Protocol
Todos os experimentos com ratos deve ser realizado em conformidade com as orientações do respectivo comitê de cuidados com os animais e uso institucional.
1. Comentários gerais para mouse Experiments
- Mantenha os ratos em condições livres de patógenos e permitir-lhes o acesso a comida e água ad libitum.
NOTA: É importante o uso de ratos da mesma idade e sexo em grupos experimentais porque os padrões imunológicos podem variar de acordo com idade e sexo.
2. As células T específicas de OVA-preparação e activação de células CD8 + (OT-I)
- Realize a estimulação das células T OT-I, conforme descrito abaixo cinco dias antes de preparar fatias de cérebro.
NOTA: 5 x 10 5 efectoras activadas CD8 + OT-I de células T (CD8 + T-células de ratinhos transgénicos que reconhecem apenas o peptídeo OVA 257-264, no contexto das moléculas MHC-I) são necessários por fatia Os concentração de 5 x 10 5 foi escolhido experimentoaliado como uma óptima para favorecer uma interacção célula-célula boa uma vez que as células começam a migrar para o corte e, ao mesmo tempo, a quantidade de células não é demasiado elevada para induzir uma reacção excessiva permitindo que uma única célula contando 8,18. - Preparar o meio para a cultura de células T OT-I. Suplemento 500 ml de DMEM com 5% de soro fetal de vitelo (FCS), 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina, 50 uM de 2-mercaptoetanol, 1% de aminoácidos não essenciais e 25 ug / ml de gentamicina. Armazenar o meio a 4 ° C até à sua utilização.
- Retire o baço de OT-I camundongos transgênicos como por referência 16. Transferi-los para o meio preparado.
- Gerar suspensão de células individuais triturando os baços através de uma peneira de centrifugação e suspensão de 70 mm a 300 xg durante 5 min, 4 ° C.
- Incubar suspensão de células com 5 ml de cloreto de amónio-potássio (ACK) de tampão (150 mM de NH4Cl, 10 mM de KHCO3, 0,1 mM de EDTA, pH 7,3) durante 5 minutos para lisar as células vermelhas do sangue.
- Pare incubaticom 10 ml de meio e centrifuga-se novamente conforme descrito acima.
- Diluir suspensão de células em médio e calcular números. As células em placas a uma densidade de 3 x 10 7 células / poço numa placa de 12 poços e eles privilegiada por incubação com OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) e a interleucina 2 (IL-2) (500 UI / ml) durante 5 dias.
- Após 4 dias, adicionar IL-2 a uma concentração de 500 UI / ml, novamente.
- Após a estimulação, purificar as células T OT-I a partir de suspensão de células usando um mouse negativo seleção baseada kit de isolamento de células T CD8 +, seguindo as instruções do fabricante. A purificação é baseado na depleção de todas as células não-CD8 +, utilizando um cocktail de anticorpos contra CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC de Classe II, Ter-119, e TCRγ / δ que são então descartados utilizando colunas magnéticas para a eluição das células T CD8 + purificadas.
NOTA: As etapas críticas neste procedure são indicados pelos fabricantes: é importante que a reacção envolve apenas as células individuais, pois a presença de aglomerados pode bloquear a coluna durante o passo de eluição; contagem da célula antes de adicionar o cocktail Byotin é importante para o grau de pureza da amostra e o procedimento deve ser realizado em gelo para minimizar vinculações anticorpos inespecíficos.
3. Preparação de fatias do cérebro do aguda e Co-cultura com células T OT-I
- Antes da preparação de fatias cerebrais agudas 19, preparar uma solução fisiológica gelada placedine salina utilizando 200 mM de sacarose, PIPES 20 mM, KCl 2,5 mM, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 10 mM de MgSO4, dextrose 0,5 CaCl 2 e 10 mM e fluido cerebrospinal artificial (ACSF), utilizando NaCl a 125 mM, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, mM de NaHCO 3 24, 2 mM MgSO4, 2 mM de CaCl2, 10 mM de dextrose. Ajustar o pH de cada solução a 7,35 por using de NaOH. Antes de ajustar o pH da ACSF, solução deve ser borbulhado com uma mistura de 95% de O2 e 5% de CO 2.
- Pré-resfriar as soluções.
- Anestesiar 8 - camundongo de 10 semanas de idade (por exemplo, C57BL / 6 como controlo ou ratinhos transgénicos ODC OVA-17 com a inalação usando 5,0% de isoflurano, 5,0% de halotano ou injectar 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de peso corporal de xilazina via ip Espera para anestesia e usar uma pitada de igual para avaliar o nível de anestesia e decapitá-los de uma só vez. Euthanize os ratos como por cuidados com os animais institucional e utilizar critérios da comissão para a eutanásia.
- Coloque o mouse em posição ventral. Desinfetar e corte sagital couro cabeludo. Abra o osso craniano sagitalmente, retire o cérebro rapidamente com a ajuda de uma colher e corrigi-lo sobre a placa de um vibratome usando cola.
- Encher o prato com a solução salina preparada placedine gelada fisiológico.
- Corte 300 mm cortes coronais com o vibratome.
NOTA: Este procedimento é sabern, para se obter amostras de tecido intactas viáveis adequados para estudos celulares funcionais dentro de um intervalo de tempo de pelo menos 8 h 19-21. De fato, após este período de tempo, já começando após 6 horas, a preparação mostra qualidade reduzida, ou seja, mudanças nas propriedades básicas e funcionais, como ação potencial de geração e propagação. - Após a secção, transferir uma fatia imediatamente em cada poço de uma placa de 12 poços preenchidos com ACSF.
- Adicione cuidadosamente 5 x 10 5 células OT-I T por fatia.
- Incubar fatias de até 8 horas, numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2).
- Após o período de incubação, as fatias de colheita e de incorporá-los usando outubro composto tecido-tek e congelá-los em nitrogênio líquido. Armazená-las a -20 ° C durante mais estudos histológicos para, por exemplo, avaliar a estrutura neuronal (por exemplo, utilizando anticorpo anti-MAPII ou anticorpos anti-sinaptofisina) ou apoptose (por exemplo, utilizando caspase 3 anti-anti-anticorpos e de anti-NeuNorganismos) de acordo com procedimentos padrão.
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Representative Results
Após a incubação de fatias de cérebro com as células T CD8 dirigida-oligodendrócitos +, oligodendrócitos, bem como neurónios, sofrem apoptose (Figuras 2A e 1C, respectivamente). Sinais histológicos de apoptose (por exemplo, caspase-3, Tunel) pode ser mais antigo detectado após 3 horas de incubação. O período de incubação não deve ser maior do que 8 horas, a fim de garantir uma boa qualidade da preparação e reprodutibilidade dos resultados. Células em apoptose pode ser encontrada em todo o slice com preponderância em áreas mielinizadas. Coloração histológica exemplar da fatia para a integridade estrutural e os neurónios apoptóticas é representada na Figura 1A-C.
Existem diferentes pontos de tempo durante a incubação que são de interesse para avaliar parâmetros de resultados. Um curso de tempo típico realizados no nosso laboratório de análises inclui parâmetros, a saber, as interacções célula-célula nos instantes 0, em seguida, 3, 4 e 6 h (a interacção máxima observada) depoisinteracção iniciado. Alguns ensaios típicos além de análises histológicas, que muitas vezes podem ser aplicadas são descritos de forma muito breve:
Recuperação e análise de células T
Após um período de incubação de até 8 horas, as células T podem ser recuperados a partir de fatias e podem ser avaliadas para analisar os parâmetros relativos às moléculas efectoras intracelulares, tais como a produção ou proliferação de citocinas. A fim de recuperar as células T, as fatias foram dissociadas mecanicamente e agrupados para cada condição experimental. As células foram isoladas a partir da interface a 30% a 50% de Percoll (Amersham, Freiburg, Alemanha) após centrifugação em gradiente de densidade durante 30 min a 2.500 rpm. Desta forma, é possível obter células mononucleares que foram lavados e corados imediatamente usando técnicas de citometria de fluxo (FACS), utilizando um número diferente e tipo de anticorpos, que variam dependendo do estudo, quer para tratar, neste protocolo, por exemplo CD8 + 18.
Informação sobre a saúde neuronal e funcionalidade pode ser avaliada através da realização de electrofisiológico gravação por exemplo, para avaliar as propriedades dos neurónios tais como potenciais de acção (AP) geração, como mostrado na Figura 1D.
Figura 1. estrutura morfológica da fatia, bem como resultados representativos. (A) estrutura morfológica de uma fatia de 8 horas após a incubação. A barra de escala indica 10 um. (B) Os neurónios são interligados sinapticamente, como revelado por co-coloração para MAPII (verde) e sinaptofisina (vermelho) coloração. A barra de escala representa 10 um. (C) imagem representativa de células em apoptose (Caspase-3, vermelho) e neurônios (NeuN, verde) no hipocampo umepois de 6 de incubação hr. A barra de escala representa 10 um. (D) gravações de uma única célula de patch-clamp de ação neuronal potencial de geração seguintes etapas atuais de despolarização em um neurônio cortical murino. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Várias colorações realizados para avaliar a especificidade do protocolo. (A) Co-coloração de NogoA (vermelha), um marcador de oligodendrócitos maduros (ODCs) e Caspase3 (apoptose, verde) mostra que ODCs são atacados por células T CD8 +. (B) Interação resultado é negativo quando Caspase3 (vermelho) é co-corados com GFAP, um marcador para células gliais (verde). Barra de escala representam 10 um. (C) Specificity do protocolo é suportado por co-coloração de células neuronais (DAPI, azul) com Caspase3 (vermelho), a partir da esquerda: animais WT, WT animais expostos a células T OTI-I, ODC-Ova e ODC-Ova expostas a células OTI-I T. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Diferentes modelos animais foram descritos nas últimas décadas para abordar as características patológicas de doenças desmielinizantes inflamatórias como MS. Modelos in vivo em ratinhos e ratos são amplamente utilizados para imitar aspectos fisiopatológicos da doença, ou seja, a análise das consequências de processos de desmielinização e remielinização e de episódios de permeio de inflamação e neurodegeneração. No entanto, só uma abordagem ex vivo permite dissecar os mecanismos exatos subjacentes.
Preparação de fatias cerebrais agudas é também um modelo amplamente distribuída e pode ser considerada como fiável e reproduzível. Em combinação com o isolamento e incubação de células imunitárias, específicas de oligodendrócitos, pode ser utilizado para abordar questões específicas experimentais, especialmente em termos de mecanismo e estudar a cinética de um ataque de células e células imunitárias - interacções celulares. Outras abordagens ex vivo são conhecidos e amplamenteutilizado 22, mas a novidade do nosso protocolo na especificidade do alvo que pode ser contestada através da realização de diferentes "exclusão" colegas de colorações, ou seja, a verificação da immunoreactivity Caspase3 no WT expostos ou não expostos a células OT-I T (veja a Figura 2C) .
Alguns pontos críticos durante a preparação deve ser tida em consideração, isto é, as configurações experimentais, para garantir que as experiências são realizadas metodológica correcta; para validade interno, o isolamento e a estimulação das células imunes usadas devem ser controlados numa base regular, por exemplo por meio de citometria de fluxo (análise FACS). Além disso, a verificação vitalidade de fatias do cérebro é altamente recomendado. Os grupos experimentais deve ser equivalente em idade e sexo. Experimentos deve sempre ser realizado em conformidade com as regulamentações de bem-estar animal.
Algumas limitações do protocolo necessita de ser mantido em mente. Mais importante, o modelo é apresentadouma abordagem ex vivo e não é adequado para imitar completamente a situação imunológica complexa de desordens auto-imunes do sistema nervoso central. Também deve ser considerado que o modelo utiliza apenas de células T CD8 + conduzido resposta imunológica. As células T CD4 + e as células B desempenham um papel menos proeminente. Protocolos alternativos que utilizam outros subtipos de células imunes específicas de oligodendrócitos devem ser considerados ao abordar estes tipos de células. A demonstração histológica é esperado oligodendroglial (ver Figura 2A) e a apoptose neuronal (ver Figura 1C). Alternativamente, a apoptose de outros tipos de células pode ser conseguida utilizando, por exemplo, astroglial ou células imunitárias, específicas de antigénios neuronais e sistemas transgénicos. Neste protocolo específico, a imunorreactividade de Caspase3 em células gliais era negativo, devido à especificidade do sistema (Figura 2B).
O protocolo descrito pode ser considerado como um neuro básicaabordagem experimental imunológico e podem ser modificados para outras aplicações. O procedimento experimental pode ser facilmente aplicado a outros protocolos de diferentes fatias de cérebro (por exemplo, diferentes estirpes de ratos transgénicos) em combinação com diferentes subtipos de células imunes específicas de antigénio (por exemplo, utilizar a glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG) - células T CD4 + e específico fatias de cérebro preparados a partir de ratinhos C57BL / 6 para tratar os seus efeitos sobre oligodendroglial e neuronal). apoptose in vitro a activação de células imunitárias pode ser variada para questões imunológicas específicas (por exemplo, a polarização em T H 1 ou T H 17 células).
Às vezes, melhorados ou reduziu a apoptose em fatias de cérebro pode ser um desafio experimental. Algumas recomendações para solução de problemas são:
No primeiro, a qualidade de fatias do cérebro é altamente dependente do tempo de preparação, bem como o status de valor de pH, osmolaridade e oxidação de nóssolução ed. Deve assegurar-se que as condições são comparáveis entre os experimentos independentes. Além disso, a activação de células imunitárias devem ser controlados numa base regular. Concentração de antígeno Optimal podem variar. Considere a titulação do antigénio utilizado ao estabelecer os experimentos.
Como descrito acima, o protocolo mencionado pode ser utilizado como ponto de partida para analisar o efeito de outros subtipos de células imunes (por exemplo, células T CD4 +, células B) na integridade do sistema nervoso central. Estas abordagens são especialmente adequadas para separar os seus efeitos em células neuronais como oligodendrogliais e análise histológica pode ser avaliada cuidadosamente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
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