Protocol
Alle forsøg med mus bør udføres i overensstemmelse med retningslinjerne i den respektive institutionelle pasning af dyr og brug udvalg.
1. Generelle kommentarer Mouse Eksperimenter
- Hold musene under patogenfrie forhold og give dem adgang til foder og vand ad libitum.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge alders- og sex-matchede mus i eksperimentelle grupper, fordi immunologiske mønstre kan variere med alder og køn.
2. Fremstilling og aktivering af OVA-specifikke CD8 + T-celler (OT-I)
- Udfør stimulering af OT-I T-celler som beskrevet nedenfor 5 dage før forberede hjernen skiver.
BEMÆRK: 5 x 10 5 aktiveret effektor CD8 + OT-I T-celler (CD8 + T-celler fra transgene mus genkender kun OVA 257-264 peptid i forbindelse med MHC-I-molekyler) er nødvendige pr skive koncentration 5 x 10 5 blev valgt eksperimentallierede som optimal til at begunstige en god celle-celle interaktion én gang at cellerne begynder at migrere ind i udsnittet, og på samme tid, er mængden af celler, der ikke er for høj til at inducere en overreaktion tillader enkelt celle tælle 8,18. - Forbered medium til dyrkning af OT-I T-celler. Supplement 500 ml DMEM med 5% føtalt kalveserum (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 50 um 2-mercaptoethanol, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 25 ug / ml gentamicin. Opbevar ved 4 ° C indtil anvendelse.
- Fjern milten af OT-I transgene mus pr henvisning 16. Overføre dem i den klargjorte medium.
- Generere enkelt cellesuspension ved mæskning milte gennem et 70 um si og centrifugeres suspensionen ved 300 xg i 5 min, 4 ° C.
- Inkuber cellesuspension med 5 ml ammonium-chlorid-kalium (ACK) puffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) i 5 min for at lysere røde blodlegemer.
- Stop incubatipå med 10 ml medium og centrifugeres igen som beskrevet ovenfor.
- Fortyndes cellesuspension i medium og beregne tal. Plate celler ved en densitet på 3 x 10 7 celler / brønd i en 12-brønds plade og prime dem ved inkubering med OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) og interleukin 2 (IL-2) (500 IU / ml) i 5 dage.
- Efter 4 dage tilsættes IL-2 i en koncentration på 500 IU / mL igen.
- Efter stimulering, rense OT-I T-celler fra cellesuspensionen ved hjælp af en negativ selektion baseret muse CD8 + T-celle-isolation kit ifølge producentens anvisninger. Oprensning er baseret på nedbrydningen af alle ikke-CD8 + -celler ved anvendelse af en cocktail af antistoffer mod CD4, CD11, CD11 c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC klasse II, Ter-119 og TCRγ / δ som derefter kasseres ved anvendelse af magnetiske kolonner for eluering af oprensede CD8 + -T-celler.
BEMÆRK: Kritiske trin i denne Procedure er angivet af producenterne: Det er vigtigt, at reaktionen kun omfatter enkelte celler fordi tilstedeværelsen af klumper kunne blokere søjlen under elueringstrinnet; tælle af cellen, før du tilføjer den Byotin cocktail er vigtig for renhedsgraden af prøven og proceduren skal udføres på is for at minimere uspecifikke antistof bindinger.
3. Fremstilling af akut Brain Skiver og Co-kultur med OT-I T-celler
- Forud for fremstillingen af akut hjerneskiver 19 forberede placedine iskold fysiologisk saltopløsning under anvendelse af 200 mM sucrose, 20 mM PIPES, 2,5 mM KCI, 1,25 mM NaH 2 PO4, 10 mM MgSO4, 0,5 CaCl2 og 10 mM dextrose og kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) ved anvendelse af 125 mM NaCl, 2,5 KCI, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 mM NaHCO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM dextrose. Justér pH for hver løsning på 7,35 ved using NaOH. Inden indstilling af pH af ACSF, skal opløsning gennemboblet med en blanding af 95% O2 og 5% CO2.
- Pre-køle løsninger.
- Bedøver 8-10 uger gamle mus (f.eks C57BL / 6 som kontrol eller transgene ODC-OVA-mus 17 med inhalation under anvendelse af 5,0% isofluran, 5,0% halothan eller injicere 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg legemsvægt xylazin via IP Vent til anæstesi og bruge en tå knivspids at vurdere niveauet af anæstesi og halshugge dem på én gang. aflive mus som pr institutionel Dyrepleje og anvende kriterier udvalgsmøder for eutanasi.
- Sæt musen i ventral stilling. Desinficer og skære hovedbund sagittalt. Åbn kranieknogler sagitalt Fjern hjernen hurtigt ved hjælp af en skovl og løse det på pladen af en vibratome ved brug af lim.
- Fyld pladen med den forberedte placedine iskold fysiologisk saltopløsning.
- Skær 300 um koronale skiver med vibratome.
BEMÆRK: Denne procedure er viden at give levedygtige intakte vævsprøver passende for funktionelle cellulære studier inden for et tidsinterval på mindst 8 timer 19-21. Faktisk efter denne periode, allerede begynder efter 6 timer, forberedelse viser reduceret kvalitet, nemlig ændringer i de grundlæggende og funktionelle egenskaber som aktionspotentialet generation og formering. - Efter skæring, overføre en skive umiddelbart i hver brønd af en 12-brønds plade fyldt med ACSF.
- Derefter tilsættes forsigtigt 5 x 10 5 OT-I T-celler per skive.
- Inkuberes skiver i op til 8 timer i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Efter inkubationsperioden høst skiver og integrere dem med OCT-forbindelse tissue-tek og fryse dem i flydende nitrogen. Opbevar dem ved -20 ° C til yderligere histologiske undersøgelser for f.eks evaluere neuronal struktur (f.eks, ved hjælp af anti-MAPII eller anti-synaptophysin antistoffer) eller apoptose (f.eks anvendelse af anti-caspase-3-antistoffer og anti-NeuN antiorganer) ifølge standardprocedurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter inkubation af hjerneskiver med oligodendrocyt-directed CD8 + T-celler, oligodendrocytter samt neuroner undergå apoptose (figur 2A og 1C, henholdsvis). Histologiske tegn på apoptose (f.eks Caspase-3, Tunel) kan tidligst påvises efter 3 timers inkubation. Inkubationstid, ikke være længere end 8 timer for at sikre en god kvalitet af præparatet og reproducerbare resultater. Apoptotiske celler kan findes over hele skive med overvægt i myelinerede områder. Eksempler histologisk farvning af skive for strukturel integritet og apoptotiske neuroner er afbildet i figur 1A-C.
Der er forskellige tidspunkter under inkubation, som er af interesse for at vurdere resultatet parametre. En typisk tidsforløb udført i vores laboratorium indbefatter parametre analyser, nemlig celle-celle-interaktioner på tidspunktet 0, derefter 3, 4 og 6 timer (den maksimale interaktion observeret) efterinteraktion startet. Nogle typiske analyser ud over histologiske analyser, der ofte kan anvendes, er beskrevet meget kort:
T-celle-genvinding og analyse
Efter en inkubationstid på op til 8 timer, kan T-celler genvindes fra skiver og kan evalueres for at analysere parametre i forhold til de intracellulære effektormolekyler såsom cytokindannelse eller proliferation. For at hente T-celler, blev skiver dissocieret mekanisk og samles sammen for hver eksperimentel betingelse. Celler blev isoleret fra grænsefladen 30% til 50% Percoll (Amersham, Freiburg, Tyskland) efter densitetsgradientcentrifugering i 30 minutter ved 2.500 rpm. På denne måde er det muligt at opnå mononukleare celler, som blev vasket og farvet straks med flowcytometri teknikker (FACS) under anvendelse af et forskelligt antal og type af antistoffer, som varierer afhængigt af undersøgelsen vi ønsker at løse, i denne protokol, for eksempel CD8 + 18.
Information om neuronal sundhed og funktionalitet kan vurderes ved at udføre elektrofysiologiske optagelse fx at evaluere grundlæggende egenskaber af neuroner såsom virkningspotentialer (APS) generation, som vist i figur 1D.
Figur 1. morfologiske struktur skive samt repræsentative resultater. (A) morfologiske struktur af et udsnit 8 timer efter inkubation. Scale bar angiver 10 pm. (B) neuroner synaptisk forbundet som afsløret ved co-farvning for MAPII (grøn) og synaptophysin (rød) farvning. Scale bar udgør 10 um. (C) Repræsentant billede af apoptotiske celler (Caspase-3, red) og neuroner (Neun, grøn) i hippocampus after 6 timers inkubation. Scale bar udgør 10 um. (D) Enkelt celle patch-clamp optagelser af neuronal aktionspotentiale generation efter depolariserende nuværende trin i en murine kortikal neuron. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Flere farvninger for at vurdere specificitet af protokollen. (A) Co-farvning af NogoA (rød), en markør for modne oligodendrocytter (ODCs) og Caspase3 (apoptose, grøn) viser, at ODCs angribes af CD8 + T-celler. (B) Interaktion resultatet er negativt, når Caspase3 (rød) er co-farvet med GFAP, en markør for gliaceller (grøn). Scale bar udgør 10 um. (C) Specificity af protokollen understøttes af co-farvning af nerveceller (DAPI, blå) med Caspase3 (rød), startende fra venstre: WT dyr, WT dyr udsat for OTI-I T-celler, ODC-Ova og ODC-Ova udsat for OTI-I T-celler. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskellige dyremodeller er blevet beskrevet i de seneste årtier for at løse de patologiske træk ved inflammatoriske demyeliniseringssygdomme som MS. In vivo mus og rotte-modeller er almindeligt anvendt til at efterligne patofysiologiske funktioner i sygdommen, nemlig analyse af konsekvenserne af demyeliniserende og remyelinering processer og blandet episoder af inflammation og neurodegeneration. Alligevel kun en ex vivo fremgangsmåde gør det muligt at dissekere de nøjagtige underliggende mekanismer.
Fremstilling af akutte hjerneskiver er også en udbredt model og kan betragtes som pålidelige og replikerbar. I kombination med isolation og inkubation af oligodendrocyt-specifikke immunceller, kan det bruges til at løse specifikke eksperimentelle spørgsmål, især med hensyn til at studere mekanisme og kinetik for en immun celle angreb og celle - celle interaktioner. Andre ex vivo metoder er kendte og almindeligtbrugte 22 men det nye ved vores protokol i specificiteten af målet, der kan anfægtes ved at udføre forskellige "udelukkelse" Co-farvninger, nemlig at kontrollere Caspase3 immunreaktiviteten i WT udsat eller ikke udsat for OT-I T-celler (se figur 2C) .
Nogle kritiske punkter under udarbejdelsen bør tages i betragtning, nemlig de eksperimentelle indstillinger, for at sikre, at forsøg udføres metodisk korrekt; for intern validitet, isolation og stimulering af de anvendte immunceller bør kontrolleres regelmæssigt via f.eks flowcytometri analyser (FACS). Desuden kontrollerer vitalitet hjerneskiver stærkt anbefales. Eksperimentelle grupper skal være alders- og køn-matchede. Eksperimenter skal altid udføres i overensstemmelse med dyrevelfærd regler.
Nogle begrænsninger protokollen skal holdes for øje. Vigtigst er det, præsenterede modelen ex vivo fremgangsmåde og egner sig ikke til fuldt efterligne komplekse immunologiske situation af autoimmune sygdomme i centralnervesystemet. Det bør også overvejes, at modellen kun bruger CD8 + T-celle drevet immunologisk respons. CD4 + T-celler og B-celler spiller en mindre fremtrædende rolle. Alternative protokoller bruger andre oligodendrocyt-specifikke immun celle undertyper bør overvejes, når man behandler disse celletyper. Den forventede histologiske fund er oligodendrogliale (se figur 2A) og neuronal apoptose (se figur 1C). Alternativt kan apoptose af andre celletyper opnås ved anvendelse af f.eks astroglial eller neuronale antigenspecifikke immunceller og transgene systemer. I dette specifikke protokol immunoreaktiviteten af Caspase3 i astrogliale celler var negativ på grund af specificiteten af systemet (figur 2B).
Den beskrevne protokol kan betragtes som en grundlæggende neuroimmunologisk eksperimenterende tilgang og kan ændres til andre formål. Den eksperimentelle procedure kan let anvendes til andre protokoller ved varierende hjerneskiver (fx forskellige transgene mus stammer) i kombination med forskellige antigenspecifikke immunrespons celle undertyper (f.eks bruge myelin oligodendrocyt glycoprotein (MOG) - CD4 + T-celler og hjerneskiver fremstillet ud fra C57BL / 6 mus til at løse deres virkninger på oligodendrogliale og neuronal apoptose). In vitro aktivering af immunceller kan varieres til specifikke immunologiske spørgsmål (fx polarisering i T H 1 eller T H 17 celler).
Nogle gange kan forøget eller reduceret apoptose i hjerneskiver være en eksperimentel udfordring. Nogle anbefalinger til fejlfinding er:
Ved første, kvalitet hjerneskiver er meget afhængig af forberedelsestid samt pH-værdi, osmolaritet og oxidation status af osed opløsning. Det bør sikres, at vilkårene er sammenlignelige mellem de uafhængige forsøg. Endvidere bør aktivering af immunceller styres på en regelmæssig basis. Optimal antigenkoncentration kan variere. Overvej en titrering af brugte antigen ved udarbejdelse af de eksperimenter.
Som beskrevet ovenfor kan nævnte protokol anvendes som udgangspunkt for analyse af virkning af yderligere immuncelle undertyper (f.eks CD4 + T-celler, B-celler) på centralnervesystemet integritet. Disse metoder er specielt egnet til at adskille deres virkninger på oligodendrogliale og neuronale celler, som kan vurderes grundigt histologisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
- Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
- Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
- Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
- Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
- Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
- Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
- Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
- Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
- Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
- Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
- Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
- Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121 (2013).
- Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
- McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
- Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
- Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41 (2012).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
- Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
- Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).
