Automatiseret Måling af lungeemfysem og Small Airway Remodeling i cigaretrøg-eksponerede mus

Introduction

Brugen af dyremodeller til at studere KOL er udfordrende, fordi ingen model perfekt kan replikere alle funktioner i den menneskelige sygdom ^(2). De fleste efterforskere bruge mus til at modellere KOL på grund af lighederne mellem mus og mennesker i deres pulmonale fysiologi, patologi, genetik og metabolitter. Også mus er relativt billige at studere, og begge emfysem og små luftveje remodellering udvikle sig inden for 6 måneder efter CS eksponering ^(5,7-9).

Cigaretrøg-induceret KOL: Flere metoder kan fremkalde KOL i mus. De fleste forskere udsætte mus for CS, som er det vigtigste ætiologiske faktor for human KOL. CS eksponering i 6 måneder forårsager udvikling af emfysem og små luftveje remodeling (SAR) i mus, men sværhedsgraden af ​​den sygdom, der induceres varierer afhængigt af den murine stamme undersøgt. For eksempel NZWLacZ mus er resistente over for udviklingen af ​​CS-induceret emfysem henviser AKR / J-mus er extremely følsomme ^(10). De fleste forskere studerer C57BL / 6-stammen mus i CS eksponering model så mange gen-målrettede mus er tilgængelige i denne stamme. Efter 6 måneders CS eksponering, emfysem og små luftveje fibrose udvikle sig i vildtype (WT) C57BL / 6-mus, og begge læsioner er relativt milde i sværhedsgrad ^(5,10). Forskere bruger to typer af CS eksponering: næse-only og hele kroppen engagementer. De største ulemper ved næsen kun eksponering teknik er, at: 1) det er en mere arbejdsintensiv metode; og 2) mus skal fastholdes i små kamre, der kan foranledige en stress respons og hypertermi i dyr ^(11). Den største ulempe ved hele kroppen eksponering (beskrevet her), at dyrene kan indtage (samt inhalerer) nikotin- og tjære produkter, når de rense deres pels. Mus udsat for hele kroppen CS også har lavere carboxyhæmoglobin niveauer og reduceret tab af kropsvægt sammenlignet med dyr udsat for næse kun CS ^(12).

Lungefunktionen test (PFT): Foranstaltninger af lungefunktion og elastans er normalt ens i C57BL / 6 vildtype (WT) mus udsat for luft eller CS 6 måneder på grund af den relativt mild emfysem, der udvikler sig, når denne stamme udsættes for CS ^(10). Men når emphysematous ødelæggelse er mere alvorlig, stigninger i lunge overholdelse og venstre skift i tryk-volumen (PV) flow, sløjfer kan påvises. Sidstnævnte kan iagttages, for eksempel i murine stammer, som er mere modtagelige for virkningerne af CS ^(10), CS-eksponerede C57BL / 6 strain gen-målrettede mus, som er en mere alvorlig emfysem type end C57BL / 6 WT-mus ^(13), eller i CS-eksponerede mus udsat for miljømæssige ændringer, der gør dem mere modtagelige for virkningerne af CS ^(14). Denne protokol bruger en lille dyr ventilator til at måle reduktioner i den elastiske rekyl af lungen (stigninger i kvasistatiske lunge overensstemmelse [Cst] og reduktioner i vævelastans [H]), PV flow loops, og ændringer i luftveje og væv resistens i bedøvede mus ^(15,16).

Mål for lungeemfysem: Analyse af emfysem udvikling i CS-eksponerede C56BL / 6 stamme mus er udfordrende, fordi dens fordeling er rumligt heterogen. Flere forskellige metoder kvantificere luftrum udvidelsen i mus. Den første metode var den gennemsnitlige lineære skæringspunkt (L _m) ^(17). Men L _m metode er en langsom, manuel proces, der kan ikke fange heterogenitet af sygdommen (medmindre alle dele af lungen tilfældigt udtages), og dets brug kan derfor indføre observatør skævhed i analysen. Den destruktive indeks [DI, ^(18)] også kvantificerer luftrummet udvidelsen ved hjælp af en gennemsigtig plade med 50 jævnt fordelt point placeret over en trykt digitaliseret billede af en hematoxylin og eosin-farvede lunge sektion. PI-metode scorer området omkring hvert punkt achold til det omfang, hvori de alveolære kanaler og alveolære vægge inden for dette område er ødelagt. Den største ulempe ved DI metode er, at det er tidskrævende og ikke mere nøjagtige end andre metoder ^(19,20).

Denne protokols betyder alveolær akkord længde og alveolære område på paraffinindstøbte lungesnit farvet med Gills plet. Morfometri software konverterer billeder af lungesnit til binære billeder (hvor væv er hvid og luftrummet er sort), og derefter lægger et ensartet net af vandrette og lodrette linjer (akkorder) og softwaren derefter kvantificerer længden af ​​hver akkord indenfor områder, som software som luftrummet. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde er det muligt at måle størrelsen af alveolerne i alle dele af lungen på en standardiseret og relativt automatiseret måde ^(21).

Lille luftveje remodeling (SAR): Den øgede aflejring af ECM-proteiner (især interstitial collagener) omkring små luftveje sker i CS-eksponerede dyr og bidrager til luftvejsobstruktion. Forskere ikke studere SAR i dyremodeller af KOL så ofte som emfysem udvikling ^(22). For at kvantificere SAR i CS-eksponerede mus denne protokol anvender billedanalyse-software til at måle tykkelsen af ​​laget af ECM-proteiner, der er deponeret omkring de små luftveje (luftvejene med en gennemsnitlig diameter på mellem 300 og 899 m) i paraffinindlejrede lungesnit farvet med Masson trichrom pletten.

Protocol

Protokollen tager ~ 25 uger at gennemføre. Protokollen eksponerede mus til luft eller røg i 24 uger. Ved udgangen af ​​røgen eksponeringer er den protokol lungefunktion i musene, og lunger oppustet til et fast tryk, fast, og fjernes på samme dag. Der kræves yderligere tid til forskeren at indlejre, klippe, og plette de lungesnit (2-3 dage), og opsamling og analysere billederne (2-4 dage afhængig af antallet af dyr, der undersøges). Denne protokol kan også anvendes til at måle aldersrelateret luftrum udvidelsen i mus.

Alle procedurer, der er beskrevet i denne protokol er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Brigham and Women 's Hospital / Harvard Medical School.

1. hele kroppen Cigarette Smoke Eksponering

1. Expose mus at ryge i en røg eksponering enhed hele kroppen (se figur 1) er installeret i et stinkskab.
   BEMÆRK: Enheden indlæser automatisk forsknings cigaretter ind i hjulet, lflyvninger cigaretterne, og indsamler sidestrømsrøg i sidestrømsrøg opsamlingskammer, og skubber cigaretterne. Maskinen kombinerer sidestrømsrøg med mainstream røg ekstraheret fra cigaretten med en pumpe til at skabe en blanding af mainstream og sidestrømsrøg. Ventilator i blanding og fortynding kammer blander røgen med den omgivende luft og driver røgen ind eksponering kamre.
2. Placer bure indeholder musene uden den bur låg fjernet (figur 1) i eksponeringen kammer. Lad mus til at bevæge sig frit omkring i deres bure og har adgang til mad og vand til varigheden af ​​røg eksponering (~ 1,75 h).
3. Placer en spand fyldt med vand under cigaret kammer til at slukke udkastes cigaretter. Kør ethanol (100%) gennem pumpen og tilslut det til enheden. Tænd mikroprocessoren element af indretningen, som initierer automatiseret lastning af cigaretterne, opsvulmen af ​​pumpen, og opvarmning af cigaretten lighTing wire.
4. Enheden belastninger, lys og ryger 10 cigaretter ad gangen, og derefter skubber de anvendte cigaretter og erstatter dem med et nyt parti af 10 cigaretter og gentager denne proces. Hver cyklus tager 9 min.
5. Akklimatisere mus til at ryge ved at udsætte dem for røgen fra 20 cigaretter på den første dag, 40 cigaretter på den anden dag, 60 cigaretter på den tredje dag, 80 cigaretter på den fjerde dag, og 100 cigaretter på den femte dag. Under akklimatisering periode, observere musene omhyggeligt for tegn på nød.
6. Efter 5 dages akklimatisering udsætte musene til 100 cigaretter om dagen, 5 eller 6 dage pr uge i 6 måneder. Der er behov for Dette niveau af røg eksponering at inducere relativt beskeden udvidelse af luftrummet i C57BL / 6-vildtypemus (23,24). Bring kontrolmusene til omgivende rumluft i 6 måneder. Mus før røg akklimatisering vejes og derefter ugentligt at vurdere virkningen af ​​røg eksponering på kropsvægt.
7. Overvåg Partikelholdigtstof (TSPM) i eksponeringen kamre efter de første 60 cigaretter er røget:
   1. Et filtrerpapir afvejes og placere det i en in-line filter holder der er forbundet til en tidsindstillet filter sampler og tør gasmåler. Den tidsindstillede filter sampler trækker luft fra eksponering kammeret gennem filtrerpapir, og gasmåleren foranstaltninger Luftstrømmen under prøveudtagningen.
      BEMÆRK: filter fanger partikler som 20 m ³ ekspositionskammeret luften passerer gennem filteret (målt på den tørre gas meter).
   2. Beregn TPM tæller som ændringen i filteret vægt før og efter prøveudtagning (i mg) pr m ³ luft. Ideel TPM tæller er mellem 150 og 200 mg / m ^3.
8. Efter alle de cigaretter er blevet røget, fjerne bure fra eksponeringskammeret og observere musene for tegn på angst for 20 min.
9. Rengør pumpen med 100% ethanol efter hver brug, og rengør alle porte og stænger i maskinen hver anden uge for at fremmeluftcirkulation og forhindre ophobning af tjære.

2. lungefunktionen Test (PFT) og lunge Inflation

1. Ved afslutningen af ​​de eksponeringer, bedøver hver mus ved at levere en cocktail af ketamin (100 mg / kg), xylazin (10 mg / kg) og acepromazin (3 mg / kg) ad intraperitoneal vej i 200 pi saltvand (USP kvalitet) og bruge veterinære salve på øjnene for at forhindre dem i at tørre ud. Vent indtil dyret er i en kirurgisk plan anæstesi, vurderer hjælp tå-pinch metode.
2. Barber huden forreste til luftrøret, og desinficere region med en jod-opløsning efterfulgt af ethanol. Foretag en mid-line snit gennem huden og subkutant væv anterior til luftrøret hjælp autoklaverede saks, og adskille sternothyroid muskler med en pincet for at blotlægge trachea.
3. Pass en 2-tommers længde silkesutur posterior til luftrøret, lave en tracheotomi på den forreste del af luftrøret med autoklaveret tRacheal saks, indsætte en trachealkanyle (18 g) i tracheotomi, og fastgør det på plads med sutur.
4. Tilslut musen til Y-slangen i adapteren mekanisk ventilator via tracheal kanyle og initiere mekanisk ventilation ved hjælp af et respirationsvolumen på 10 ml / kg og en respirationsfrekvens på 150 vejrtrækninger / min.
   BEMÆRK: Det er vigtigt på dette stadium at sikre, at musen er tilstrækkeligt bedøvet at opnå nøjagtige PFT målinger. Re-dosere mus med anæstetika, hvis dyret ikke er i en kirurgisk plan anæstesi. Den samlede varighed af alle PFT manøvrer er ca. 7,5 min, så er det normalt ikke nødvendigt at gendoser musene med anæstetika, når en kirurgisk plan anæstesi er opnået. Den samlede tid fra induktion af anæstesi til eutanasi er ~ 20 minutter.
5. Pump lungerne til den samlede lungekapacitet (TLC) 3 gange for en mængde historie at måle inspiratorisk kapacitet (IC) og reducere atelektase af lungerne. Dernæst perform det enkelt frekvens tvungen svingning manøvre (Snapshot-150 perturbation) og vurdere den dynamiske modstand (R), elastans (ERS) og overholdelse (CRS) i åndedrætsorganerne, efterfulgt af bredbånd frekvens tvungen svingning manøvre (Quick Prime-3 perturbation ) og måle central luftvejsmodstand (R _n), vævsmodstanden (G), væv elastans (H), og forholdet G / N (). Endelig rekord quasic-statisk overholdelse (C _st) i løbet af volumen-tryk flow manøvrer.
6. Gentag hver af disse manøvrer fem gange (eller udføre yderligere foranstaltninger, indtil konsistente aflæsninger opnås) og puste til TLC tre gange mellem hvert gentagne sæt målinger. Gennemsnitsværdien for hver parameter for hver mus.
7. Fjern musen fra mekanisk ventilator, og aflive den med CO ₂ narkose, efterfulgt af cervikal dislokation [denne dødshjælp metode er godkendt af vores Institutional Animal Care og brug Udvalg]. Skær membranen, opda brystkassen i midterlinjen og fjern de forreste ribben at eksponere lungerne. Dissekere hud og subkutane væv omkring luftrøret og passere en anden 2-inch længde silkesutur posterior til luftrøret.
8. Forbered udstyr til lunge inflation (figur 2):
   1. Fyld en 500 ml konisk Erlenmeyerkolbe ¾ fyldt med sterilt PBS, forsegle det med en gummiprop, vend det, og suspendere den på en ring stativ (sådan at menisken af ​​phosphatpufret saltvand pH 7,4 (PBS) er 25 cm over hjertet af mus).
   2. Sæt den ene ende af en intravenøs give sat ind i PBS i kolben gennem gummiproppen. Indsæt en 6 tommer længde på en plastik serologisk pipette gennem gummiproppen, så åbningen ligger over menisken af ​​PBS til at give luft til at erstatte PBS forlader kolben.
   3. Åbn ventilen på at give sæt og køre PBS om systemet for at skylle luft ud fra give sæt.
9. Tilslut intravenous give sæt til luftrør kanyle, åbne ventilen og tillade PBS til at flyde ind i lungerne ved hjælp af tyngdekraften, indtil lungerne helt puste. Luk ventilen, binde off trachea ved hjælp af kirurgisk sutur distalt for tracheal kanyle og fjerne kanylen.
10. Løft luftrøret med pincet, og skæres i luftrøret proximalt til knuden, og dissekere bindevæv posteriort for luftrøret og lungerne. Fjern forsigtigt lungerne (uden nicking dem), og placer lungerne i et rør indeholdende 10% saltvand-bufferet formalin. Fastgør lungerne O / N ved stuetemperatur, og den næste dag, vaske dem med PBS to gange.
11. Integrer lungerne i paraffin, skåret 5 um tykke snit, og derefter plette afsnittene med Gills plet som skitseret nedenfor.

3. Emfysem

1. Gills farvning af paraffinindlejrede lungesnit
   1. Objektglassene anbringes i en plast rack og inkubere dem ved 70ºC i 20-30 min i en ovn.
   2. De-pariffinize diasved at inkubere dem i 2 min i hver af de fire ændringer xylen.
   3. Rehydrere slides ved at inkubere dem i 2-3 min i hver af to ændringer i 100% ethanol efterfulgt af 2-3 min i hver af to ændringer i 95% ethanol, og derefter vaske de slides to gange i PBS for 2-3 min for hver ændring af opløsning.
   4. Glassene inkuberes i 18-48 timer i en 1: 1 blanding af Gills Hematoxylin og modificeret Harris Hematoxylin.
   5. Vask slides i 2 min i hvert af de fem ændringer i destilleret vand, og dehydrere objektglassene ved inkubering derefter i 2-3 min i hver af to ændringer i 95% ethanol, efterfulgt 2-3 min i hver af 2 ændringer i 100% ethanol.
   6. Fjern objektglassene ved inkubering dem i 2 min i hver af de fire ændringer xylen.
   7. Monter dias med klare montering medier og tilføje et dækglas uden at indføre bobler, som vil hindre efterfølgende analyse.
2. Randomiseret billedoptagelse:
   1. Anskaf sorte og hvide billeder som TIFF-fils ved hjælp af et mikroskop, en 20 X objektiv, og et kamera og software, der kan erhverve høj kvalitet digitale billeder.
   2. Capture ~ 20-30 billeder (X 200 forstørrelse) pr mus i en randomiseret måde, med observatør blindet for den eksperimentelle tilstand, undgå under-oppustede områder af lungen.
   3. Tape en mikro-slide felt-Finder på objektglasset. Feltet Finder har et gitter, der indeholder en række kvadrater, der er mærket med et bogstav (i lodret retning) og et tal (i vandret retning), og hver firkant har et kryds (+) i midten og er identificeret ved et bogstav og nummer (f.eks, A1, A2, ...... Z25).
   4. Brug en Random Field Generator Excel-regneark til at tilfældigt vælge en firkant for billedoptagelse. For at oprette en tilfældig brev, indtaste EFGHJKLMNPQRSTU i celle B1 i regnearket (forskeren kan justere dette brev interval til at dække forskellige firkanter identificeret ved et brev, ligger over lungerne). Dernæst tilføje formlen [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN (1 $ B $)] til celle C1 tilfældigt vælge et bogstav i C1. Kopier og indsæt C1 til C2, C3, C4 et cetera til at generere en kolonne med tilfældige bogstaver.
   5. Hvis du vil oprette et tilfældigt tal i den tilstødende kolonne, skal du skrive formlen = SLUMPMELLEM (5,25) i D1 (hvor 5-25 er det typiske væv på diaset). Eventuelt justere dette interval til at omfatte intervallet af kvadrater identificeres ved et tal, der ligger over lungerne.
   6. Kopier og indsæt D1 i D2, D3, D4 et cetera til at generere en kolonne med tilfældige tal ved siden af ​​det, der indeholder tilfældige bogstaver. Således hver række indeholder et par tilfældigt genererede bogstaver og tal, der svarer til de etiketter på firkanterne på området-Finder (f.eks E17, H24 ....).
   7. Placer dias på mikroskopet. Brug af 4X mikroskopobjektglas finde den tilsvarende firkant i området Finder slide (f.eks E17, H24 ...) og placere denne firkant i midten af mikroskopet området.
   8. Juster midt på mikroskopiskefelt med "+" i midten af ​​det valgte firkant. Fjern feltet finderen, fokus på lungen ved hjælp 20X mikroskop objektiv og hente billedet som en grå-skala TIF fil. Hvis lunge væv dækker <50% af den mikroskopiske område, skal du vælge den næste vilkårligt genereret firkant. Gentag indtil ~ 20-30 billeder indfanges for hvert dyr. Gemme alle billeder for hvert dyr i en enkelt mappe mærket med tag antallet af dyret, for at Excel rapport makro til genkende filerne.

4. morfometri til at måle Emfysem

Protokollen bruger Scion Image og tilpassede makroer til at analysere luftrummet udvidelsen. Scion Image er en Windows-kompatibel version af den originale NIH Image ansøgning, der løber under Macintosh-operativsystemet. Scion Billede kører under Windows XP og er stadig tilgængelige online via Wikiversity.org, hvor en søgning efter 'Scion Image "vil lede brugeren til links tilmanual og beta 4.0.2 frigivelse af Scion Image. Installation og software operation er detaljeret i online supplement manuelle og sammenfattet nedenfor. Den alveolære akkord længde makro blev tilpasset fra makro til rådighed i NIH Image.

1. Forbered TIFF billede af Gills farvede lunge sektion for Scion billedanalyse:
   1. Start Scion Image og indlæse makroer som angivet i online supplement. Vælg Open Lysfelt Image [1] makro til at vælge og åbne billedet TIFF-fil. Dernæst bruge billedet edit redskaber til at forberede billedet til analyse.
   2. Brug malerpenslen værktøj til at tvinge områder af billedet, der ikke er luftrum eller alveolære vægge skal behandles enten som luftrummet eller væv. For eksempel male bronkier og fartøjer sort, så de analyseres som væv. Paint inflammatoriske celler (eller støv) besætter plads i alveolerne hvide til at de analyseres som luftrummet.
   3. Vælg pensel farve ved at klikke musemarkøren påord sort eller hvid i bunden af LUT vinduet. Klik derefter Penselværktøjet. For at ændre pensel størrelse, dobbeltklik på penselværktøjet og indtaste en passende pensel størrelse. Klik og træk musen over billedet for at male strukturer den valgte farve (se # 1 ovenfor).
2. Måling gennemsnitlige akkord længde af luftrummet
   1. Vælg den makro kordelængden Air [2] for at måle luftrummet akkord længder.
   2. Threshold billedet ved først at klikke med musen nær midten af ​​billedet og træk musen op eller ned for at justere tærskelværdien (et tal mellem 0 og 255, som er vist i vinduet Info). Klik med musen igen for at acceptere tærskelværdien. Juster tærskel for at gøre de alveolære vægge samme tykkelse som i de oprindelige billeder.
      BEMÆRK: Det er afgørende, at forskeren ikke under-tærskel og dermed skabe pauser i de alveolære vægge, som ikke findes i det oprindelige billede, som vil producerekunstigt længde værdier høj akkord.
   3. Programmet fjerner automatisk enkelt pixel (enkelt sort pixel omgivet af 8 hvide pixels).
   4. em> 4.2.4. Overhold et vindue, som beder brugeren om at re-tærsklen det binære billede, fortsætter makroen, eller annullere makroen. Til tærskel igen Svar J til prompt og vælg knappen OK.
   5. em> 4.2.5. Visualiser en vandret og lodret gitter vindue med linjer 5 pixels fra hinanden skabt af makroer. Programmet måler længderne af vandrette og lodrette linjer, der overlapper luftrum.
   6. Gem filen i en mappe, men ikke ændre standard navnet ellers Excel Rapport makroer vil ikke finde filen (formatet er navnet på det billede vedhæftet med "CLa.txt" for luftrummet akkord længde.
      BEMÆRK: Hvis programmet ikke foretage målinger, kan tærskelværdien være for lav (skal være> 1). Hvis det sker, de re-tærskler forsker billedet ved hjælp af en højere værdi.
   7. em> 4.2.7. For alveolære arealmålinger (udover kordelængder) køre yderligere [4] og [5] makroer samt.
   8. em> 4.2.8. Fortsæt, indtil alle billederne er blevet analyseret.
3. Analysere resultaterne ved hjælp af Excel Rapport makroer
   1. Åbn Excel Report 20x.xls. Manuelt makroer om nødvendigt afhængigt af Standardsikkerhedsindstillingen i Excel-version, der anvendes.
   2. Overhold en liste over makroer i Makro-vinduet (se tabel 1).
      BEMÆRK: CL_Air_1 rapporterer akkord længde luftrum for et enkelt dyr (mappe). CL_Air_Multi rapporterer akkord længde af luftrum til flere dyr (mapper). AP_No_Edge_1 rapporterer området af alveolerne uden kant kontakter til en enkelt (mappe) dyr .AP_No_Edge_Multi rapporterer område af alveolerne uden kant kontakter til flere dyr (mapper). AP_With_Edge_1 rapporterer område alveoler med kant kontakter til et enkelt dyr (mappe). AP_With_Edge_Multi rapporterer område alveoler med kant Contacts for flere mapper.
   3. Vælg den CL_Air_Multi makroen til at rapportere alveolære akkord længde målinger for flere mapper, der svarer til billeder fra flere mus. Programmet rapporterer alle _CLa.txt filer i de valgte mapper. Udelad et _CLa.txt fil (efter behov) ved at flytte den til en undermappe i den aktuelle mappe eller omdøbe _CLa del.
   4. Fra fil skal du vælge en mappe ad gangen ved at fremhæve mappen og derefter vælge OK (programmet ikke understøtter flere valg på én gang). Da hver mappe er valgt, observere det i regnearket. Vælg "Annuller" eller lukker filen vinduet for at fortsætte.
      BEMÆRK: Afhængigt af den version af Excel, kan forskeren nødt til at navigere tilbage en mappe niveau efter hver mappe er valgt.
   5. Overhold en særskilt regneark for hver mappe, der viser statistikker for hver _CLa.txt fil efterfulgt af statistik for kordelængden data kombineret fra alle _CLa.txt filer.
   6. Omdøb og gem regnearket. Standard filnavn er navnet på den overordnede mappe tilføjes med _CLa.xls. Luk regnearket, før du vælger en anden makro.

5. Små Airway Remodeling

1. Farvning og billedoptagelse
   1. Farv lung sektioner med Massons trichrom pletten med et kommercielt kit, og følge fabrikantens anvisninger.
   2. Tage billeder af alle luftvejene i begge lunger, der kan rummes fuldstændigt (herunder blå lag uden luftvejene, som er laget af ECM-proteiner, der er deponeret) i et billede område ved hjælp 20X objektiv på mikroskopet.
      BEMÆRK: Større luftveje er ikke forbundet med øget aflejring af ECM-proteiner i CS-eksponerede mus.
   3. Gem farvebilleder som JPEG-filer.
2. Billedanalyse: Åbn billedfileni billedet analyse software program.
   1. Åbn og navngive logfilen til at registrere målinger.
   2. Vælg en stregtegning værktøj. Tegn 4 linier krydser lumen af ​​luftvejene (indre diameter) for at måle størrelsen af ​​luftvejen og kun omfatte de luftvejene med den ønskede størrelse i analysen. Dernæst trækker 12 jævnt fordelte linjer (ved positionen i luftvejene, der svarer til antallet af et ur), der strækker sig fra kanten af ​​den adventitiale lag ligger an luftvejene ud til kanten af ​​den blåfarvede region omgivet luftvejene at måle tykkelsen af laget af ECM-proteiner deponeret uden luftvejene (figur 5). Undgå at måle områder, hvor luftvejene interagerer med andre luftveje eller fartøjer.
   3. Første record alle linjerne indre diameter i logfilen, og derefter registrere de 12 linjer, der måler tykkelsen af ​​det blå ECM lag omkring luftvejene.
   4. Luk billedet derefter åbne det næste billede.
   <li> Gentag disse trin, indtil alle billeder for dyret er blevet logget ind i en mappe.
   5. Begynd med trin 5.2 for den næste mappe der indeholder billeder taget på lungesnit fra næste dyr. Afslut programmet efter endt analyse af alle af luftvejene i lungerne sektioner fra alle dyrene i forsøget.
   6. Indtast de 4 interne målinger diameter og 12 ECM protein lagtykkelse målinger er konstateret for hver luftvej for hver mus i data logfiler i et Excel-regneark. Gennemsnit lagtykkelsen målinger diameter og ECM protein for hvert dyr.
   7. Konverter målingerne fra pixels til mikrometer.
   8. Gruppe luftvejene efter deres størrelse indvendig diameter (f.eks., 300-399 um, 400-499 um etc.) og sammenligne ECM protein lag tykkelsesmålinger omkring luftvejene med lignende størrelser for luft- versus røg-eksponerede mus (f.eks., luftveje med en diameter på 300-899 um;
   9. Hvis det er nødvendigt, IMMUNOFARVNING lungesnit for de enkelte proteiner (herunder interstitielle collagener og basalmembran protein) og en tilsvarende analyse for at kvantificere aflejring af proteiner af interesse ved hjælp af denne metode.

Representative Results

Denne protokol begynder med hele kroppen eksponering af mus for CS. Tilstrækkeligt tilsyn og vedligeholdelse af udstyret og overvågning af TPM tæller sikre ensartede røg eksponering (figur 1). Det er vigtigt, at forskeren praktiserer lungen inflation teknik ved hjælp af inflation enheden

Denne protokol begynder med hele kroppen eksponering af mus for CS. Tilstrækkeligt tilsyn og vedligeholdelse af udstyret og overvågning af TPM tæller sikre ensartede røg eksponering (figur 1). Det er vigtigt, at den praksis, forsker lungen inflation, hvor der anvendes anordning inflationen (figur 2) og forsigtigt fjerner lungen efter inflationen for at opnå godt oppustede lungesnit til nøjagtig analyse af luftrummet udvidelsen. Figur 3A viser et godt oppustet lunge henviser Figur 3B viser en dårligt oppustet lunge. Figur 3C viser et billede af en oppustet lunge sektion forberedt til tærskelværdier sTEP (makrofager i alveolære rum er malet hvid og fartøjer og bronkier er malet sort for at generere. The tærskelværdier trin skaber et binært billede, hvor alle pixels i det alveolære rum er hvide, og alle pixel i områder af lungen, som ikke er alveolerne er sort (figur 3D). Figur 3E og 3F viser den vertikale og horisontale alveolær kordelængder at makroer generere henholdsvis.

Lungefunktionen test viser beskedne (og ikke statistisk signifikante) venstre skift i volumen tryk (PV) sløjfer afspejler beskedne tab af elastisk rekyl af lungen i overensstemmelse med den milde emfysem der udvikler sig i C57BL / 6 vægt mus udsat for CS i 6 måneder ( figur 4A). Væsentlige venstre forskydninger i PV loops er kun observeret i murine stammer, som er meget følsom over for virkningerne af CS eller CS-eksponerede gen-målrettede mus med en mere alvorlig emfysem fænotype end CS-eksponerede C57BL / 6 WT mus.

Figure 5 viser repræsentative billeder Masson Trichrome-farvede lung sektioner af C57BL / 6 WT mus udsat for luft (figur 5A) eller CS (figur 5B) i 6 måneder illustrerer stigninger i ECM protein deposition omkring små luftveje i CS-eksponerede dyr. Figur 5C illustrerer, hvordan et billede analyse software program kvantificerer ECM protein deposition omkring luftvejene med den ønskede indre diameter. Figur 5D viser analysen af ECM protein deposition omkring luftveje med en diameter på 300 til 899 um i CS-eksponerede C57BL / 6 WT mus.

Figur 1. En tegneserie af hele kroppen cigaret eksponering system. En røg eksponering enhed er sluttet til en røg eksponering kammer. Røg trækkes fra side-stream opsamlingskammer og røg trækkes fracigaretterne ved hjælp af pumpen, og begge røg prøver blandes og fortyndes med den omgivende luft i blanding og fortynding kammer (til venstre), og derefter røg strømmer ind eksponering kammeret. Forskeren placerer mus i deres bure i eksponeringskammeret (til højre); mus er i stand til at bevæge sig frit i deres bure og har adgang til foder og vand til varigheden af ​​udsættelse for tobaksrøg.

Figur 2. Inflationen af murine lunger. Forskeren fylder en kolbe med sterilt PBS, sæler det med en gummiprop, og inverterer det og sikrer det en afstand på 25 cm over hjertet af dyret ved hjælp af en ring stativ. En intravenøs give sæt leverer PBS til lungerne via den tracheale kanyle. En cut-down serologisk pipette indsættes gennem gummiproppen og det giver luft i kolben for at erstatte volumen PBS, at afløb i luNGS af musene af tyngdekraften.

Figur 3. emfysem analyse. (A) viser et repræsentativt billede af Gill's-plet oppustet lungesnit fra mus udsat for luft eller CS i 6 måneder, de sorte pile angiver en beholder og alveolære makrofager. (B) viser et repræsentativt billede af en under-oppustet lunge, der ikke er egnet til analyse. (A) viser den "før" og (C) viser "efter" billede af en repræsentativ lunge sektion at forskeren forbereder til generering af et binært billede. De sorte pile i (A) og (C) indikerer enten en beholder (som forskeren maling sort i (C)) eller alveolære makrofager (som forskeren maling hvid (C)). (D) < / Strong> viser det binære billede efter forskeren udfører tærsklen trin. (E) og (F) viser den horisontale og vertikale alveolær kordelængder at forskeren genererer henholdsvis. Forstørrelse af billeder er x 200. Scale bar repræsenterer 400 um er vist i (A).

Figur 4. Alveolær kordelængde og tryk-volumen-kurver. (A) viser en typisk analyse af alveolære kordelængder i C57BL / 6 vægt- mus udsat for luft (n = 13) eller CS (n = 24) i 6 måneder. Stjernen angiver p <0,001. (B) viser typiske PV loops udføres på C57BL / 6 vægt- mus udsat for luft (n = 13) eller CS (n = 14) i 6 måneder. Data er udtrykt som middelværdi + SEM.

highres.jpg "/>
Figur 5. Små luftveje remodeling (SAR) vurdering. (A) og (B) viser repræsentative billeder af Massons Trichrome-farvede lungesnit fra C57BL / 6 WT mus udsat for luft (A) eller CS (B) i 6 måneder. (C) viser, hvordan billedet analyse software analyserer SAR i CS-eksponerede mus. (D) viser typiske målinger af tykkelsen af det ekstracellulære matrixprotein aflejret omkring små luftveje med en diameter på 300 til 899 m i C57BL / 6 WT mus udsat for luft (n = 11) eller CS (n = 16) i 6 måneder. Data er udtrykt som middelværdi + SEM og asterisk angiver p <0,05.

Scale barer er vist på billederne i hver lunge sektion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032