Protocol
Alle eksperimenter med mus bør utføres i samsvar med retningslinjene i den respektive institusjonelle dyr omsorg og bruk komité.
1. Generelle kommentarer til Muse Experiments
- Hold mus henhold patogenfrie forhold og gjør dem tilgang til mat og vann ad libitum.
MERK: Det er viktig å bruke alders- og kjønns matchet mus i eksperimentelle grupper fordi immunologiske mønstre kan variere med alder og kjønn.
2. Fremstilling og aktivering av OVA-spesifikke CD8 + T-celler (OT-I)
- Utføre stimulering av OT-I T-celler som beskrevet under 5 dager før forbereder hjernen skiver.
MERK: 5 x 10 5 aktivert effektor CD8 + OT-I T-celler (CD8 + T-celler av transgene mus som anerkjenner bare OVA 257-264 peptid i sammenheng med MHC-I-molekyler) er nødvendig per skive De konsentrasjon 5 x 10 5 ble valgt eksperimentally som optimal en til fordel for en god celle-celle-interaksjon med en gang at cellene begynner å migrere inn i stykket, og, på samme tid, er mengden av celler som ikke er for høy til å fremkalle en overreaksjon som tillater enkel celle telling 8,18. - Forberede medium for dyrking OT-I T-celler. Supplement 500 ml DMEM med 5% føtalt kalveserum (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 50 uM 2-merkaptoetanol, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 25 ug / ml gentamicin. Oppbevar medium ved 4 ° C inntil bruk.
- Fjerne milten av OT-I transgene mus som per referanse 16. Overføre dem i den klargjorte medium.
- Generere enkeltcellesuspensjon ved å mose milten gjennom et 70 um sil og suspensjonen sentrifuge ved 300 x g i 5 min, 4 ° C.
- Inkuber cellesuspensjon med 5 ml ammonium-klorid-kalium (ACK) buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) i 5 minutter for å lysere røde blodceller.
- Stopp incubatipå med 10 ml medium og sentrifuger på nytt som beskrevet ovenfor.
- Fortynne cellesuspensjon i medium og beregne tall. Plate-celler ved en tetthet på 3 x 10 7 celler / brønn i en 12-brønns plate og prim dem ved inkubering med OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) og interleukin 2 (IL-2) (500 IU / ml) i 5 dager.
- Etter 4 dager, tilsett IL-2 i en konsentrasjon på 500 IU / ml nytt.
- I etterkant av stimulering, rense OT-I T-celler fra cellesuspensjonen ved hjelp av en negativ seleksjon basert mus CD8 + T-celle isolasjon kit etter produsentens anvisninger. Rensing er basert på nedbrytning av alle ikke-CD8 + -celler ved hjelp av en cocktail av antistoffer mot CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC klasse II, Ter-119, og TCRγ / δ som deretter kastes ved hjelp av magnetiske kolonner for eluering av det rensede CD8 + T-celler.
MERK: Kritiske trinn i denne procedure er indikert med den produserer: er det viktig at reaksjonen bare omfatter enkeltceller på grunn av tilstedeværelsen av klumper kan blokkere kolonne under eluering trinn; telling av cellen før du legger den Byotin cocktail er viktig for graden av renhet av prøven og prosedyren skal utføres på is for å minimere uspesifikke antistoff bindinger.
3. Utarbeidelse av akutt hjerneskiver og Co-kultur med OT-I T-celler
- Før fremstillingen av akutte hjerneskiver 19, forberede placedine iskald fysiologisk saltløsning ved anvendelse av 200 mM sukrose, 20 mM PIPES, 2,5 mM KCL, 1,25 mM NaH 2PO 4, 10 mM MgSO4, 0,5 CaCI2 og 10 mM dekstrose og kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) ved å bruke 125 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2PO 4, 24 mM NaHCO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM dekstrose. Juster pH i hver løsning til 7,35 ved using NaOH. Før justering av pH til ACSF, må oppløsning bli boblet med en blanding av 95% O2 og 5% CO2.
- Pre-kjøle løsninger.
- Bedøve til 8 - 10 uker gamle mus (f.eks C57Bl / 6 som kontroll eller transgen ODC-OVA-mus 17 med inhalasjon ved hjelp av 5,0% isofluran, 5,0% halotan eller injisere 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg kroppsvekt xylazin via ip Vent for anestesi og bruke en tå klype for å vurdere nivået av anestesi og halshogge dem med en gang. Avlive musene som per institusjons dyr omsorg og bruke komité kriteriene for aktiv dødshjelp.
- Sette musen i ventral posisjon. Desinfisere og kutte skalp sagittally. Åpne kraniebein sagitally, fjerne hjernen raskt med hjelp av et scoop og fikse det på plate av en vibratome ved bruk av lim.
- Fyll tallerkenen med forberedt placedine iskald fysiologisk saltvann.
- Skjær 300 mikrometer koronale skiver med vibratome.
MERK: Denne prosedyren er kjentn for å gi levedyktige intakte vevsprøver egnede funksjonelle cellulære studier innenfor et tidsintervall på minst 8 timer 19-21. Faktisk, etter denne tidsperioden, allerede begynner etter 6 timer, viser fremstillingen redusert kvalitet, nemlig endringer i grunnleggende og funksjonelle egenskaper som aksjonspotensial generering og utbredelse. - Etter snitting, overføre en skive umiddelbart inn i hver brønn av en 12-brønns plate som er fylt med ACSF.
- Legg nøye 5 x 10 5 OT-I T-celler per skive.
- Inkuber skiver i opp til 8 timer i en inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Etter inkubasjonsperioden, slakte stykker og legge dem ved hjelp av oktober forbindelse vev-tek og fryse dem i flytende nitrogen. Lagre dem ved -20 ° C i ytterligere histologiske undersøkelser til f.eks evaluere neuronal struktur (for eksempel ved anvendelse av anti-MAPII eller anti-synaptophysin antistoffer) eller apoptose (f.eks, ved hjelp av anti-kaspase-3-antistoffer og anti-Neun antiorganer) i henhold til standardprosedyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter inkubering av hjernesnitt med oligodendrocytt-rettet CD8 + T-celler, oligodendrocytter samt neuroner gjennomgår apoptose (figurene 2A og 1C, henholdsvis). Histologiske tegn på apoptose (f.eks caspase-3, Tunel) kan tidligst påvises etter 3 timers inkubasjon. Inkubasjonstiden bør ikke være lenger enn 8 timer for å garantere en god kvalitet av kjemikaliet og reproduserbare resultater. Apoptotiske celler kan finnes over hele stykket med overvekt i myelinerte områder. Eksemplarisk histologisk farging av skiven for strukturell integritet og apoptotiske neuroner er vist i figur 1A-C.
Det finnes forskjellige tidspunkter i løpet av inkubasjon som er av interesse for å vurdere effektparametere. En typisk tidsforløp utført i vårt laboratorium omfatter parametre analyser, nemlig celle-celle-interaksjoner ved tid 0 og deretter 3, 4 og 6 timer (den maksimale observerte interaksjon) ettersamhandling i gang. Noen typiske analyser utover histologiske analyser som ofte brukes er beskrevet veldig kort:
T-celle-utvinning og analyse
Etter en inkubasjonstid på opptil 8 timer, kan T-celler utvinnes fra skiver og kan evalueres for å analysere parametere i forhold til de intracellulære effektor molekyler, slik som cytokinproduksjon og proliferasjon. For å hente T-celler, ble skiver dissosiert mekanisk og samlet sammen for hver eksperimentell tilstand. Celler ble isolert fra grensesnittet en 30% til 50% Percoll (Amersham, Freiburg, Tyskland) etter tetthetsgradient-sentrifugering i 30 minutter ved 2500 rpm. På denne måte er det mulig å oppnå mononukleære celler som ble vasket og farget umiddelbart ved hjelp av strømningscytometri-teknikker (FACS) under anvendelse av et annet antall og type av antistoffer som varierer avhengig av studien vi ønsker å ta opp, i denne protokoll, for eksempel CD8 + 18.
Informasjon om neuronal helse og funksjonalitet kan bli vurdert ved å utføre elektroopptaks f.eks, for å evaluere grunnleggende egenskaper av de neuroner som aksjonspotensial (AP) produksjon, som vist i figur 1D.
Figur 1. Morfologiske strukturen i snitt så vel som representative resultater. (A) Morfologisk strukturen av en skive 8 timer etter inkubering. Skala bar indikerer 10 mikrometer. (B) Nerveceller er postsynaptisk sammenkoblet som avslørt av co-farging for MAPII (grønn) og synaptophysin (rød) farging. Scale bar representerer 10 mikrometer. (C) Representant bilde av apoptotiske celler (caspase-3, rød) og nevroner (Neun, grønn) i hippocampus enfter 6 timers inkubasjon. Scale bar representerer 10 mikrometer. (D) Enkelt celle patch-clamp opptak av neuronal aksjonspotensial generasjon følgende depolariserende gjeldende trinnene i en murine kortikale nevroner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Flere stainings utført for å vurdere Fastsettelse av protokollen. (A) Co-farging av NogoA (rød), viser en markør for modne oligodendrocytter (ODCs) og Caspase3 (apoptose, grønn) som ODCs blir angrepet av CD8 + T-celler. (B) Samspill resultatet er negativt når Caspase3 (rød) er co-farget med GFAP, en markør for gliaceller (grønt). Scale bar representerer 10 mikrometer. (C) Specificity av protokollen støttes av co-farging av nerveceller (DAPI, blå) med Caspase3 (rød), fra venstre: WT dyr, WT dyr utsettes for OTI-I T-celler, ODC-Ova og ODC-Ova eksponert for OTI-I T-celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ulike dyremodeller har blitt beskrevet i løpet av de siste tiårene for å håndtere de patologiske trekk ved inflammatorisk demyeliniserende lidelser som MS. In vivo mus og rottemodeller er mye brukt for å etterligne patofysiologiske trekk ved sykdommen, nemlig analyse av konsekvensene av demyelinisering og remyelinisering prosesser og av blandet episoder av betennelse og neurodegeneration. Likevel, bare en ex vivo tilnærming gjør det mulig å dissekere de nøyaktige underliggende mekanismene.
Fremstilling av akutte hjerneskiver er også et vidt distribuert modell og kan anses som pålitelig og replikerbart. I kombinasjon med isolasjon og inkubering av oligodendrocytt-spesifikke immunceller, kan den brukes for å løse spesifikke eksperimentelle spørsmål, spesielt når det gjelder å studere mekanismen og kinetikken av en immuncelle angrep og celle - celleinteraksjoner. Andre ex vivo tilnærminger er kjent og allmentbrukt 22 men nyheten av vår protokoll i spesifisitet av målet som kan bli utfordret ved å utføre ulike "eksklusjons" co-stainings, nemlig å verifisere Caspase3 immunoreaktivitets i WT utsatt eller ikke utsatt for OT-I T-celler (se figur 2C) .
Noen kritiske punkter under tilberedning bør tas i betraktning, nemlig de eksperimentelle innstillinger, for å sikre at eksperimentene er utført metodisk korrekt; for intern gyldighet, isolering og stimulering av immunceller som benyttes bør kontrolleres regelmessig via f.eks flow cytometri analyse (FACS). Dessuten sjekker vitalitet av hjernen skiver sterkt anbefalt. Eksperimentelle grupper bør være alders- og kjønns matchet. Eksperimenter bør alltid utføres i samsvar med dyrevern forskrifter.
Noen begrensninger av protokollen må holdes i tankene. Viktigst er det presenteres modellenen ex vivo tilnærming og er ikke egnet til å fullt ut etterligne det komplekse immunologisk situasjon av autoimmune lidelser i sentralnervesystemet. Det bør også tas i betraktning at modellen bruker bare CD8 + T-celle drevet immunologisk respons. CD4 + T-celler og B-celler spiller en mindre fremtredende rolle. Alternative protokoller som bruker andre oligodendrocyte-spesifikke immuncelle subtyper bør vurderes når du adresserer disse celletypene. Den forventede histologiske funn er oligodendroglial (se figur 2A) og neuronal apoptose (se figur 1C). Alternativt kan apoptose av andre celletyper kan oppnås ved hjelp av f.eks, astroglial eller neuronal antigen-spesifikke immunceller og transgene systemer. I dette spesielle protokoll immunreaktiviteten til Caspase3 i astroglial celler var negativ på grunn av spesifisiteten av systemet (figur 2B).
Den beskrevne protokoll kan betraktes som et grunnleggende nevroimmunologisk eksperimentell tilnærming og kan endres for andre programmer. Den eksperimentelle prosedyren enkelt kan brukes til andre protokoller ved varierende hjerneskiver (f.eks ulike transgene mus stammer) i kombinasjon med forskjellige antigen-spesifikke immuncelle undergrupper (f.eks bruke myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) - spesifikke CD4 + T-celler og hjerneskiver preparert fra C57Bl / 6 mus for å løse deres effekter på oligodendroglial og nerveapoptose). In vitro aktivering av immunceller kan varieres for spesifikke immunologiske spørsmål (f.eks polarisering i T H 1 eller T H 17 celler).
Noen ganger kan utvidet eller redusert apoptose i hjernen skiver være en eksperimentell utfordring. Noen anbefalinger for feilsøking er:
Ved første, er kvaliteten på hjernen skiver svært avhengig av forberedelse tid samt pH-verdi, osmolaritet og oksidasjonsstatus for ossed løsning. Det bør sikres at forholdene er sammenlignbare mellom de uavhengige eksperimenter. Videre bør aktivering av immunceller kontrolleres med jevne mellomrom. Optimal antigen-konsentrasjon kan variere. Vurdere en titrering av brukte antigen ved etablering av forsøkene.
Som beskrevet ovenfor, kan den nevnte protokoll brukes som utgangspunkt for analysering av effekten av ytterligere immunceller subtyper (f.eks CD4 + T-celler, B-celler) på sentralnervesystemet integritet. Disse metodene er spesielt godt egnet til å skille sine effekter på oligodendroglial og nevronale celler som histologisk analyse kan vurderes grundig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
- Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
- Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
- Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
- Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
- Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
- Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
- Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
- Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
- Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
- Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
- Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
- Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121 (2013).
- Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
- McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
- Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
- Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41 (2012).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
- Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
- Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).
