Protocol
Alla experiment med möss bör utföras i enlighet med riktlinjerna i respektive institutionella djurvård och användning kommitté.
1. Allmänna kommentarer för Mus Experiment
- Behåll de möss under patogenfria betingelser och ge dem tillgång till mat och vatten ad libitum.
OBS: Det är viktigt att använda ålders- och könsmatchade möss i experimentella grupper eftersom immunologiska mönster kan variera med ålder och kön.
2. Framställning och aktivering av OVA-specifika CD8 + T-celler (OT-I)
- Utför stimulering av OT-I T-celler som beskrivs nedan 5 dagar innan du förbereder hjärnan skivor.
OBS: 5 x 10 5 aktiverade effektor CD8 + OT-I T-celler (CD8 + T-celler av transgena möss som igenkänner endast OVA 257-264-peptiden i samband med MHC-I-molekyler) behövs per skiva De koncentration 5 x 10 5 valdes experimentally så optimal ett att gynna en god cell-cell-interaktion gång att cellerna börjar att migrera in i skiva och, på samma gång, är den mängd celler inte är för hög för att inducera en överreaktion tillåter enkelcellräkning 8,18. - Förbered medium för odling av OT-I T-celler. Supplement 500 ml DMEM med 5% fetalt kalvserum (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 50 ^ M 2-merkaptoetanol, 1% icke-essentiella aminosyror och 25 | ig / ml gentamicin. Förvara mediet vid 4 ° C fram till användning.
- Ta bort mjälten av OT-I transgena möss enligt referens 16. Överför dem i den beredda mediet.
- Generera enda cellsuspension genom att mosa mjältar genom en 70 | im sil och centrifugera suspensionen vid 300 xg under 5 minuter, 4 ° C.
- Inkubera cellsuspension med 5 ml ammonium-klorid-kalium (ACK) buffert (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) under 5 min för att lysera röda blodkroppar.
- Stoppa incubatipå med 10 ml medium och centrifugera den igen såsom beskrivits ovan.
- Späd cellsuspensionen i medium och beräkna siffror. Plate celler vid en densitet av 3 x 10 7 celler / brunn i en 12-brunnsplatta och lufta dem genom inkubation med OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) och interleukin 2 (IL-2) (500 lU / ml) under 5 dagar.
- Efter 4 dagar, till IL-2 vid en koncentration av 500 lU / ml igen.
- Efter stimulering, rena OT-I T-celler från cellsuspension genom att använda en negativ selektion baserad mus CD8 + T-cellisoleringskit enligt tillverkarens instruktioner. Rening är baserad på utarmning av alla icke-CD8 + -celler med användning av en cocktail av antikroppar mot CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC klass II, Ter-119, och TCRγ / δ som sedan kasseras genom att använda magnetiska kolonner för eluering av de renade CD8 + -T-celler.
OBS: Kritiska steg i denna procedure indikeras av tillverkarna: det är viktigt att reaktionen involverar endast enstaka celler eftersom närvaron av klumpar kunde blockera kolonnen under elueringssteget; räkna av cellen innan du lägger den Byotin cocktail är viktigt för renhetsgrad av provet och förfarandet bör utföras på is för att minimera ospecifika bindningar antikropps.
3. Beredning av akut hjärnan skivor och Co-kultur med OT-I T-celler
- Före beredning av akut hjärnan skivor 19, förbereda placedine iskall fysiologisk koksaltlösning med hjälp 200 mM sackaros, 20 mM RÖR, 2,5 mM KCL, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 10 mM MgSO 4, 0.5 CaCl2 och 10 mM dextros och artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) med användning av 125 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 mM NaHCOs 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl2, 10 mM dextros. Justera pH i varje lösning till 7,35 genom using NaOH. Innan du justerar pH i ACSF, måste lösningen bubblas med en blandning av 95% O2 och 5% CO2.
- Pre-kyla lösningarna.
- Bedöva 8-10 veckor gamla möss (t.ex. C57Bl / 6 som kontroll eller transgena ODC-OVA möss 17 med inandning använder 5,0% isofluran, 5,0% halotan eller injicera 100 mg / kg ketamin och 10 mg / kg kroppsvikt xylazin via ip Vänta för anestesi och använda en tå nypa för att bedöma graden av anestesi och halshugga dem på en gång. Euthanize mössen per institutionell djurvård och använda kriterier som kommitté för dödshjälp.
- Sätt musen i ventrala position. Desinficera och skär hårbotten sagittally. Öppna skallbenet sagitally, ta bort hjärnan snabbt med hjälp av en skopa och fixa det på skylten på en vibratome med hjälp lim.
- Fyll plattan med den förberedda placedine iskall fysiologisk koksaltlösning.
- Skär 300 nm koronala skivor med vibratome.
OBS: Detta förfarande är vetn för att ge livskraftiga intakta vävnadsprover lämpliga för funktionella cellulära studier inom ett tidsintervall på minst 8 timmar 19-21. Ja, efter denna tidsperiod, som redan börjar efter 6 timmar, visar beredningen minskad kvalitet, nämligen förändringar i grundläggande och funktionella egenskaper som aktionspotential generation och förökning. - Efter sektione, överföra en skiva direkt i varje brunn på en 12-brunnar fyllda med ACSF.
- Lägg försiktigt 5 x 10 5 OT-I T-celler per skiva.
- Inkubera skivor i upp till 8 h i en inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Efter inkubationstiden, skörd skivor och bädda in dem med hjälp OCT-förening vävnads-tek och frysa dem i flytande kväve. Förvara dem vid -20 ° C för vidare histologiska studier till exempel, utvärdera neuronal struktur (t.ex. med hjälp av anti-MAPII eller anti-synaptofysin antikroppar) eller apoptos (t.ex. med hjälp av anti-kaspas-3-antikroppar och anti-Neun antiorgan) enligt standardförfaranden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter inkubation av hjärnan skivor med oligodendrocyt riktad CD8 + T-celler, oligodendrocyter samt neuroner genomgår apoptos (figurerna 2A och 1C, respektive). Histologiska tecken på apoptos (t.ex. Caspas-3, Tunel) kan tidigast detekteras efter 3 h inkubation. Inkubationstid bör inte vara längre än 8 timmar för att garantera en god kvalitet på produkten och reproducerbara resultat. Apoptotiska celler kan hittas i hela segmentet med övervikt i myeliniserade områden. Exemplifierande histologisk färgning av skiva för strukturell integritet och apoptotiska neuroner avbildas i figur 1A-C.
Det finns olika tidpunkter under inkubation som är av intresse för att bedöma resultatparametrar. En typisk tidsförloppet utförs i vårt labb inkluderar parametrar analyser, nämligen cell-cell interaktioner vid tiden 0, då 3, 4 och 6 timmar (maximal interaktion observer) efterinteraktion startade. Några typiska analyser utöver histologiska analyser som ofta kan tillämpas beskrivs mycket kortfattat:
T-cell-återhämtning och analys
Efter en inkubationstid på upp till 8 timmar, kan T-celler utvinnas från skivor och kan utvärderas för att analysera parametrar i förhållande till de intracellulära effektormolekyler såsom cytokin produktion eller spridning. För att hämta T-celler, segment dissocierades mekaniskt och slås samman varje försöksbetingelse. Celler isolerades från gränsytan en 30% till 50% Percoll (Amersham, Freiburg, Tyskland) efter densitetsgradientcentrifugering under 30 min vid 2500 rpm. På detta sätt är det möjligt att erhålla mononukleära celler som tvättas och färgas omedelbart med flödescytometri tekniker (FACS) med olika antal och typ av antikroppar som varierar beroende på studien som vi vill ta itu med, i detta protokoll, till exempel CD8 + 18.
Information om neuronal hälsa och funktion kan bedömas genom att utföra elektrofysiologisk inspelning t.ex. för att utvärdera grundläggande egenskaper hos neuroner såsom aktionspotentialer (APS) generationen, såsom visas i figur 1D.
Figur 1. morfologiska strukturen av skiva liksom representativa resultat. (A) morfologisk struktur av en skiva 8 h efter inkubering. Skala stapel anger 10 mikrometer. (B) Nervceller är synaptically sammankopplade som avslöjades av co-färgning för MAPII (grön) och synaptofysin (röd) färgning. Skala stapel representerar 10 mikrometer. (C) representant bild av apoptotiska celler (Caspase-3, röd) och nervceller (NeuN, grön) i hippocampus after 6 timmars inkubation. Skala stapel representerar 10 mikrometer. (D) Single cell patch-clamp inspelningar av neuronal aktionspotential generation efter depolariserande aktuella stegen i en mus kortikal neuron. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Flera färgningar utföras för att bedöma specificitet av protokollet. (A) Co-färgning av NogoA (röd), en markör för mogna oligodendrocyter (ODCs) och Caspase3 (apoptos, grön) visar att ODCs angrips av CD8 + T-celler. (B) Interaktion resultatet är negativt när Caspase3 (röd) samar färgas med GFAP, en markör för gliaceller (grön). Skala bar representerar 10 mikrometer. (C) specificity av protokollet stöds av co-färgning av nervceller (DAPI, blå) med Caspase3 (röd), med början från vänster: WT djur, WT djur utsätts för OTI-I T-celler, ODC-ägg och ODC-Ova utsätts för OTI-I T-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika djurmodeller har beskrivits under de senaste decennierna för att ta itu med de patologiska drag av inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar som MS. In vivo mus- och råttmodeller används ofta för att härma patofysiologiska funktioner i sjukdomen, nämligen analys av konsekvenserna av demyelinisering och remyelinisering processer och samsas episoder av inflammation och neurodegeneration. Ändå bara en ex vivo tillvägagångssätt gör att dissekera de exakta underliggande mekanismerna.
Beredning av akut hjärnan skivor är också en stor spridning modell och kan betraktas som tillförlitliga och reproducerbara. I kombination med isolering och inkubation av oligodendrocyt specifika immunceller, kan den användas för att hantera specifika experimentella frågor, särskilt när det gäller att studera mekanismen och kinetiken av ett immuncells attack och cell - cell interaktioner. Andra ex vivo metoder är kända och allmäntanvände 22 men det nya i våra protokoll i specificiteten av målet som kan utmanas genom att utföra olika "uteslutnings" co-färgningar, nämligen kontrollera Caspase3 immunreaktivitet i WT utsatt eller inte utsatt för OT-I T-celler (se figur 2C) .
Vissa kritiska punkter under beredningen bör beaktas, nämligen de experimentella inställningarna, för att se till att experimenten utförs metodiskt korrekt; för intern validitet, isolering och stimulering av de använda immunceller bör kontrolleras regelbundet via t.ex. flödescytometri analyser (FACS). Dessutom kontrollerar vitalitet hjärnan skivor rekommenderas. Experimentella grupper bör vara ålders- och könsmatchade. Experiment ska alltid utföras i enlighet med djurskyddsbestämmelserna.
Vissa begränsningar av protokollet måste hållas i åtanke. Viktigast är den presenterade modellenen ex vivo synsätt och är inte lämpad att helt efterlikna den komplexa immunologiska situationen för autoimmuna sjukdomar i centrala nervsystemet. Det bör också övervägas att modellen bara använder CD8 + T-cellsdrivna immunologiskt svar. CD4 + T-celler och B-celler spelar en mindre framträdande roll. Alternativa protokoll som använder andra oligodendrocyt specifik immuncell subtyper bör beaktas när man behandlar dessa celltyper. Den förväntade histologiska fynd är Oligodendroglial (se figur 2A) och neuronal apoptos (se figur 1C). Alternativt kan uppnås apoptos hos andra celltyper med användning av t.ex. astrogliala eller neuronala antigenspecifika immunceller och transgena system. I detta specifika protokoll var immunoreaktiviteten av Caspase3 i astrogliaceller negativ på grund av den särskilda karaktären hos systemet (Figur 2B).
Det beskrivna protokollet kan anses vara ett grundläggande neuroimmunologisk experimentella förhållningssätt och kan modifieras för andra tillämpningar. Den experimentella proceduren kan lätt tillämpas på andra protokoll genom varierande hjärnsnitt (t.ex. olika transgena möss stammar) i kombination med olika antigenspecifika immuncellundertyper (t.ex., använda myelin oligodendrocyt glykoprotein (MOG) - specifika CD4 + T-celler och hjärnan skivor framställda av C57Bl / 6 möss att ta itu med deras effekter på Oligodendroglial och neuronal apoptos). In vitro aktivering av immunceller kan varieras för specifika immunologiska frågor (t.ex. polarisering i T H 1 eller T H 17 celler).
Ibland kan ökad eller minskad apoptos i hjärnan skivor vara en experimentell utmaning. Några rekommendationer för felsökning är:
Först är starkt beroende av förberedelsetid kvalitet hjärnan skivor samt pH-värde, osmolaritet och oxidation status av ossed lösning. Det bör säkerställas att förutsättningarna är jämförbara mellan de oberoende experiment. Vidare bör aktivering av immunceller kontrolleras regelbundet. Optimal antigenkoncentrationen kan variera. Tänk dig en titrering av den använda antigenet vid upprättandet av experimenten.
Såsom beskrivits ovan, kan den nämnda protokoll användas som utgångspunkt för att analysera effekten av ytterligare immuncellundertyper (t.ex. CD4 + T-celler, B-celler) på det centrala nervsystemets integritet. Dessa tillvägagångssätt är särskilt lämpade för att separera deras effekter på oligodendrogliala och neuronala celler som histologisk analys kan bedömas noggrant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-Well plate | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µm strainer | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | calcium chloride |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | warm in 37 °C water bath before use |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | fetal calve serum |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | potassium chloride |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | potassium hydrogen carbonate |
| L-Glutamine | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | magnesium sulfate |
| NaCl | Sigma | 31434 | sodium chloride |
| NaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodium hydrogen phosphate |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodium hydrogen carbonate |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodium hydroxide |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | ammonium chloride |
| Non essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Sucrose | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
References
- Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
- Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
- Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
- Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
- Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
- Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
- Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
- Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
- Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
- Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
- Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
- Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121 (2013).
- Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
- McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
- Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
- Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41 (2012).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
- Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
- Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).
