Protocol
Alle experimenten met muizen moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de respectieve institutionele dier zorg en gebruik commissie.
1. Algemene opmerkingen voor Muis Experimenten
- Houd de muizen onder-pathogeen-vrije omstandigheden en hen in staat de toegang tot voedsel en water ad libitum.
OPMERKING: Het is belangrijk om voor leeftijd en geslacht gematchte muizen in de experimentele groepen gebruiken omdat immunologische patronen kunnen variëren met leeftijd en geslacht.
2. Bereiding en activering van OVA-specifieke CD8 + T-cellen (OT-I)
- Voer stimulering van OT-I T-cellen zoals hierna 5 dagen eerder beschreven bereiding hersencoupes.
OPMERKING: 5 x 10 5 geactiveerde effector CD8 + OT-I-T-cellen (CD8 + T-cellen van transgene muizen herkennen alleen OVA 257-264 peptide in de context van MHC-I-moleculen) nodig per segment De concentratie 5 x 10 5 gekozen experimentally een optimale men een goede cel-cel interacties bevorderen nadat de cellen beginnen te migreren in het segment en, tegelijkertijd, de hoeveelheid cellen niet te hoog om een overreactie waardoor cel tellen 8,18 induceren. - Bereid het medium voor kweken OT-I T-cellen. Supplement 500 ml DMEM met 5% foetaal kalfsserum (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 50 pM 2-mercaptoethanol, 1% niet-essentiële aminozuren en 25 ug / ml gentamicine. Bewaar het bij 4 ° C tot gebruik.
- Verwijder de milt van OT-I transgene muizen als per referentie 16. Zet ze in de voorbereide medium.
- Genereer enkele celsuspensie door stampen milten door een 70 urn zeef en centrifugeer suspensie bij 300 xg gedurende 5 min, 4 ° C.
- Incubeer celsuspensie met 5 ml ammonium- chloride-kalium (ACK) buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) gedurende 5 minuten om rode bloedcellen te lyseren.
- Stoppen incubatiop 10 ml medium en centrifugeer opnieuw zoals hierboven beschreven.
- Verdunde celsuspensie in middelgrote en bereken nummers. Plate cellen bij een dichtheid van 3 x 10 7 cellen / putje in een 12-well plaat en prime ze door incubatie met OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) en interleukine 2 (IL-2) (500 IE / ml) 5 dagen.
- Na 4 dagen, voeg IL-2 in een concentratie van 500 IE weer / ml.
- Na stimulatie, zuiveren OT-I T-cellen uit celsuspensie door een negatieve selectie gebaseerd muis CD8 + T-cell isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant. Zuivering is gebaseerd op de uitputting van alle niet-CD8 + cellen met een cocktail van antistoffen tegen CD4, CD 11 b, CD 11 c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC klasse II, Ter-119 en TCRγ / δ die vervolgens verwijderd met behulp van magnetische kolommen voor de elutie van het gezuiverde CD8 + T-cellen.
OPMERKING: Kritische stappen in deze proceduopnieuw worden aangegeven door de fabrikanten: het is belangrijk dat de reactie omvat slechts enkele cellen vanwege de aanwezigheid van klonten de kolom tijdens de elutiestap kunnen blokkeren; het tellen van de cellen voor het toevoegen van de Byotin cocktail is belangrijk voor de mate van zuiverheid van het monster en de procedure moet worden uitgevoerd op ijs onspecifieke bindingen antilichaam minimaliseren.
3. Voorbereiding van de Acute Brain Slices en co-cultuur met OT-I T-cellen
- Voor de bereiding van acute hersenschijfjes 19 bereiden placedine ijskoude fysiologische zoutoplossing met 200 mM sucrose, 20 mM PIPES, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH 2PO 4, 10 mM MgSO4, 0,5 CaCl2 en 10 mM dextrose en kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met 125 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2PO 4, 24 mM NaHCO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM dextrose. Stel de pH van elke oplossing om 7.35 door using NaOH. Voor het instellen van de pH van ACSF dient oplossing borrelen met een mengsel van 95% O2 en 5% CO2.
- Pre-koelen oplossingen.
- Verdoven 8-10 weken oude muizen (bijvoorbeeld C57BL / 6 als controle of transgene ODC-OVA muizen 17 met inhalatie met 5,0% isofluraan, 5,0% halothaan of Injecteer 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht xylazine via ip Wait anesthesie en gebruik een teen knijpen om het niveau van anesthesie beoordelen en onthoofden ze tegelijk. Euthanaseren de muizen per institutionele Animal Care en gebruik commissie criteria voor euthanasie.
- Zet de muis in het ventrale positie. Desinfecteren en sagittally snijden hoofdhuid. Open het schedelbot saggitaal, snel te verwijderen van de hersenen met behulp van een schep en plaats deze op het bord van een vibratome door het gebruik van lijm.
- Vul het bord met de voorbereide placedine ijskoude fysiologische zoutoplossing.
- Snijd 300 micrometer coronale plakjes met de vibratome.
OPMERKING: Deze procedure is wetenn om levensvatbare intact weefsel exemplaren die geschikt is voor functionele cellulaire studies binnen een tijdsinterval van ten minste 8 uur 19-21 opleveren. Immers, na deze periode, al beginnen na 6 uur, het preparaat blijkt verminderde kwaliteit, namelijk de ontwikkeling van het basis- en functionele eigenschappen zoals actiepotentiaal generatie en voortplanting. - Na het snijden, overdragen één schijfje meteen in elk putje van een 12-wells plaat gevuld met ACSF.
- Voeg zorgvuldig 5 x 10 5 OT-I T-cellen per schijfje.
- Incubeer plakjes tot 8 uur in een incubator (37 ° C, 5% CO2).
- Na de incubatieperiode, oogst plakjes en insluiten ze met behulp van oktober samengestelde weefsel-tek en vries ze in vloeibare stikstof. Bewaar ze bij -20 ° C voor verdere histologische studies om bijvoorbeeld evalueren neuronale structuur (bijvoorbeeld met behulp van anti-MAPII of anti-synaptophysine antilichamen) of apoptose (bijvoorbeeld met anti-caspase-3-antilichamen en anti-anti NeuNorganen) volgens standaard procedures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na incubatie van hersencoupes met oligodendrocyten gerichte CD8 + T-cellen, oligodendrocyten en neuronen ondergaan apoptose (figuur 2A en 1C respectievelijk). Histologische tekenen van apoptose (bijvoorbeeld caspase-3, Tunel) worden vroegst waargenomen na 3 uur incubatie. Incubatietijd mag niet langer dan 8 uur zijn om een goede kwaliteit van het preparaat en reproduceerbare resultaten te garanderen. Apoptotische cellen kan worden gevonden over de slice met overwicht in gemyeliniseerde gebieden. Voorbeelden histologische kleuring van het deel voor de structurele integriteit en apoptotische neuronen is in Figuur 1A-C.
Er zijn verschillende tijdstippen tijdens de incubatie die van belang zijn voor het beoordelen uitkomstparameters. Een typisch tijdsverloop uitgevoerd in ons laboratorium parameters omvat analyses, namelijk cel-cel interacties op tijdstip 0, 3, 4 en 6 uur (de maximale interactie waargenomen) nainteractie begonnen. Enkele typische assays voorbij histologische analyses die vaak kan worden toegepast, zijn zeer kort beschreven:
T-cel herstel en analyse
Na een incubatie periode tot 8 uur, kunnen T-cellen worden gewonnen uit segmenten en te evalueren parameters ten opzichte van het intracellulaire effector moleculen zoals cytokineproductie of proliferatie analyseren. Om T-cellen te halen, werden segmenten mechanisch gedissocieerd en samengevoegd voor elke experimentele conditie. De cellen werden geïsoleerd uit het grensvlak 30% tot 50% Percoll (Amersham, Freiburg, Duitsland) na dichtheidsgradiënt centrifugatie gedurende 30 minuten bij 2500 rpm. Op deze wijze is het mogelijk om mononucleaire cellen die werden gewassen en onmiddellijk gekleurd met flowcytometrie technieken (FACS) met een verschillend aantal en soort antilichamen die variëren afhankelijk van de studie we willen beantwoorden in dit protocol verkrijgen, bijvoorbeeld CD8 + 18.
Informatie over neuronale gezondheid en functionaliteit kan worden bepaald door het uitvoeren van elektrofysiologische registratie bijvoorbeeld de fundamentele eigenschappen van de neuronen zoals actiepotentialen (AP's) generatie evalueren, zie figuur 1D.
Figuur 1. Morfologische structuur van plak en representatieve resultaten. (A) morfologische structuur van een schijfje 8 uur na incubatie. Schaal balk geeft 10 micrometer. (B) Neuronen synaptisch verbonden zoals blijkt uit co-kleuring voor MAPII (groen) en synaptofysine (rood) kleuring. Schaal balk vertegenwoordigt 10 micrometer. (C) representatief beeld van apoptotische cellen (caspase-3, rood) en neuronen (NeuN, groen) in de hippocampus eenN a 6 uur incubatie. Schaal balk vertegenwoordigt 10 micrometer. (D) Single cell patch-clamp opnames van neuronale actiepotentiaal generatie volgende depolariserende huidige stappen in een muizen corticale neuron. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Meerdere kleuringen uitgevoerd om specificiteit van het protocol te evalueren. (A) Co-kleuring van NogoA (rood), een marker voor rijpe oligodendrocyten (ODC) en Caspase3 (apoptose, groen) blijkt dat ODC worden aangevallen door CD8 + T-cellen. (B) Interactie resultaat is negatief als Caspase3 (rood) is mede-gekleurd met GFAP, een marker voor gliacellen (groen). Schaalbalk vertegenwoordigen 10 micrometer. (C) specificity van het protocol wordt ondersteund door de co-kleuring van neuronale cellen (DAPI, blauw) met Caspase3 (rood), beginnend van links: WT dieren, WT dieren blootgesteld aan OTI-I T-cellen, ODC-Ova en ODC-Ova blootgesteld aan OTI-I T-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende dierlijke modellen zijn beschreven in de afgelopen decennia de pathologische kenmerken van inflammatoire demyeliniserende ziekten als MS pakken. In vivo muis en ratmodellen worden wijd gebruikt om pathofysiologie van de ziekte na te bootsen, namelijk analyse van de gevolgen van demyelinisatie en remyelinisatie processen en vermengde afleveringen van ontstekingen en neurodegeneratie. Toch alleen een ex vivo benadering maakt het mogelijk om de exacte onderliggende mechanismen te ontleden.
Bereiding van acute hersenschijfjes is ook wijd verspreid model en kan worden beschouwd als betrouwbaar en herhaalbaar. In combinatie met de isolatie en incubatie van oligodendrocyt-specifieke immune cellen kan worden gebruikt om specifieke experimentele vragen te beantwoorden, met name wat betreft het bestuderen mechanisme en de kinetiek van een immuuncel aanval en cel - cel interacties. Andere ex vivo technieken zijn bekend en alomgebruikt 22 maar de nieuwheid van ons protocol in de specificiteit van de doelgroep die kunnen worden aangevochten door het uitvoeren van verschillende "uitsluiting" co-kleuringen, namelijk het controleren van de Caspase3 immunoreactiviteit in WT blootgesteld of niet blootgesteld aan OT-I T-cellen (zie figuur 2C) .
Enkele kritische punten tijdens de bereiding dient rekening, namelijk de experimentele instellingen worden gezorgd dat experimenten uitgevoerd methodologisch correct; interne validiteit, isolatie en stimulatie van de gebruikte immuuncellen worden gecontroleerd regelmatig via bijvoorbeeld stromingscytometrie analyse (FACS). Bovendien is het controleren van de vitaliteit van de hersenen plakjes zeer aan te bevelen. Experimentele groepen moeten voor leeftijd en geslacht gematchte zijn. Experimenten moeten altijd worden uitgevoerd in overeenstemming met het dierenwelzijn regelgeving.
Een aantal beperkingen van het protocol moet in gedachten worden gehouden. Belangrijker, de gepresenteerde modeleen ex vivo benadering en is niet geschikt voor de complexe immunologische toestand van auto centrale zenuwstelsel volledig nabootsen. Ook moet worden overwogen dat het model gebruikt alleen CD8 + T-cel aangedreven immuunrespons. CD4 + T-cellen en B-cellen spelen een minder prominente rol. Alternatieve protocollen gebruik van andere oligodendrocyte-specifieke immuun cel subtypes moeten worden overwogen bij het aanpakken van deze celtypen. De verwachte histologische bevinding is oligodendrogliale (zie figuur 2A) en neuronale apoptose (zie figuur 1C). Alternatief kan apoptose van andere celtypes worden bereikt met bijvoorbeeld astroglial of neuronale antigeen-specifieke immune cellen en transgene systemen. In dit specifieke protocol was de immunoreactiviteit van Caspase3 in astrogliale cellen negatief als gevolg van de specificiteit van het systeem (Figuur 2B).
De beschreven protocol kan worden beschouwd als een basis neuroimmunologische experimentele benadering en kan worden aangepast voor andere toepassingen. CD4 + T-cellen en - de experimentele procedure kan gemakkelijk in combinatie met andere antigeen-specifieke immuuncel subtypen (bv gebruiken myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) worden toegepast op andere protocollen variëren hersencoupes (bijvoorbeeld verschillende transgene muizenstammen) hersenplakjes bereid uit C57BL / 6 muizen op hun effecten op neuronale en oligodendrogliale apoptose adres). In vitro activatie van immuuncellen kunnen worden gevarieerd voor specifieke immunologische vragen (bijvoorbeeld polarisatie in T H 1 of TH 17 cellen).
Soms, zou versterkt of verminderd apoptose in plakjes hersenen een experimentele uitdaging. Een aantal aanbevelingen voor het oplossen van problemen zijn:
Aanvankelijk kwaliteit hersenschijfjes sterk afhankelijk voorbereidingstijd en pH, osmolariteit en oxidatietoestand onsed oplossing. Er moet voor worden gezorgd dat de omstandigheden vergelijkbaar zijn tussen de onafhankelijke experimenten. Bovendien moet activatie van immuuncellen worden gecontroleerd regelmatig. Optimale antigen concentratie kan variëren. Overweeg een titratie van het gebruikte antigeen bij het vaststellen van de experimenten.
Zoals hierboven beschreven, kan het genoemde protocol worden gebruikt als uitgangspunt voor het analyseren van het effect van andere immuuncellen subtypen (bijvoorbeeld CD4 + T-cellen, B-cellen) van het zenuwstelsel integriteit. Deze benaderingen zijn bijzonder geschikt voor het scheiden van hun effecten op neuronale en oligodendrogliale cellen als histologische analyse kan grondig worden geëvalueerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
- Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
- Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
- Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
- Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
- Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
- Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
- Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
- Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
- Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
- Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
- Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
- Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121 (2013).
- Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
- McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
- Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
- Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41 (2012).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
- Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
- Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).
