml) ל 5 ימים.
- לאחר 4 ימים, להוסיף IL-2 בריכוז של 500 IU / ml שוב.
- לאחר גירוי, לטהר OT-אני תאי T מהשעית תא באמצעות עכבר סלקציה שלילי מבוסס ערכת בידוד תא T CD8 + הבאים הוראות יצרן. טיהור מבוססת על הדלדול של כל מי שאינו CD8 + התאים באמצעות קוקטייל של נוגדנים נגד CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Class II, Ter-119, וTCRγ / Δ אשר לאחר מכן הושלך על ידי שימוש בעמודות מגנטיות עבור elution של CD8 + T לתאים המטוהרים.
הערה: צעדים קריטיים בprocedu זהמחדש מסומנים על ידי מייצר: חשובה שהתגובה כרוכה רק תאים בודדים, כי הנוכחות של גושים יכולה לחסום את הטור במהלך שלב elution; הספירה של התא לפני הוספת קוקטייל Byotin חשובה לתואר של טוהר של המדגם וההליך צריכה להתבצע על קרח כדי למזער איגודי נוגדן נוקבים.
3. הכנת פרוסות המוח חריפה ושיתוף התרבות עם OT-אני תאי T
- לפני הכנת המוח החריף פרוס 19, להכין פתרון placedine קר כקרח פיסיולוגי מלוח באמצעות 200 סוכרוז מ"מ, 20 מ"מ צינורות, 2.5 מ"מ KCL, 1.25 דקסטרוז 0.5 CaCl 2 ו -10 מ"מ לאא 2 PO 4, 10 מ"מ MgSO 4, ומלאכותי נוזל השדרתי (ACSF) באמצעות 125 mM NaCl, 2.5 KCl, 1.25 לאא 2 PO 4, 24 מ"מ NaHCO 3, 2 מ"מ MgSO 4, 2 מ"מ CaCl 2, 10 מ"מ דקסטרוז. התאם את ה- pH של כל פתרון ל7.35 על ידי using NaOH. לפני התאמת pH של ACSF, פתרון חייב להיות בועות בתערובת של 95% O 2, 5% CO 2.
- טרום לקרר את הפתרונות.
- הרדימי 8 - עכברים 10 שבוע ישנים (למשל, C57Bl / 6 כשליטה או עכברי ODC-OVA מהונדסים 17 עם שאיפה באמצעות isoflurane 5.0%, 5.0% halothane או להזריק 100 מ"ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ"ג / xylazine קילוגרם משקל גוף באמצעות ה- IP חכה להרדמה ולהשתמש בקמצוץ הבוהן כדי להעריך את הרמה של הרדמה ולערוף אותם בבת אחת. להרדים את העכברים כמו לכל טיפול בבעלי חיים מוסדי ולהשתמש בקריטריוני וועדה להמתת חסד.
- שים עכבר בעמדת הגחון. לחטא ולחתוך קרקפת sagittally. פתח את עצם גולגולת sagitally, להסיר את המוח במהירות בעזרת סקופ ולתקן אותה על הצלחת של vibratome באמצעות דבק.
- מלא את הצלחת עם הפתרון מוכן placedine קר כקרח הפיזיולוגי מלוח.
- חותך 300 מיקרומטר פרוסות העטרה עם vibratome.
הערה: הליך זה הוא יודעn להניב דגימות רקמה שלמות קיימא מתאימות ללימודים סלולריים פונקציונליים בתוך פרק זמן של לפחות 8 שעות 19-21 זמן. ואכן, לאחר פרק זמן זה, כבר מתחיל לאחר 6 שעות, הכנת תערוכות איכות מופחתת, כלומר שינויים במאפיינים בסיסיים ופונקציונליים כמו דור פוטנציאל פעולה והפצה. - לאחר חתך, להעביר פרוסה אחת מייד לבאר כל צלחת 12 גם מלא בACSF.
- בזהירות להוסיף 5 x 10 5 תאי OT-T אני לכל פרוסה.
- דגירה פרוסות לתקופה של עד 8 שעות בחממה (37 ° C, 5% CO 2).
- לאחר תקופת הדגירה, פרוסות קציר ולהטביע אותם על ידי שימוש ברקמה-tek מתחם OCT ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. לאחסן אותם ב -20 ° C ללימודים היסטולוגית נוספים לדוגמה, להעריך מבנה עצבי (למשל, אנטי-MAPII באמצעות או נוגדנים נגד synaptophysin) או אפופטוזיס (למשל, באמצעות אנטי caspase-3 נוגדנים ואנטי-אנטי NeuNגופים) על פי נהלים קבועים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר הדגירה של פרוסות מוח עם CD8 + תאי T-מכוון oligodendrocyte, oligodendrocytes כמו גם נוירונים עוברים אפופטוזיס (2A דמויות ו1C, בהתאמה). סימנים היסטולוגית של אפופטוזיס (למשל, caspase-3, Tunel) ניתן לאתרם מוקדמים לאחר 3 שעות של דגירה. תקופת דגירה לא צריכה להיות ארוכה יותר מ- 8 שעות על מנת להבטיח את איכות טובה של ההכנה ותוצאות לשחזור. ניתן למצוא תאים אפופטוטיים בכל רחבי פרוסה עם עליונות באזורי myelinated. צביעה היסטולוגית למופת של הפרוסה לשלמות מבנית ונוירונים אפופטוטיים מתוארת באיור 1 א-ג.
יש נקודות זמן שונות במהלך הדגירה יש בם עניין להערכת פרמטרים תוצאה. כמובן זמן טיפוסי מבוצעים במעבדה שלנו כולל פרמטרים מנתח, כלומר, אינטראקציות תא-תא בזמן 0, ואז 3, 4 ו- 6 שעות (האינטראקציה המקסימלי שנצפו) לאחר האינטראקציה התחילה. כמה מבחני טיפוסיים מעבר ניתוחים היסטולוגית אשר לעתים קרובות יכול להיות מיושמים מתוארות בקצרה:
התאוששות T-cell וניתוח
לאחר תקופת דגירה של עד 8 שעות, ניתן לשחזר תאי T מפרוסות וניתן להעריך לנתח פרמטרים ביחס למולקולות מפעיל תאיות כגון ייצור ציטוקינים או הפצה. כדי לאחזר תאי T, פרוסות היו מנותקות באופן מכאני ותקווינה ביחד לכל תנאי ניסוי. תאים היו מבודדים מהממשק 30% עד 50% Percoll (Amersham, פרייבורג, גרמניה) לאחר צנטריפוגה שיפוע הצפיפות למשך 30 דקות ב -2,500 סל"ד. בדרך זו, ניתן להשיג תאי mononuclear שנשטפו ומוכתם באופן מיידי באמצעות זרימת cytometry טכניקות (FACS) באמצעות מספר וסוג שונים של נוגדנים המשתנים בהתאם למחקר שאנחנו רוצים לדבר, בפרוטוקול זה, למשל CD8 + 18.
> נזק "jove_content" עצבי בטחונות ופונקציונליות
מידע על בריאות ופונקציונליות עצביות ניתן להעריך על ידי ביצוע למשל הקלטת אלקטרו, כדי להעריך את המאפיינים בסיסיים של תאי העצב כגון פוטנציאל פעולת דור (APS), כפי שמוצג באיור 1D.
איור 1. מבנה מורפולוגי של הפרוסה, כמו גם תוצאות נציג. () מבנה מורפולוגי של פרוסת שעה 8 לאחר דגירה. בר סולם עולה 10 מיקרומטר. נוירונים (ארוחת בוקר) synaptically קשורים כפי שנחשפו על ידי שיתוף מכתים לMAPII (ירוקה) וsynaptophysin צביעה (אדום). בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. תמונה מייצגת של תאים אפופטוטיים (caspase-3, אדום) ותאי עצב (NeuN, ירוק) בהיפוקמפוס (C)דגירה שעה חרה 6. בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. (ד) הקלטות תיקון מהדק תא יחיד של דור פוטנציאל פעולה עצבית ביצוע שלבים הנוכחיים depolarizing בנוירון בקליפת המוח עכברי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. stainings מרובה איור בוצע על מנת להעריך specifity של הפרוטוקול. () Co-הכתמה של NogoA (אדום), כסמן לoligodendrocytes הבוגרת (ODCs) וCaspase3 (אפופטוזיס, ירוק) מראה כי ODCs מותקף על ידי תאי CD8 + T. התוצאה (B) אינטראקציה שלילית כאשר Caspase3 (אדום) היא שיתוף מוכתם עם GFAP, סמן לתאי גליה (ירוקה). בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. (C) Specificity של הפרוטוקול נתמך על ידי שיתוף צביעת תאים עצביים (DAPI, הכחול) עם Caspase3 (אדום), החל מהשמאל: בעלי החיים WT, בעלי חיים שנחשפו לWT-OTI אני תאי T, ODC-ביציות וODC-ביציות נחשף לתאי OTI-T אני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים של בעלי חיים שונים תוארו בעשורים האחרונים לטיפול במאפייני פתולוגיים של הפרעות demyelinating דלקתיות כמו טרשת נפוצה. בvivo מודלים עכבר והחולדה נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות את תכונות pathophysiological של המחלה, כלומר, ניתוח של ההשלכות של תהליכי demyelination וחידוש יצירת המיאלין ושל פרקים מתמזגים של דלקת וניוון של מערכת עצבים. עם זאת, רק גישה vivo לשעבר מאפשרת לנתח את המנגנונים העומדים בבסיס המדויק.
הכנת פרוסות מוח חריפות היא גם מודל לתפוצה רחבה ויכולה להיחשב כאמין ושכפול. בשילוב עם הבידוד והדגירה של תאי מערכת חיסון oligodendrocyte ספציפי, ניתן להשתמש בו כדי לענות על שאלות ניסוי ספציפיות, במיוחד במונחים של לימוד מנגנון וקינטיקה של התקפת תא ותא חיסון - אינטראקציות תא. vivo לשעבר גישות אחרות ידועות ונרחבותמשמש 22 אבל החידוש של הפרוטוקול שלנו בהספציפיות של היעד שניתן לערער על ידי ביצוע שיתוף stainings "הדרה" שונה, כלומר אימות immunoreactivity Caspase3 בWT נחשף או לא נחשף לתאי OT-T אני (ראה איור 2 ג) .
כמה נקודות קריטיות בעת העריכה צריכה להילקח בחשבון, כלומר ההגדרות הניסיוניות, כדי להבטיח שניסויים מבוצעים נכונים מתודולוגית; לתוקף פנימי, בידוד וגירוי של התאים חיסוניים המשמשים צריך להיות מבוקר על בסיס קבוע באמצעות למשל, cytometry זרימת ניתוחים (FACS). יתר על כן, חיוניות בדיקה של פרוסות מוח מומלצת מאוד. קבוצות ניסוי צריכה להיות לגיל ומין בהתאמה. תמיד צריכים להיות ביצעו ניסויים בעמידה בתקנות צער בעלי חיים.
מגבלות מסוימות של הפרוטוקול צריכים להיות כל הזמן בראש. והכי חשוב, המודל שהוצג הואגישה לשעבר vivo אינה מתאימה לחקות את המצב החיסוני המורכב של הפרעות במערכת עצבים מרכזיות באופן מלא אוטואימוניות. צריך להיות גם נחשב כי המודל משתמש CD8 + T-cell רק מונע תגובה חיסונית. CD4 + T לתאים ותאי B יש תפקיד פחות בולט. פרוטוקולים חלופיים באמצעות תת תא חיסון oligodendrocyte הספציפי אחרים יש לשקול בעת טיפול בסוגי התאים. הממצא היסטולוגית הצפוי הוא oligodendroglial (ראה איור 2 א) ואפופטוזיס העצבי (ראה איור 1 ג). לחלופין, אפופטוזיס של סוגי תאים אחרים יכול להיות מושגת באמצעות למשל, astroglial או תאי מערכת חיסון אנטיגן הספציפי עצביים ומערכות מהונדסים. בפרוטוקול ספציפי זה immunoreactivity של Caspase3 בתאי astroglial היה שלילי בשל ייחודה של המערכת (איור 2).
הפרוטוקול המתואר יכול להיחשב כנוירו בסיסיגישה ניסויית חיסונית ועשויה להיות שונה עבור יישומים אחרים. ההליך ניסיוני יכול להיות מיושם בקלות לפרוטוקולים אחרים על ידי פרוסות שונות במוח (למשל, זני עכברים הטרנסגניים שונים) בשילוב עם תת-סוגים שונים אנטיגן הספציפי לתאי מערכת חיסון (למשל, להשתמש בגליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין (ש"א) - CD4 + T הספציפי לתאים ו פרוסות המוח הוכנו מC57Bl עכברים / 6 כדי לטפל בהשפעות שלהם על oligodendroglial ואפופטוזיס העצבי). הפעלה במבחנה של תאי מערכת חיסון יכולות להיות מגוונות לשאלות חיסוניות ספציפיות (למשל, קיטוב לT H 1 או T H 17 תאים).
לפעמים, אפופטוזיס מוגבר או מופחת בפרוסות מוח עשוי להיות אתגר ניסיוני. המלצות לפתרון בעיות מסוימות הן:
בתחילה, איכות פרוסות מוח תלויה מאוד זמן הכנה, כמו גם מעמד ערך ה- pH, osmolarity וחמצון שלנופתרון ed. יש להבטיח כי תנאים דומים בין הניסויים בלתי תלויים. יתר על כן, הפעלת תאים חיסוניים צריכה להיות מבוקרת על בסיס קבוע. ריכוז אנטיגן אופטימלי עשוי להשתנות. שקול טיטרציה של אנטיגן משמש בעת הקמת הניסויים.
כפי שתואר לעיל, הפרוטוקול שהוזכר יכול לשמש כנקודה מוצא לניתוח ההשפעה של תת תא חיסון נוסף (לדוגמא, CD4 + T לתאים, B-תאים) על תקינות מערכת עצבים מרכזית. גישות אלו הן מתאימות במיוחד להפרדה השפיעה על תאי oligodendroglial ועצביים כניתוח היסטולוגית ניתן להעריך באופן יסודי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
- Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
- Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
- Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
- Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
- Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
- Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
- Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
- Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
- Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
- Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
- Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
- Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121 (2013).
- Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
- McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
- Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
- Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41 (2012).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
- Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
- Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).
