Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

القياس الآلي للالرئوي وانتفاخ الرئة ومجرى الهواء الصغيرة في إعادة عرض السجائر الفئران المعرضة للدخان

Published: January 16, 2015 doi: 10.3791/52236
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1,4
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital - Harvard Medical School, 2Department of Respiratory Medicine, University of Cambridge - Addenbrooke's Hospital, 3Lung Transplant Program, Brigham and Women's Hospital - Harvard Medical School, 4COPD and IPF Programs, Lovelace Respiratory Research Institute

Introduction

استخدام نماذج حيوانية لدراسة COPD يمثل تحديا لأنه لا يوجد نموذج يمكن نسخ تماما عن ملامح من الأمراض التي تصيب البشر (2). معظم المحققين استخدام الفئران لنموذج COPD بسبب التشابه بين الفئران والبشر في حياتهم الرئوية علم وظائف الأعضاء، علم الأمراض، وعلم الوراثة، والأيض. أيضا، الفئران غير مكلفة نسبيا للدراسة، وكلا انتفاخ الرئة وإعادة الهوائية الصغيرة تتطور في غضون 6 أشهر من التعرض CS (5،7-9).

السجائر التي يسببها الدخان COPD: يمكن أن العديد من الطرق لحث COPD في الفئران. معظم الباحثين تعرض الفئران لCS، وهو عامل خاص بأسباب الأمراض الرئيسي لمرض الانسداد الرئوي المزمن البشري. التعرض CS لمدة 6 أشهر يسبب تطوير انتفاخ الرئة وإعادة الهوائية الصغيرة (SAR) في الفئران، ولكن شدة المرض التي يسببها تختلف تبعا لسلالة الفئران التي شملتها الدراسة. على سبيل المثال، الفئران NZWLacZ مقاومة لتطوير انتفاخ الرئة CS التي يسببها في حين الفئران AKR / J هي extremel ذ حساسة (10). معظم الباحثين يدرسون C57BL / 6 الفئران سلالة في نموذج التعرض CS كثيرة كما الفئران التي تستهدف الجينات المتاحة في هذه السلالة. بعد 6 أشهر من CS التعرض، وانتفاخ الرئة وتليف الهوائية الصغيرة في تطوير نوع البرية (WT) C57BL / 6 الفئران، وكلا الآفات معتدل نسبيا في شدتها (5،10). يستخدم الباحثون نوعين من CS التعرض: التعرض الأنف فقط وكامل الجسم. المساوئ الرئيسية للفقط الأنف تقنية التعرض هي: 1) أنه هو وسيلة كثيفة العمالة أكثر؛ و2) الفئران لا بد من ضبط النفس في غرف صغيرة والتي يمكن أن تحدث استجابة التوتر وارتفاع الحرارة في الحيوانات (11). العيب الرئيسي للتعرض كامل الجسم (الموصوفة هنا) هو أن الحيوانات يمكن استيعاب (وكذلك يستنشق) النيكوتين والقطران المنتجات عندما تنظيف فرائها. الفئران المعرضة لكامل الجسم CS أيضا انخفاض مستويات كربوكسي هيموغلوبين وتخفيض فقدان وزن الجسم بالمقارنة مع الحيوانات المعرضة للأنف فقط CS (12).

ق ق = "jove_content"> الرئوي اختبار وظيفة (PFTs): تدابير الامتثال الرئة ومرانية وعادة ما تكون مماثلة في C57BL / 6 النوع البري (WT) الفئران المعرضة للهواء أو CS لمدة 6 أشهر بسبب انتفاخ معتدل نسبيا الذي يضع فيه هذا يتعرض سلالة لCS (10). ومع ذلك، عندما تدمير نفاخي هو أكثر شدة، والزيادات في الامتثال الرئة اليسرى والتحولات في الحجم الضغط (PV) تتدفق يمكن الكشف عن الحلقات. هذا الأخير يمكن ملاحظتها، على سبيل المثال، في سلالات الفئران التي هي أكثر عرضة لآثار CS (10)، في CS تتعرض / 6 سلالة الفئران التي تستهدف الجينات C57BL التي لديها نوع انتفاخ الرئة أشد من C57BL / 6 الفئران WT (13)، أو في الفئران CS-تتعرض تعرض للتغيرات البيئية التي تجعلها أكثر عرضة لآثار CS (14). يستخدم هذا البروتوكول جهاز التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة لقياس تخفيضات في الارتداد المرن من الرئة (الزيادات في الامتثال الرئة quasistatic [سنتي ستوك] وتخفيضات في الأنسجةمرانية [H])، حلقات تدفق PV، والتغيرات في مقاومة مجرى الهواء والأنسجة في الفئران تخدير (15،16).

تدابير من انتفاخ الرئة: تحليل التنمية انتفاخ الرئة في CS-تتعرض C56BL / 6 سلالة الفئران هي صعبة بسبب توزيعه هو غير متجانسة مكانيا. عدة طرق مختلفة قياس توسيع المجال الجوي في الفئران. وكان أول الطرق المستخدمة في متوسط ​​اعتراض خطي (L م) (17). ومع ذلك، الأسلوب L م هو بطيئة، عملية يدوية والتي قد لا التقاط عدم التجانس هذا المرض (ما لم يتم أخذ عينات جميع أقسام الرئة بشكل عشوائي) واستخدامه بالتالي قد يعرض التحيز مراقب في التحليل. مؤشر مدمرة [DI، (18)] يقيس أيضا توسيع المجال الجوي باستخدام ورقة شفافة مع 50 نقطة موزعة بالتساوي وضعت على صورة رقمية مطبوعة من الهيماتوكسيلين والقسم الرئة الملطخة يوزين. طريقة PI عشرات المنطقة المحيطة بكل ميلان نقطةحبال إلى المدى الذي يتم تدمير القنوات السنخية والجدران السنخية في هذا المجال. العيب الرئيسي للطريقة DI هو أنه يستغرق وقتا طويلا وليس أكثر دقة من الطرق الأخرى (19،20).

يقيس هذا البروتوكول تعني السنخية طول الوتر ومنطقة السنخية على أقسام الرئة جزءا لا يتجزأ من البارافين ملطخة وصمة عار في جيل. برنامج قياس الأشكال تحويل الصور من أقسام الرئة إلى صور ثنائية (في الأنسجة التي هي بيضاء والمجال الجوي أسود)، ثم تطغى شبكة موحدة من الخطوط الأفقية والعمودية (الحبال) والبرمجيات ثم يقيس طول كل وتر داخل المناطق التي حددتها البرمجيات والمجال الجوي. باستخدام هذه الطريقة، فمن الممكن لقياس حجم الحويصلات الهوائية في جميع أنحاء الرئة بطريقة موحدة ومؤتمتة نسبيا (21).

إعادة عرض الهوائية الصغيرة (SAR): إن ترسب زيادة البروتينات ECM (خاصة interstitiaل الكولاجين) حول الهوائية الصغيرة يحدث في الحيوانات CS يتعرض-ويسهم في تدفق الهواء العرقلة. الباحثون لا دراسة SAR في النماذج الحيوانية للمرض الانسداد الرئوي المزمن في كثير من الأحيان مثل التنمية انتفاخ الرئة (22). لتحديد SAR في الفئران المعرضة CS، هذا البروتوكول يستخدم برمجيات تحليل الصور لقياس سمك طبقة من البروتينات ECM أن يترسب في جميع أنحاء الهوائية الصغيرة (الممرات الهوائية التي يبلغ قطرها متوسط ​​ما بين 300 و 899 م) في أقسام الرئة جزءا لا يتجزأ من البارافين ملطخة بالترسيب وصمة عار ماسون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بروتوكول يأخذ ~ 25 أسبوعا لإكمال. بروتوكول تعرض الفئران للهواء أو دخان لمدة 24 أسبوعا. في نهاية التعرض الدخان، وتضخم التدابير بروتوكول وظائف الرئة في الفئران، والرئتين لضغط ثابت، ثابت، وإزالتها في نفس اليوم. هناك حاجة إلى وقت إضافي للباحث لتضمين، وقطع، وصمة عار على أقسام الرئة (2-3 أيام)، والتقاط وتحليل الصور (2-4 أيام اعتمادا على عدد من الحيوانات درس). ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول أن تستخدم لقياس المرتبطة بالعمر توسيع المجال الجوي في الفئران.

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان والاستخدام في بريجهام ومستشفى النساء / كلية الطب بجامعة هارفارد.

1. كامل الجسم دخان السجائر التعرض

  1. فضح الفئران في التدخين في كامل الجسم جهاز التعرض لدخان (انظر الشكل 1) مثبتة في غطاء الدخان.
    ملاحظة: الجهاز تلقائيا بتحميل السجائر البحث في عجلة، لights السجائر، ويجمع دخان جانب تيار في الجانب تيار غرفة جمع الدخان، وإخراج السجائر. آلة يجمع بين الجانب تيار الدخان بالدخان التيار المستخرج من السجائر بواسطة مضخة لخلق مزيج من التيار الرئيسي والجانب تيار الدخان. مروحة في غرفة خلط وتمييع تختلط الدخان مع الهواء المحيط ويدفع الدخان في غرف التعرض.
  2. أقفاص مكان يحتوي على الفئران دون أغطية قفص إزالة (الشكل 1) في غرفة التعرض. السماح للفئران على التحرك بحرية في جميع أنحاء في أقفاصها والحصول على الطعام والماء لمدة التعرض لدخان (~ 1.75 ح).
  3. وضع دلو مملوء بالماء تحت غرفة السجائر لإطفاء السجائر إخراجه. تشغيل الإيثانول (100٪) من خلال مضخة وتوصيله إلى الجهاز. التبديل على عنصر المعالج للجهاز، الذي يبدأ تحميل الآلي من السجائر، والنفخ للمضخة، والتدفئة للمن ligh السجائرسلك تينغ.
  4. الأحمال جهاز، وأضواء، وتدخن السجائر 10 في وقت وثم يقذف السجائر المستخدمة ومحل لهم دفعة جديدة من 10 سجائر وتكرر هذه العملية. كل دورة تستغرق 9 دقيقة.
  5. التأقلم الفئران التدخين بتعريضها للدخان من 20 سيجارة في اليوم الأول، 40 سيجارة في اليوم الثاني، 60 سيجارة في اليوم الثالث، و 80 سيجارة في اليوم الرابع، و 100 سيجارة في اليوم الخامس. خلال فترة التأقلم، ومراقبة الفئران بعناية بحثا عن علامات على الضيق.
  6. بعد 5 أيام من التأقلم، وتعريض الفئران إلى 100 سيجارة في اليوم، 5 أو 6 أيام أسبوعيا لمدة 6 أشهر. هناك حاجة إلى هذا المستوى من التعرض لدخان للحث على توسيع المجال الجوي المتواضع نسبيا في C57BL / 6 الفئران البرية من نوع (23،24). فضح السيطرة على الفئران لهواء الغرفة المحيطة لمدة 6 أشهر. وزن الفئران قبل الدخان التأقلم وأسبوعيا بعد ذلك لتقييم تأثير التعرض لدخان على وزن الجسم.
  7. مراقبة مجموعه علقت الجسيماتالمسألة (TSPM) في غرف التعرض بعد السجائر 60 الأولى تم المدخن:
    1. وزن ورقة الترشيح ووضعه إلى حامل المرشح في الخط وهذا مرتبط إلى أخذ العينات مرشح في الوقت المناسب وجاف الغاز متر. أخذ العينات مرشح توقيت تسحب الهواء من غرفة التعرض من خلال ورقة الترشيح والغاز متر التدابير تدفق الهواء خلال أخذ العينات.
      ملاحظة: الفخاخ جسيمات مرشح المسألة في 20 م 3 من التعرض غرفة الهواء يمر عبر فلتر (يقاس على متر الغاز الجاف).
    2. حساب العد TPM كما تغير في الوزن تصفية قبل وبعد أخذ العينات (في ملغم) لكل م 3 الهواء. التهم TPM المثالية هي ما بين 150 و 200 ملغ / م 3.
  8. بعد كل من السجائر تم المدخن، وإزالة الأقفاص من غرفة التعرض ومراقبة الفئران لعلامات الضيق لمدة 20 دقيقة.
  9. تنظيف المضخة مع الإيثانول بنسبة 100٪ بعد كل استخدام، وتنظيف جميع الموانئ وقضبان في الجهاز مرتين أسبوعيا لتعزيزدوران الهواء ومنع تراكم القطران.

2. فحص وظائف الرئة (PFTS) والتضخم الرئة

  1. في نهاية التعرض، تخدير كل فأر من خلال تقديم مزيج من الكيتامين (100 ملغ / كلغ)، زيلازين (10 ملغ / كلغ)، وآسيبرومازين (3 ملغ / كلغ) بالطريق داخل الصفاق في 200 ميكرولتر من المياه المالحة (USP الصف)، واستخدام مرهم البيطرية على العيون لمنعهم من الجفاف. الانتظار حتى الحيوان هو في طائرة من التخدير الجراحي، يقيم باستخدام طريقة إصبع القدم قرصة.
  2. حلق الأمامي الجلد إلى القصبة الهوائية، وتطهير المنطقة بمحلول التي تحتوي على اليود تليها الايثانول. وجعل شق منتصف الخط من خلال الجلد والأنسجة تحت الجلد الأمامي إلى القصبة الهوائية باستخدام مقص تعقيمها، وفصل عضلات قصي درقي مع ملقط لفضح القصبة الهوائية.
  3. تمرير طول 2 بوصة من الخيط الحرير الخلفي إلى القصبة الهوائية، وجعل القصبة الهوائية على الجانب الأمامي من القصبة الهوائية مع تي تعقيمهامقص racheal، اضافة الى وجود قنية القصبة الهوائية (18 G) في القصبة الهوائية، وضمان الحصول عليها في مكان مع خياطة.
  4. توصيل الماوس إلى Y-أنابيب لمحول من التنفس الصناعي الميكانيكي عن طريق قنية القصبة الهوائية، والشروع في التهوية الميكانيكية باستخدام حجم المد والجزر من 10 مل / كغ ومعدل التنفس من 150 الأنفاس / دقيقة.
    ملاحظة: من المهم في هذه المرحلة لضمان أن الفأر هو تخدير كاف للحصول على قياسات دقيقة PFT. إعادة جرعة الفأر مع التخدير إذا كان الحيوان ليس في طائرة من التخدير الجراحي. كامل مدة كل المناورات PFT حوالي 7.5 دقيقة، لذلك ليس من الضروري عادة إلى redose الفئران مع التخدير مرة واحدة تم تحقيقه طائرة من التخدير الجراحي. الوقت الإجمالي من تحريض التخدير إلى القتل الرحيم هو ~ 20 دقيقة.
  5. تضخيم الرئتين إلى قدرة الرئة الكلية (TLC) 3 مرات لتاريخ حجم لقياس القدرة الشهيق (IC) والحد من انخماص الرئة. المقبل، ادائهام وتيرة واحدة القسري مناورة التذبذب (لقطة-150 اضطراب) وتقييم المقاومة الديناميكية (R)، مرانية (ERS) والامتثال (CRS) في الجهاز التنفسي، تليها تردد النطاق العريض القسري التذبذب مناورة (سريعة رئيس-3 الاضطراب ) وقياس مقاومة مجرى الهواء المركزية (R ن)، ومقاومة الأنسجة (G)، مرانية الأنسجة (H) ونسبة G / N (). وأخيرا، سجل الامتثال quasic ساكنة (C الحادي و) خلال المناورات تدفق حجم الضغط.
  6. كرر كل من هذه المناورات خمس مرات (أو تنفيذ تدابير إضافية حتى يتم الحصول على قراءات ثابتة) وتضخيم لTLC ثلاث مرات بين كل مجموعة متكررة من القياسات. تسجيل القيمة المتوسطة لكل معلمة لكل الماوس.
  7. إزالة الماوس من التنفس الصناعي الميكانيكي، والموت ببطء مع الخدر CO 2 تليها خلع عنق الرحم [الموافقة على هذا الأسلوب القتل الرحيم لدينا رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام]. قطع الحجاب الحاجز، مرجع سابقأون الصدر في خط الوسط، وإزالة الأضلاع الأمامية لفضح الرئتين. تشريح الجلد والنسيج تحت الجلد حول القصبة الهوائية واجتياز الثاني طول 2 بوصة من الخيط الحرير الخلفي إلى القصبة الهوائية.
  8. إعداد المعدات للتضخم الرئة (الشكل 2):
    1. ملء 500 مل مخروطي مخروطي قارورة ¾ الكاملة مع برنامج تلفزيوني العقيمة، وختم ذلك مع سدادة مطاطية، عكس ذلك، وتعليقه على موقف عصابة (مثل أن الغضروف المفصلي للpH7.4 الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) هو 25 سم فوق قلب الماوس).
    2. إدراج واحدة من نهاية العطاء في الوريد وضعت على برنامج تلفزيوني في قارورة من خلال سدادة مطاطية. إدراج طول 6 بوصة من ماصة مصلية البلاستيكية من خلال سدادة مطاطية بحيث افتتاحه يكمن فوق الغضروف المفصلي للPBS للسماح للهواء لتحل محل PBS ترك القارورة.
    3. فتح صمام مجموعة العطاء وتشغيل برنامج تلفزيوني على الرغم من أن نظام لطرد الهواء من مجموعة العطاء.
  9. ربط INTRavenous مجموعة العطاء لقنية القصبة الهوائية، وفتح صمام، وتسمح PBS في التدفق إلى الرئتين عن طريق الجاذبية حتى الرئتين تضخيم بالكامل. إغلاق صمام، وتعادل خارج القصبة الهوائية باستخدام الخيط الجراحي لالقاصي قنية القصبة الهوائية، وإزالة قنية.
  10. رفع القصبة الهوائية مع ملقط، وقطع الداني القصبة الهوائية إلى عقدة، وتشريح الخلفي النسيج الضام إلى القصبة الهوائية والرئتين. إزالة بعناية الرئتين (دون الخدش منهم)، ووضع الرئتين في أنبوب تحتوي على 10٪ مخزنة المالحة الفورمالين. إصلاح الرئتين O / N في RT، وفي اليوم التالي، غسلها مع برنامج تلفزيوني مرتين.
  11. تضمين الرئتين في البارافين، وقطع 5 ميكرون أبواب سميكة، ثم صمة عار على أقسام مع وصمة عار جيل على النحو المبين أدناه.

3. انتفاخ الرئة

  1. تلطيخ جيل من أقسام الرئة جزءا لا يتجزأ من البارافين
    1. ضع الشرائح في رفوف البلاستيك واحتضان لهم في 70ºC لمدة 20-30 دقيقة في فرن.
    2. دي pariffinize الشرائحالتي تفرخ لهم لمدة 2 دقيقة في كل من أربعة تغييرات من زيلين.
    3. ترطيب الشرائح التي تفرخ لهم لمدة 2-3 دقيقة في كل من تغييرين من الإيثانول بنسبة 100٪، تليها 2-3 دقيقة في كل من تغييرين من 95٪ من الإيثانول، ثم يغسل الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 2-3 دقيقة لكل تغيير من الحل.
    4. احتضان الشرائح لمدة 18-48 ساعة في 1: 1 خليط من الهيماتوكسيلين جيل وتعديل هاريس الهيماتوكسيلين.
    5. تغسل الشرائح لمدة 2 دقيقة في كل من خمسة تغييرات من الماء المقطر، ويذوى الشرائح التي يحتضنها ثم لمدة 2-3 دقيقة في كل من تغييرين من الايثانول 95٪، تليها 2-3 دقيقة في كل من 2 التغييرات من 100٪ الإيثانول.
    6. مسح الشرائح التي تفرخ لهم لمدة 2 دقيقة في كل من أربعة تغييرات من زيلين.
    7. جبل الشرائح مع وسائل الاعلام واضحة التركيب و إضافة ساترة دون إدخال فقاعات، والتي سوف تعيق تحليل لاحقة.
  2. العشوائية الحصول على الصور:
    1. الحصول على صور بالأبيض والأسود كملف TIFFS باستخدام المجهر، وهو الهدف 20 X، وكاميرا والبرامج التي يمكن الحصول على صور رقمية عالية الجودة.
    2. التقاط الصور ~ 20-30 (X 200 التكبير) في الماوس بطريقة عشوائية، مع المراقب أعمى إلى حالة تجريبية، وتجنب المناطق الخاضعة-تضخم في الرئة.
    3. الشريط الصغرى الشريحة الحقل المكتشف على الشريحة. مكتشف الحقل يحتوي على الشبكة التي تحتوي على سلسلة من المربعات التي وصفت مع بريد إلكتروني (في الاتجاه العمودي) وعدد (في الاتجاه الأفقي) وكل مربع يحتوي على الصليب (+) في الوسط ويتم التعرف بواسطة حرف واحد وعدد (على سبيل المثال، A1، A2، ...... Z25).
    4. استخدام حقل عشوائية جدول مولد اكسل لتحديد عشوائيا مربع لالتقاط الصور. لإنشاء بريد إلكتروني عشوائي، أدخل EFGHJKLMNPQRSTU في الخلية B1 في جدول البيانات (الباحث يمكن ضبط هذا النطاق إلكتروني لتغطية مجموعة من المربعات التي حددها بريد إلكتروني أن علا الرئتين). المقبل، إضافة الصيغة [= MID ($ B $ 1،1 + INT(RAND () * LEN (1 $ B $)] إلى الخلية C1 لتحديد عشوائيا بريد إلكتروني في C1. نسخ ولصق C1 إلى C2، C3، C4 وهلم جرا لتوليد عمود من الرسائل العشوائية.
    5. لإنشاء عدد عشوائي في العمود المجاور، اكتب الصيغة = RANDBETWEEN (5،25) في D1 (5-25 حيث هو في مدى محدد من الأنسجة على الشريحة). اختياريا، وضبط هذا النطاق لتغطية مجموعة من المربعات التي تم تحديدها من قبل عدد علا أن الرئتين.
    6. نسخ ولصق إلى D1 D2، D3، D4 وهلم جرا لتوليد عمود من الأرقام العشوائية بجانب ذلك تحتوي على الرسائل العشوائية. وهكذا، كل صف يحتوي على زوج من الحروف والأرقام بشكل عشوائي الموافق التسميات على المربعات في الميدان مكتشف (على سبيل المثال، E17، H24 ....).
    7. ضع الشريحة على المجهر. باستخدام المجهر الهدف 4X العثور على الساحة المقابلة في الشريحة مكتشف الحقل (على سبيل المثال، E17، H24 ...) ووضع هذه الساحة في وسط الميدان المجهر.
    8. محاذاة وسط المجهريةالمجال مع "+" في وسط الميدان المحدد. إزالة مكتشف المجال، والتركيز على الرئة باستخدام المجهر الهدف 20X والحصول على صورة كملف TIF مقياس الرمادية. إذا أغطية أنسجة الرئة <50٪ من الحقل المجهري، حدد المقبل ولدت عشوائيا مربع. كرر حتى ~ يتم التقاط الصور 20-30 لكل حيوان. حفظ كافة الصور لكل حيوان في مجلد واحد وصفت مع رقم بطاقة الحيوان من أجل تقرير ماكرو Excel التعرف على الملفات.

4. قياس الأشكال لقياس انتفاخ الرئة

يستخدم بروتوكول المطعوم صورة وحدات الماكرو المخصصة لتحليل المجال الجوي التوسيع. سليل الصورة نسخة متوافقة مع Windows من المعاهد الوطنية للصحة تطبيق الصورة الأصلية التي يعمل تحت نظام تشغيل ماكنتوش. تدير سليل صورة تحت ويندوز XP ولا تزال متاحة على الانترنت من خلال Wikiversity.org، حيث البحث عن 'المطعوم صورة "سيتم توجيه المستخدم إلى وصلات لاليدوية وبيتا 4.0.2 الإفراج عن المطعوم صورة. هو مفصل تركيب وتشغيل البرمجيات في دليل ملحق الانترنت وتلخيصها أدناه. تم تعديل السنخية ماكرو طول الوتر من الماكرو متوفرة في المعاهد الوطنية للصحة صورة.

  1. إعداد صورة TIFF من قسم الرئة الملون للجيل لتحليل الصور سيون:
    1. بدء المطعوم صورة وتحميل وحدات الماكرو كما هو مبين في الملحق على الانترنت. حدد صورة المفتوحة Brightfield [1] ماكرو لاختيار وفتح ملف صورة TIFF. وبعد ذلك، استخدام أدوات تحرير الصور لإعداد صورة للتحليل.
    2. استخدام أداة الطلاء فرشاة لإجبار مجالات الصورة التي لم يتم الجوي أو في الجدران السنخية في أن يعامل إما الجوي أو الأنسجة. على سبيل المثال، والطلاء القصبات الهوائية والأوعية الأسود بحيث يتم تحليلها على أنها الأنسجة. طلاء الخلايا الالتهابية (أو الغبار) التي تشغل حيزا في بياض الحويصلات الهوائية إلى أنهم تحليلها كما الجوي.
    3. اختيار لون فرشاة الطلاء بالضغط على مؤشر الفأرة علىكلمات أسود أو أبيض في الجزء السفلي من نافذة طرفية. التالي، انقر فوق أداة الفرشاة. لتغيير حجم الفرشاة، انقر مرتين على أداة الفرشاة وإدخال حجم الفرشاة المناسبة. انقر واسحب الماوس فوق الصورة لرسم الهياكل اللون المحدد (انظر رقم 1 أعلاه).
  2. قياس متوسط ​​طول وتر للمجال الجوي
    1. حدد الحبل طول الكلي الهواء [2] لقياس أطوال المجال الجوي وتر.
    2. العتبة صورة من جانب أول، النقر على الماوس بالقرب من مركز الصورة ثم اسحب الماوس لأعلى أو لأسفل لضبط قيمة العتبة (رقم بين 0 و 255، والذي يظهر في نافذة معلومات). انقر بزر الفأرة الأيمن مرة ثانية لقبول قيمة العتبة. ضبط عتبة لجعل الجدران السنخية سمك نفس في الصور الأصلية.
      ملاحظة: ومن الأهمية بمكان أن الباحث لا تحت عتبة، وبالتالي إنشاء فواصل في الجدران السنخية التي لم تكن موجودة في الصورة الأصلية التي سوف تنتجمصطنع القيم طول الوتر عالية.
    3. البرنامج تلقائيا يزيل بكسل واحدة (بكسل سوداء واحدة محاطة 8 بكسل البيضاء).
    4. م> 4.2.4. مراقبة النافذة التي يطالب المستخدم لإعادة عتبة الصورة الثنائية، ومواصلة الماكرو، أو إلغاء الماكرو. إلى عتبة مرة أخرى، والإجابة Y إلى موجه واختر الزر موافق.
    5. م> 4.2.5. تصور نافذة شبكة الأفقي والرأسي مع خطوط 5 بكسل خلق بصرف النظر من قبل وحدات الماكرو. ويقيس البرنامج أطوال الخطوط الأفقية والعمودية التي تتداخل المجال الجوي.
    6. حفظ الملف في أي مجلد، ولكن لا تغيير الاسم الافتراضي وإلا فإن وحدات الماكرو تقرير Excel لا العثور على الملف (الشكل هو اسم الصورة المرفقة مع "CLa.txt" لطول وتر الأجواء.
      ملاحظة: إذا كان البرنامج لا تجعل القياسات، قد تكون القيمة عتبة منخفضة جدا (يجب أن تكون> 1). إذا حدث هذا، الباحث إعادة عتبات الصورة باستخدام قيمة أعلى.
    7. طب الطوارئ> 4.2.7. لقياسات منطقة السنخية (بالإضافة إلى وتر أطوال)، تشغيل إضافي [4] و [5] وحدات الماكرو كذلك.
    8. م> 4.2.8. تستمر حتى كل الصور تم تحليلها.
  3. تحليل النتائج باستخدام وحدات الماكرو تقرير إكسل
    1. مفتوحة تقرير إكسل 20x.xls. تمكين وحدات الماكرو يدويا إذا لزم الأمر يتوقف على إعداد الأمان الافتراضي في Excel الإصدار المستخدمة.
    2. نلاحظ قائمة وحدات الماكرو في الإطار الماكرو (انظر الجدول 1).
      ملاحظة: CL_Air_1 تقارير طول الوتر من المجالات الجوية لحيوان واحد (مجلد). CL_Air_Multi تقارير طول الوتر من المجالات الجوية للحيوانات متعددة (المجلدات). AP_No_Edge_1 تقارير مجال الحويصلات الهوائية دون اتصالات حافة لواحد الحيوان (مجلد) .AP_No_Edge_Multi تقارير مجال الحويصلات الهوائية دون اتصالات حافة للحيوانات متعددة (المجلدات). AP_With_Edge_1 تقارير مجال الحويصلات الهوائية مع جهات الاتصال حافة لحيوان واحد (مجلد). AP_With_Edge_Multi تقارير مجال الحويصلات الهوائية مع حافة جontacts للمجلدات متعددة.
    3. اختر الماكرو CL_Air_Multi أن يقدم السنخية قياسات طول الوتر لعدة مجلدات الموافق الصور من الفئران متعددة. تقارير البرنامج كافة الملفات _CLa.txt في المجلدات المحددة. حذف ملف _CLa.txt (حسب الحاجة) من خلال نقله إلى مجلد فرعي من المجلد الحالي أو إعادة تسمية جزء _CLa.
    4. من نافذة الملف، حدد مجلد واحد في وقت واحد من خلال تسليط الضوء المجلد ثم تحديد OK (البرنامج لا يدعم اختيار متعددة في وقت واحد). كما يتم تحديد كل مجلد، ومراقبة ذلك في ورقة العمل. حدد "إلغاء" أو إغلاق إطار ملف من أجل الاستمرار.
      ملاحظة: اعتمادا على إصدار Excel، قد يكون الباحث للتنقل مستوى مجلد واحد بعد تحديد كل مجلد.
    5. مراقبة ورقة عمل منفصلة لكل مجلد، والتي تبين إحصاءات لكل ملف _CLa.txt تليها إحصاءات عن البيانات طول وتر مجتمعة من جميع الملفات _CLa.txt.
    6. إعادة تسمية وحفظ جدول البيانات. اسم الملف الافتراضي هو اسم المجلد الأصل إلحاق مع _CLa.xls. إغلاق ورقة العمل قبل اختيار ماكرو آخر.

5. مجرى الهواء الصغيرة إعادة عرض

  1. تلطيخ والحصول على الصور
    1. وصمة عار أقسام الرئة مع بالترسيب وصمة عار ماسون في استخدام عدة التجارية واتبع تعليمات الشركة الصانعة.
    2. التقاط الصور من كل الهوائية في كلا الرئتين التي يمكن استيعابها تماما (بما في ذلك طبقة زرقاء خارج مجرى الهواء وهو طبقة من البروتينات ECM التي تترسب) ضمن مساحة الصورة باستخدام الهدف 20X على المجهر.
      لا ترتبط أكبر الهوائية مع ترسب زيادة البروتينات ECM في الفئران CS تتعرض: ملاحظة.
    3. حفظ الصور الملونة على شكل ملفات JPEG.
  2. تحليل الصور: افتح ملف الصورةفي برنامج صورة برامج التحليل.
    1. فتح واسم ملف السجل لتسجيل القياسات.
    2. تحديد أداة رسم خط. رسم 4 خطوط عبور التجويف من مجرى الهواء (القطر الداخلي) لقياس حجم مجرى الهواء، وتشمل فقط تلك الممرات الهوائية وجود الحجم المطلوب في التحليل. وبعد ذلك، رسم 12 خطوط متباعدة بشكل متساو (على الموقف في مجرى الهواء المقابلة لأرقام من ساعة) تمتد من حافة طبقة الغلالة البرانية المتاخمة لمجرى الهواء من على حافة المنطقة الزرقاء الملطخة تحيط مجرى الهواء لقياس سمك طبقة من البروتينات ECM المودعة خارج مجرى الهواء (الشكل 5). تجنب قياس المناطق التي يتفاعل مجرى الهواء مع الخطوط الجوية أو غيرها من السفن.
    3. السجل الاول كل من الخطوط الداخلية قطر في ملف السجل، ومن ثم تسجيل 12 خطوط لقياس سمك طبقة ECM زرقاء حول الشعب الهوائية.
    4. إغلاق الصورة ثم فتح الصورة القادمة.
      5. <لى> كرر هذه الخطوات حتى يتم تسجيل كافة الصور للحيوان في مجلد واحد.
    5. تبدأ في خطوة 5.2 للمجلد المقبل الذي يحتوي على الصور التي تم التقاطها على أقسام الرئة من الحيوان المقبل. الخروج من البرنامج بعد الانتهاء من تحليل جميع الشعب الهوائية في الرئة أقسام من جميع الحيوانات في التجربة.
    6. أدخل 4 قياسات قطرها الداخلي و12 ECM طبقة البروتين قياسات سمك المسجلة لكل مجرى الهواء لكل الماوس في ملفات السجل البيانات إلى جداول البيانات إكسل. متوسط ​​قطر والبروتين ECM قياسات سمك طبقة لكل حيوان.
    7. تحويل القياسات من بكسل إلى ميكرون.
    8. مجموعة الشعب الهوائية وفقا لحجم قطرها الداخلي الخاصة بهم (على سبيل المثال.، 300-399 ميكرون، 400-499 ميكرون الخ) وقارن ECM قياسات سمك طبقة بروتين حول الشعب الهوائية وجود أحجام مماثلة للنقل الجوي مقابل الفئران المعرضة للدخان (على سبيل المثال، الخطوط الجوية التي يبلغ قطرها 300-899 ميكرون.
    9. إذا لزم الأمر، أقسام الرئة immunostain للبروتينات الفردية (بما في ذلك الكولاجين خلالي والطابق السفلي بروتين الغشاء) وإجراء تحليل مماثل لقياس ترسب البروتينات ذات الاهتمام باستخدام هذا الأسلوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذا البروتوكول يبدأ مع تعرض كامل الجسم من الفئران لCS. الرقابة الكافية وصيانة الجهاز ورصد TPM بحساب ضمان التعرض الدخان متناسقة (الشكل 1). من المهم أن يمارس الباحث تقنية التضخم الرئة باستخدام جهاز التضخم

هذا البروتوكول يبدأ مع تعرض كامل الجسم من الفئران لCS. الرقابة الكافية وصيانة الجهاز ورصد TPM بحساب ضمان التعرض الدخان متناسقة (الشكل 1). من المهم أن الممارسات الباحث تقنية التضخم الرئة باستخدام جهاز التضخم (الشكل 2) وبعناية يزيل الرئة بعد التضخم من أجل الحصول على أقسام الرئة مضخمة بشكل جيد لتحليل دقيق للمجال الجوي التوسيع. ويبين الشكل 3A الرئة تضخم بشكل جيد في حين أن الشكل 3B يظهر الرئة سيئة تضخم. الرقم 3C يظهر صورة لقسم الرئة تضخم المعدة للق العتبةورسمت تيب (الضامة في المساحات السنخية الأبيض، ورسمت السفن والقصبات الأسود لتوليد. الخطوة العتبة يخلق صورة ثنائية فيها كل بكسل في الفضاء السنخية هي بيضاء وكل بكسل في مناطق الرئة التي ليست الحويصلات الهوائية هم من السود (الشكل 3D). الشكل 3E و3F تظهر وتر السنخية الرأسي والأفقي أطوال أن وحدات الماكرو تولد، على التوالي.

تظهر اختبارات وظائف الرئة التحولات المتواضعة (وليس ذات دلالة إحصائية) غادر في حجم الضغط (PV) حلقات يعكس خسارة متواضعة من الارتداد المرن في الرئة بما يتفق مع انتفاخ معتدل التي تطور في C57BL / 6 الفئران WT تتعرض لCS لمدة 6 أشهر ( الشكل 4A). ويلاحظ التحولات اليسرى كبيرة في الحلقات PV فقط في سلالات الفئران التي هي حساسة جدا لتأثيرات CS أو في CS تتعرض الفئران التي تستهدف الجينات وجود النمط الظاهري انتفاخ الرئة أشد من CS-تتعرض C57BL / 6 الفئران WT.

تينلدى عودتهم 5 يظهر صور تمثيلية ملطخة بالترسيب أقسام الرئة ماسون من C57BL / 6 الفئران WT تعرضها للهواء (الشكل 5A) أو CS (الشكل 5B) لمدة 6 أشهر توضح زيادة في ترسب البروتين ECM حول الهوائية الصغيرة في الحيوانات CS يتعرض. الشكل 5C يوضح كيف يقيس برنامج حاسوبي تحليل الصور ترسب البروتين ECM حول الشعب الهوائية وجود القطر الداخلي المطلوب. ويبين الشكل 5D تحليل ترسب البروتين ECM حول الهوائية التي يبلغ قطرها 300-899 ميكرون في CS-تتعرض C57BL / 6 الفئران WT.

الشكل (1)
الشكل 1. الكرتون للنظام التعرض السجائر كامل الجسم. تم توصيل جهاز التعرض لدخان إلى غرفة التعرض لدخان. يتم سحب الدخان من غرفة جمع جنبا إلى تيار ويتم سحب الدخان منالسجائر بواسطة مضخة، وكلاهما عينات الدخان مختلطة والمخفف مع الهواء المحيط في خلط والتخفيف غرفة (يسار)، ثم يتدفق الدخان في الغرفة التعرض. يضع الباحث الفئران في أقفاصها في الغرفة التعرض (يمين)؛ الفئران قادرة على التحرك بحرية في أقفاصها، والحصول على الطعام والماء لمدة التعرض لدخان.

الشكل 2
الشكل 2. التضخم من الرئتين الفئران. يملأ الباحث قارورة مع برنامج تلفزيوني العقيمة، والأختام ذلك مع سدادة مطاطية، وبعكس ذلك ويؤمن أنه على مسافة 25 سم فوق قلب الحيوان باستخدام موقف الدائري. مجموعة العطاء في الوريد يسلم PBS إلى الرئتين عبر القصبة الهوائية قنية. يتم إدخال ماصة قطع أسفل مصلية من خلال سدادة مطاطية وهذا يسمح للهواء في قارورة ليحل محل حجم PBS أن يصب في لوخ ع من الفئران عن طريق الجاذبية.

الشكل (3)
الرقم تحليل 3. انتفاخ الرئة. (A) يظهر صورة ممثل Gill's وصمة عار تضخم أقسام الرئة من الفئران المعرضة للهواء أو CS لمدة 6 أشهر، والسهام السوداء تشير إلى وجود سفينة والضامة السنخية. (B) يظهر صورة تمثيلية من الرئة مبالغ تحت هذا ليس مناسبة للتحليل. (A) يدل على "قبل" و (C) يبين "بعد" صورة لمقطع تمثيلي الرئة التي تعد الباحث عن جيل من صورة ثنائية. السهام السوداء في (A) و (C) تشير إما سفينة (الذي يرسم الباحث الأسود في (C)) أو الضامة السنخية (الذي يرسم الباحث الأبيض في (C)). (D) < / قوي> يظهر الصورة الثنائية بعد يقوم الباحث الخطوة العتبة. (E) و (F) تظهر وتر السنخية الأفقي والرأسي أطوال أن الباحث يولد، على التوالي. التكبير من جميع الصور هو العاشر شريط 200. مقياس تمثل 400 ميكرون هو مبين في (A).

الشكل (4)
الشكل 4. السنخية طول الوتر والضغط حجم المنحنيات. (A) معارض تحليل نموذجي من أطوال وتر السنخية في C57BL / 6 الفئران WT تعرضها للهواء (ن = 13) أو CS (ن = 24) لمدة 6 أشهر. العلامة النجمية يشير P <0.001. (B) يظهر الحلقات PV النموذجية التي أجريت على C57BL / 6 الفئران WT تعرضها للهواء (ن = 13) أو CS (ن = 14) لمدة 6 أشهر. يتم التعبير عن البيانات كما يعني + SEM.

highres.jpg "/>
الشكل 5. إعادة الهوائية الصغيرة (SAR) التقييم. (A) و (B) تظهر الصور التمثيلية للالملطخة بالترسيب أقسام الرئة ماسون من C57BL / 6 الفئران WT تعرضها للهواء (A) أو CS (B) لمدة 6 أشهر. (C) يبين كيف برمجيات تحليل الصور ويحلل SAR في الفئران المعرضة CS. (D) يوضح قياسات نموذجية من سمك طبقة خارج الخلية البروتين مصفوفة المودعة حول الهوائية الصغيرة التي يبلغ قطرها 300-899 متر في C57BL / 6 الفئران WT تعرضها للهواء (ن = 11) أو CS (ن = 16) لمدة 6 أشهر. يتم التعبير عن البيانات كما يعني + ووزارة شؤون المرأة والنجمة يشير P <0.05.

وتظهر على نطاق والحانات على الصور من كل قسم الرئة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نود أن نشكر فرانشيسكا Polverino MD، وهو زميل باحث في بريجهام ومستشفى النساء لمساهمتها في هذه المادة، وكذلك مونيكا ياو، BS، وكيت ريدل، BS على المساعدة التي قدموها مع تربية الفئران وتعريض الفئران لدخان السجائر.

وأيد هذا العمل من قبل دائرة الصحة العامة، القومي للقلب والرئة والدم المعهد منح HL111835، HL105339، HL114501، الطيران الحضور معهد البحوث الطبية غرانت # CIA123046، وبريجهام ومستشفى النساء-افليس الجهاز التنفسي معهد بحوث اتحاد، وكامبردج NIHR الطبية الحيوية مركز الأبحاث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Whole-body smoke exposure device Teague Enterprise TE-10z Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette University of Kentucky 3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm Pall Corporation 7219 For measurement of TPMs
25 mm filter holder Pall Corporation
Filter sampler Intermatic Metal T100
Gas meter AEM Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge Labinvention Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator Scireq FlexiVent
Gill's hematoxylin solution  Sigma-Aldrich GSH316 For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified Sigma-Aldrich HHS16
Cytoseal-60 Thermo Scientific 8310-16
Micro-Slide-Field-Finder Andwin Scientific INC 50-949-582 For analysis of emphysema
Scion Image Program Scion Corporation
Mason's trichrome stain Sigma-Aldrich HT15 For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0 Molecullar Devices LLC 31032

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
  2. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
  3. Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
  4. Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
  5. Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
  6. Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
  7. Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
  8. Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
  9. Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
  10. Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
  11. van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
  12. Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
  13. Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
  14. Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132 (2013).
  15. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172 (2013).
  16. De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
  17. Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
  18. Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
  19. Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The 'destructive index' in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
  20. Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
  21. Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
  22. Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
  23. McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
  24. Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).

Tags

الطب، العدد 95، COPD، والفئران، وإعادة عرض مجرى الهواء الصغيرة، وانتفاخ الرئة، الرئوي اختبار وظيفة
القياس الآلي للالرئوي وانتفاخ الرئة ومجرى الهواء الصغيرة في إعادة عرض السجائر الفئران المعرضة للدخان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K.… More

Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice. J. Vis. Exp. (95), e52236, doi:10.3791/52236 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter