Automatisert Måling av lungeemfysem og Small Airway Ombygging i sigarettrøyk utsatte Mus

Introduction

Bruk av dyremodeller for å studere KOLS er utfordrende fordi ingen modell kan perfekt replikere alle funksjonene i menneskelig sykdom ^(2). De fleste etterforskere bruke mus for å modellere kols på grunn av likhetene mellom mus og mennesker i deres lungefysiologi, patologi, genetikk og metabolitter. Også, mus er relativt billig å studere, og både emfysem og liten luftveis ombygging utvikle innen 6 måneder CS eksponering ^(5,7-9).

Sigarettrøyk utløst KOLS: Flere metoder kan indusere KOLS hos mus. De fleste forskere utsette mus til CS, som er den viktigste etiologiske faktor for menneskelig KOLS. CS eksponering i 6 måneder forårsaker utvikling av emfysem og små luftveier remodellering (SAR) i mus, men alvorlighetsgraden av sykdommen som blir indusert, varierer avhengig av den murine stamme undersøkt. For eksempel NZWLacZ mus er resistente mot utvikling av CS-indusert emfysem mens AKR / J-mus er extremely sensitive ^(10). De fleste etterforskere studere C57BL / 6 belastningsskader mus i CS eksponeringsmodell som mange gen-målrettet mus er tilgjengelige i denne belastningen. Etter seks måneder med CS eksponering, emfysem og liten luftveis fibrose utvikle seg i villtype (WT) C57BL / 6 mus, og begge lesjoner er relativt mild alvorlighetsgrad ^(5,10). Forskere bruker to typer CS eksponering: nese-bare og hele kroppen eksponeringer. De største ulempene med nesen-bare eksponeringsteknikken er at: 1) det er en mer arbeidskrevende metode; og 2) mus har til å holdes igjen i små kamre som kan indusere en stressrespons og hypertermi hos dyr ^(11). Den store ulempen med hele kroppen eksponering (beskrevet her) er at dyrene kan innta (samt innhalere) nikotin og tjære produkter når de rengjør pelsen. Mus eksponert for helkropps CS har også lavere karboksyhemoglobinnivået og redusert tap av kroppsvekt sammenlignet med dyr eksponert for nese-bare CS ^(12).

lungefunksjonstest (PFTs): Målinger av lunge compliance og elastance er vanligvis lik i C57BL / 6 villtype (WT) mus eksponert for luft eller CS for seks måneder på grunn av den relativt mild emfysem som oppstår når dette stammen er eksponert for CS ^(10). Imidlertid, når emphysematous ødeleggelse er mer alvorlig, økning i lungesamsvar og venstre skift i trykk-volum (PV) strømningssløyfer kan detekteres. Sistnevnte kan observeres, for eksempel i murine stammer som er mer utsatt for virkningene av CS ^(10), i CS-eksponerte C57BL / 6 strekk gen-rettet mus som har en mer alvorlig emfysem type enn C57BL / 6 WT mus ^(13), eller i CS-eksponerte mus utsatt for miljømessige endringer som gjør dem mer utsatt for virkningene av CS ^(14). Denne protokollen bruker et lite dyr ventilator å måle reduksjoner i elastisk rekyl av lunge (økninger i kvasistatisk lunge compliance [Cst] og reduksjoner i vevelastance [H]), PV flyt looper, og endringer i luftveiene og vev motstand i bedøvede mus ^(15,16).

Tiltak av lungeemfysem: Analyse av emfysem utvikling i CS-eksponert C56BL / 6 belastning mus er utfordrende fordi fordelingen er romlig heterogene. Flere ulike metoder kvantifisere luftrom forstørrelse hos mus. Den første metode som ble brukt var den midlere lineære skjæringspunktet (L _m) ^(17). Imidlertid er _L-m-metoden en langsom, manuell prosess som ikke kan fange heterogenitet av sykdommen (hvis ikke alle deler av lungen er tilfeldig samplet) og dens bruk kan derfor innføre observatør skjevhet i analysen. Den destruktive indeksen [DI, ^(18)] kvantifiserer også luftrom utvidelse ved hjelp av et gjennomsiktig ark med 50 likt fordelte punkter plassert over en trykt digitalisert bilde av en hematoxylin og eosin-farget lungeseksjonen. De PI-metoden score Området rundt hvert punkt achold til i hvilken grad de alveolære kanaler og alveolære vegger innenfor dette området er ødelagt. Den største ulempen med DI-metoden er at den er tidkrevende og ikke mer nøyaktig enn andre metoder ^(19,20).

Denne protokollen tiltak medfører alveolar akkord lengde og alveolene på parafininnstøpte lunge seksjoner farget med Gills flekken. Morfometri programvare konverterer bilder av lunge deler til binære bilder (der vev er hvit og luftrom er svart), og deretter superimposes en ensartet rutenett av horisontale og vertikale linjer (akkorder) og programvaren deretter kvantifiserer lengden på hver akkord innenfor områder identifisert av programvare som luftrom. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, er det mulig å måle størrelsen av alveolene i alle deler av lungen i et standardisert og relativt automatisert måte ^(21).

Liten luftveis ombygging (SAR): Økt deponering av ECM proteiner (spesielt interstitial kollagen) rundt små luftveiene oppstår i CS-eksponerte dyr og bidrar til luftveisobstruksjon. Forskere ikke studere SAR i dyremodeller av KOLS så ofte som emfysem utvikling ^(22). For å kvantifisere SAR i CS-eksponerte mus, bruker denne protokoll programvare for bildeanalyse for å måle tykkelsen av laget av ECM-proteiner som er deponert rundt de små luftveier (luftveier med en midlere diameter mellom 300 og 899 m) i parafininnstøpte lungeseksjoner farget med Masson er Trichrome flekken.

Protocol

Protokollen tar ~ 25 uker å fullføre. Protokollen utsettes mus for luft eller røk i 24 uker. Ved slutten av røken eksponeringer blir protokoll tiltak pulmonal funksjon i mus, og lunger blåses opp til et fast trykk, løst, og fjernes på samme dag. Ekstra tid er nødvendig for forskeren å legge inn, klippe, og flekken lunge seksjoner (2-3 dager), og fangst og analysere bildene (2-4 dager avhengig av antall dyr studert). Denne protokollen kan også brukes til å måle aldersrelatert luftrom utvidelse i mus.

Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Brigham and Women Hospital / Harvard Medical School.

1. Whole-Body sigarettrøyk Eksponering

1. Expose mus å røyke i en hel-kropp røyk eksponering enhet (se figur 1) som er installert i en avtrekkshette.
   MERK: Enheten laster automatisk forsknings sigaretter inn i hjulet, lights sigaretter, og samler side-stream røyk i side-stream røyk samling kammer, og mater ut sigarettene. Maskinen kombinerer sidestrøm røyk med hovedstrømmen av røyk utvunnet fra sigaretten ved en pumpe for å lage en blanding av hovedstrømmen og sidestrømmen røyk. Viften i blande og fortynne kammer blander røyken med luften og driver røyken inn eksponerings kamre.
2. Plasser merder med musene uten buret lokkene fjernet (figur 1) i eksponeringskammeret. La mus til å bevege seg fritt rundt i burene, og har tilgang til mat og vann for varigheten av eksponering til tobakksrøyk (~ 1,75 timer).
3. Plasser en bøtte fylt med vann under sigarett kammeret å slukke slynges ut sigaretter. Kjør etanol (100%) gjennom pumpen og koble den til enheten. Slå på mikroprosessoren element av anordningen, som initierer automatisk lasting av sigaretter, puffing av pumpen, og oppvarming av sigaretten lighting wire.
4. Apparatet laster, lys og røyker 10 sigaretter om gangen og kjører deretter ut de brukte sigaretter og erstatter dem med en ny gruppe med 10 sigaretter og gjentar denne prosessen. Hver syklus tar 9 min.
5. Akklimatisere mus å røyke ved å utsette dem for røyken fra 20 sigaretter på den første dagen, 40 sigaretter på den andre dagen, 60 sigaretter på den tredje dag, 80 sigaretter på den fjerde dagen, og 100 sigaretter på den femte dagen. I løpet av akklimatiseringsperiode, observere musene nøye for tegn på stress.
6. Etter fem dager med akklimatisering, utsette musene til 100 sigaretter per dag, fem eller seks dager per uke i 6 måneder. Dette nivået av røyk eksponering er nødvendig for å indusere relativt beskjedne luftrom utvidelse i C57BL / 6 villtype mus (23,24). Utsette kontroll mus til omgivelses romluft i 6 måneder. Veie mus før røyk akklimatisering og deretter ukentlig for å vurdere effekten av røyk eksponering på kroppsvekt.
7. Overvåke den totale suspendert partikulærtmaterie (TSPM) i eksponeringskamrene etter de første 60 sigaretter har blitt røykt:
   1. Veie et filter papir og plassere den i en in-line filter holder som er koblet til en tidsbestemt filter sampler og tørrgass meter. Den tidsbestemte filter sampler trekker luft fra eksponeringskammeret gjennom filterpapiret og tiltakene gass måler luftstrømmen under prøvetaking.
      MERK: Filteret fanger partikler som 20 m ³ av eksponering kammer luft passerer gjennom filteret (målt på tørr gass meter).
   2. Beregn TPM teller som endringen i filtervekt før og etter prøvetaking (i mg) per ^m3 luft. Ideelle TPM teller er mellom 150 og 200 mg / m ^3.
8. Etter at alle sigaretter har blitt røykt, fjerne burene fra eksponeringskammeret og observere mus for tegn på stress for 20 min.
9. Rengjør pumpen med 100% etanol etter hver bruk, og rengjør alle porter og stenger i maskinen bi-ukentlig for å fremmeluftsirkulasjon og hindre oppbygging av tjære.

2. lungefunksjonstest (PFTS) Og Lung Inflasjon

1. På slutten av eksponeringen, bedøve hver mus ved å levere en blanding av ketamin (100 mg / kg), xylazin (10 mg / kg) og acepromazin (3 mg / kg) ved den intraperitoneale rute på 200 pl saltløsning (USP klasse) og bruke veterinær salve på øynene for å hindre dem fra å tørke ut. Vente til dyret er i en kirurgisk planet av anestesi, vurderer hjelp av tå-klemme-metoden.
2. Barbere huden anterior til luftrøret, og desinfisere regionen med en jod-inneholdende løsning, etterfulgt av etanol. Lag en midtlinjeoppskjæring gjennom hud og underhud anterior til luftrøret ved hjelp autoklaveres saks, og skille sternothyroid muskler med pinsett for å avsløre luftrøret.
3. Passere en 2-tommers lengde av silkesutur posterior til luftrøret, få en trakeotomi på den fremre del av luftrøret med Autoclaved tracheal saks, sette inn en trakealkanyle (18 G) i trakeotomi, og fest den på plass med sutur.
4. Koble musen til Y-rør av adapteren på den mekanisk ventilator via trakeal kanyle, og initiere mekanisk ventilasjon ved hjelp av en tidevolum på 10 ml / kg og en åndedrettshastighet på 150 åndedrag / min.
   MERK: Det er viktig på dette stadiet å sikre at musen er tilstrekkelig bedøvet for å oppnå nøyaktige PFT målinger. Re-dosere mus med anestetika hvis dyret ikke er i en kirurgisk planet av anestesi. Den totale varighet av alle de manøvrer PFT er omtrent 7,5 min, så er det vanligvis ikke nødvendig å Redose musene med bedøvelsesmidler når en kirurgisk planet anestesi har blitt oppnådd. Den totale tid fra induksjon av anestesi til eutanasi er ~ 20 minutter.
5. Blåse lungene til total lungekapasitet (TLC) 3 ganger for et volum historie å måle inspirasjons kapasitet (IC) og redusere atelektase av lungene. Neste, utføm det enkelt frekvens tvunget oscillasjon manøver (Stillbilde-150 forstyrrelse) og vurdere dynamisk motstand (R), elastance (Ers) og compliance (Crs) i luftveiene, etterfulgt av bredbånd frekvens tvunget oscillasjon manøver (Quick Prime-3 perturbation ) og måle sentrale luftveismotstand (R _n), vevsmotstanden (G), vev elastance (H), og forholdet G / N (). Endelig rekord quasic statisk compliance (C _st) i løpet av volum trykk strømnings manøvrer.
6. Gjenta hver av disse manøvrene fem ganger (eller utføre ytterligere tiltak inntil konsistente målinger oppnås) og fyll det med TLC tre ganger mellom hvert gjentatt sett av målinger. Spill gjennomsnittsverdien for hver parameter for hver mus.
7. Fjern musen fra mekanisk ventilator, og avlive den med CO ₂ narkose etterfulgt av halsdislokasjon [denne dødshjelp metoden er godkjent av vår Institutional Animal Care og bruk komité]. Kutt mellomgulvet, opno thorax i midtlinjen, og fjerne de fremre ribbeina å utsette lungene. Dissekere hud og underhud rundt luftrøret og bestå en ny 2-tommers lengde på silke sutur posterior til luftrøret.
8. Klargjør utstyr for lunge inflasjon (figur 2):
   1. Fyll en 500 ml konisk Erlenmeyerkolbe ¾ med sterilt PBS, forsegle den med en gummipropp, snu den og suspendere den på et ringstativ (slik at menisken i fosfatbuffret saltvann pH 7,4 (PBS) er 25 cm over midt i mus).
   2. Sett den ene enden av en intravenøs gi satt inn i PBS i kolben gjennom gummiproppen. Sett en 6 tommers lengde av en plast serologisk pipette gjennom gummiproppen, slik at dens åpning ligger over menisken til PBS for å tillate luft å erstatte PBS forlater kolben.
   3. Åpne ventilen for å gi apparatet og drives PBS om systemet for å spyle ut luften fra å gi settet.
9. Koble intravenous gi set til trakealkanyle, åpne ventilen og tillate PBS for å strømme inn i lungene ved hjelp av gravitasjon til lungene blåses helt opp. Lukke ventilen, feste luftrøret ved hjelp av kirurgisk sutur distalt for trakealkanyle, og fjern kanylen.
10. Løft luftrøret med pinsett, og kutte luftrøret proksimale til knuten, og dissekere bindevevet posterior til luftrøret og lungene. Fjern forsiktig lungene (uten nicking dem), og plassere lungene i et rør som inneholder 10% saltvann-bufret formalin. Fikse lungene O / N ved RT, og neste dag, vaske dem med PBS to ganger.
11. Embed lungene i parafin, skåret fem mikrometer tykke seksjoner, og deretter flekken seksjoner med Gills flekken som beskrevet nedenfor.

3. Emfysem

1. Gills farging av parafin-embedded lunge seksjoner
   1. Plasser lysbilder i en plastbeholder og ruge dem ved 70ºC for 20-30 min i en ovn.
   2. De-pariffinize lysbildeneved å inkubere dem i 2 minutter i hvert av de fire med xylen.
   3. Rehydrere lysbildene ved å inkubere dem i 2-3 min i hver av to endringer av 100% etanol, etterfulgt av 2-3 min i hver av to endringer av 95% etanol, og deretter vaske objektglassene to ganger i PBS i 2-3 min for hver forandring av oppløsningen.
   4. Inkuber lysbilder for 18-48 timer i en 1: 1 blanding av Gills Hematoxylin og modifisert Harris Hematoxylin.
   5. Vask objektglass i 2 min i hver av fem forandringer av destillert vann, og dehydratisere de glir deretter ved inkubering i 2-3 min i hver av to endringer av 95% etanol, etterfulgt 2-3 minutter i hver av to endringer av 100% etanol.
   6. Tømme lysbildene ved å inkubere dem i 2 min i hver av fire endringer xylen.
   7. Montere lysbildene med klare monterings media og legge et dekkglass uten å innføre bobler, noe som vil hindre påfølgende analyse.
2. Randomisert image oppkjøpet:
   1. Erverve svart-hvitt bilder som TIFF-fils ved hjelp av et mikroskop, et 20 x objektiv og kamera og programvare som kan skaffe høy kvalitet digitale bilder.
   2. Capture ~ 20-30 bilder (X 200 forstørrelse) per mus i en randomisert måte, med observatøren blindet for den eksperimentelle tilstand, unngå under-oppblåst områder av lungen.
   3. Tape en mikro-lysbilde-feltet-finder på lysbildet. Feltet finder har et gitter som inneholder en serie av kvadrater som er merket med en bokstav (i vertikal retning) og et antall (i horisontal retning), og hver firkant har et kryss (+) i sentrum og er identifisert ved en bokstav og nummer (f.eks, A1, A2, ...... Z25).
   4. Bruk en Random Feltet Generator Excel regneark for å velge tilfeldig en firkant for bildeopptak. Å skape et tilfeldig brev, skriv EFGHJKLMNPQRSTU i celle B1 i regnearket (forskeren kan justere dette brevet utvalg for å dekke området av kvadrater identifisert av et brev som ligger over lungene). Deretter legger formelen [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN ($ B $ 1)] til celle C1 å tilfeldig velge en bokstav i C1. Kopier og lim C1 til C2, C3, C4 et cetera å generere en kolonne med tilfeldige bokstaver.
   5. Å skape et tilfeldig tall i den tilstøtende kolonnen skriver du inn formelen = TILFELDIGMELLOM (5,25) i D1 (hvor 5-25 er den typiske spekter av vev på lysbildet). Eventuelt justere dette området for å dekke området av kvadrater identifisert av et tall som ligger over lungene.
   6. Kopier og lim D1 til D2, D3, D4 et cetera å generere en kolonne med tilfeldige tall ved siden av den som inneholder tilfeldige bokstaver. Dermed inneholder hver rad et par tilfeldig genererte bokstaver og tall som tilsvarer etikettene på rutene i felt-finder (f.eks E17, H24 ....).
   7. Plasser lysbildet på mikroskopet. Bruke 4X mikroskop objektiv finne tilsvarende torget i feltet finder lysbilde (f.eks E17, H24 ...) og plasser denne torg i sentrum av mikroskopet feltet.
   8. Rett midten av mikroskopiskefelt med "+" i sentrum av den valgte ruten. Fjern feltet finder, fokus på lunge med 20X mikroskop objektiv og hente bildet som en grå-skala TIF-fil. Hvis lunge vev deksler <50% av den mikroskopiske feltet, velge neste tilfeldig generert torget. Gjenta til ~ 20-30 bildene er tatt for hvert dyr. Lagre alle bilder for hvert dyr i en enkelt mappe merket med tag antall dyret for at Excel Rapporter makro å gjenkjenne filene.

4. morfometri To Measure Emfysem

Protokollen bruker Scion Bilde og tilpassede makroer for å analysere luftrommet utvidelse. Scion Bildet er en Windows-kompatibel versjon av den opprinnelige NIH Image program som kjører under Macintosh-operativsystemet. Scion Bilde kjører under Windows XP og er fremdeles tilgjengelig online gjennom Wikiversity.org, hvor et søk etter 'Scion Bilde' vil sende brukeren til koblinger tilmanuell og beta 4.0.2 utgivelsen av Scion bilde. Installasjon og programvare drift er beskrevet i den elektroniske supplement manuell og oppsummert nedenfor. Alveolar kordelengde makro ble tilpasset fra makro tilgjengelig i NIH Image.

1. Forberede TIFF bildet av Gills farget lungeseksjonen for Scion bildeanalyse:
   1. Starte Scion Bilde og laste makroene som angitt i den elektroniske supplement. Velg Åpne Lysfelt Image [1] makro for å velge og åpne bildet TIFF-fil. Deretter bruker du bilde redigeringsverktøy for å forberede bildet for analyse.
   2. Bruk penselen verktøy for å tvinge områder av bildet som ikke luftrom eller alveolære vegger som skal behandles enten som luftrom eller som vev. For eksempel male bronkier og fartøy svart slik at de blir analysert som vev. Male betennelsesceller (eller støv) opptar plass i alveolene hvit til at de blir analysert som luftrom.
   3. Velg pensel farge ved å klikke musepekeren påord svart eller hvit i bunnen av LUT vinduet. Deretter klikker du på penselverktøyet. For å endre pensel størrelse, dobbeltklikk på penselverktøyet og angi en riktig pensel størrelse. Klikk og dra musen over bildet for å male strukturer den valgte farge (se # 1 ovenfor).
2. Måle gjennomsnittlig akkord lengde av luftrommet
   1. Velg makro Chord Lengde Air [2] til å måle luftrommet akkord lengder.
   2. Terskel bildet ved først klikke musen nær sentrum av bildet deretter dra musen opp eller ned for å justere grenseverdien (et tall mellom 0 og 255, som er vist i Info-vinduet). Klikk med musen en gang til for å godta terskelverdien. Juster terskel til å gjøre de alveolære vegger samme tykkelse som i de opprinnelige bilder.
      MERK: Det er avgjørende at forskeren ikke under-terskel og dermed skape brudd i alveolar veggene som ikke finnes i det opprinnelige bildet som skal produserekunstig høy akkord lengdeverdier.
   3. Programmet fjerner automatisk enkelte piksler (single svarte piksler omgitt av åtte hvite piksler).
   4. em> 4.2.4. Observere et vindu som ber brukeren om å re-terskel det binære bildet, fortsetter makroen, eller avbryte makro. Til terskel igjen, svarer Y på spørsmålet og velg OK.
   5. em> 4.2.5. Visualisere en horisontal og vertikal rutenett vindu med linjene 5 piksler hverandre skapt av makroer. Programmet måler lengden av horisontale og vertikale linjer som overlapper luftrom.
   6. Lagre filen i en mappe, men ikke endre standardnavnet ellers Excel Rapporter makroer vil ikke finne filen (formatet er navnet på bildet lagt med "CLa.txt" for luftrom akkord lengde.
      MERK: Hvis programmet ikke gjør målinger, kan terskelverdien være for lav (må være> 1). Hvis dette skjer, forskeren re-terskler bildet ved hjelp av en høyere verdi.
   7. em> 4.2.7. For alveolære målinger i området (i tillegg til akkord lengder), kjører den ekstra [4] og [5] makroer også.
   8. em> 4.2.8. Fortsett til alle bildene har blitt analysert.
3. Analysere resultatene ved hjelp av Excel Rapporter makroer
   1. Åpne Excel Rapporter 20x.xls. Manuelt aktivere makroer om nødvendig, avhengig av standard sikkerhetsinnstillingen i Excel-versjon som brukes.
   2. Observere en liste over makroer i Macro vinduet (se tabell 1).
      MERK: CL_Air_1 rapporterer akkord lengden på luftrom for en enkelt dyr (mappe). CL_Air_Multi rapporterer akkord lengden på luftrom for flere dyr (mapper). AP_No_Edge_1 rapporterer området av alveolene uten kontakter edge for en enkelt dyr (mappe) .AP_No_Edge_Multi rapporterer område av alveolene uten kontakter edge for flere dyr (mapper). AP_With_Edge_1 rapporterer område av alveolene med kontakter edge for en enkelt dyr (mappe). AP_With_Edge_Multi rapporterer område av alveolene med kant contacts for flere mapper.
   3. Velg CL_Air_Multi makro for å rapportere alveolære målinger akkord lengde for flere mapper som tilsvarer bilder fra flere mus. Programmet rapporterer alle _CLa.txt filene i de valgte mappene. Utelate en _CLa.txt fil (etter behov) ved å flytte den til en undermappe av gjeldende mappe eller navneendring av _CLa del.
   4. Fra fil vinduet, velger du en mappe på en gang ved å markere mappen og deretter velge OK (programmet støtter ikke flere valg på en gang). Som hver mappe er valgt, observere det i regnearket. Velg "Avbryt" eller lukke filen vinduet for å fortsette.
      MERK: Avhengig av hvilken versjon av Excel, kan forskeren må navigere tilbake ett mappenivå etter hver mappe er valgt.
   5. Observere et eget regneark for hver mappe, viser statistikk for hver _CLa.txt fil fulgt av statistikk for akkord lengde data kombinert fra alle _CLa.txt filer.
   6. Gi nytt navn og lagre regnearket. Standard filnavn er navnet på den overordnede mappen lagt med _CLa.xls. Lukke regnearket før du velger en annen makro.

5. Liten Airway Remodeling

1. Farging og bilde oppkjøpet
   1. Flekk lunge seksjoner med Masson sin Trichrome flekken ved hjelp av et kommersielt kit og følg produsentens anvisninger.
   2. Ta bilder av alle luftveiene i begge lungene som kan innlemmes helt (inkludert den blå laget utenfor luftveiene som er laget av ECM proteiner som er avsatt) innenfor et bildeområde med 20X objektiv på mikroskopet.
      MERK: Større luftveiene er ikke forbundet med økt avsetning av ECM proteiner i CS-eksponerte mus.
   3. Lagre fargebilder som JPEG-filer.
2. Bildeanalyse: Åpne bildefileni bildeanalyseprogram.
   1. Åpne og navngi loggfil å registrere målingene.
   2. Velg en linje tegneverktøy. Tegn fire linjer som krysser hulrommet i luftveiene (innvendig diameter) for å måle størrelsen på luftveiene, og bare inneholde slike i luftveiene som har den ønskede størrelse i analysen. Deretter trekker 12 jevnt fordelte linjer (ved posisjon i luftveiene som tilsvarer numrene på en klokke) som strekker seg fra kanten av den adventitia sjikt som ligger an mot luftveis ut til kanten av den blå-farget område omgitt luftveiene til å måle tykkelsen av laget av ECM-proteiner plassert utenfor luftveiene (figur 5). Unngå å måle områder hvor luftveiene samhandler med andre luftveiene eller fartøy.
   3. Første posten alle interne diameter linjer i loggfilen, og deretter spille de 12 linjene som måler tykkelsen av det blå ECM lag rundt luftveiene.
   4. Lukke bildet deretter åpne neste bilde.
   <li> Gjenta disse trinnene til alle bilder for dyret har blitt logget i én mappe.
   5. Begynner du med trinn 5.2 for neste mappe som inneholder bilder tatt på lunge seksjoner fra neste dyr. Avslutte programmet etter å ha fullført analysen av alle luftveiene i lunge seksjoner fra alle dyrene i forsøket.
   6. Skriv inn de fire interne diameter målinger og de 12 ECM protein lags tykkelse målinger registrert for hver luftvei for hver mus i dataloggfilene til et Excel-regneark. Gjennomsnittlig diameteren og ECM protein lag tykkelse målinger for hvert dyr.
   7. Konvertere målingene fra piksler til mikron.
   8. Gruppe luftveiene i henhold til deres indre diameter størrelse (f.eks., 300-399 mikrometer, 400-499 mikrometer etc.) og sammenligne ECM protein lag tykkelse målinger rundt luftveiene som har lignende størrelser for luft versus røykutsatte mus (f.eks., luftveier med en diameter på 300-899 um;
   9. Hvis det er nødvendig, immunfarging av lunge seksjoner for enkelte proteiner (inkludert interstitiell kollagen og basalmembran protein) og utføre en tilsvarende analyse for å kvantifisere avleiring av proteiner av interesse ved hjelp av denne metoden.

Representative Results

Denne protokollen begynner med hele kroppen eksponering av mus for CS. Tilstrekkelig tilsyn og vedlikehold av enheten og overvåking av TPM teller sikre konsistente røykeksponering (figur 1). Det er viktig at forskeren praktiserer lunge inflasjon teknikk med inflasjonsenheten

Denne protokollen begynner med hele kroppen eksponering av mus for CS. Tilstrekkelig tilsyn og vedlikehold av enheten og overvåking av TPM teller sikre konsistente røykeksponering (figur 1). Det er viktig at forskeren praksis lunge inflasjon teknikk med inflasjonsenheten (figur 2) og forsiktig fjerner lunge etter inflasjon for å få godt oppblåste lunge seksjoner for nøyaktig analyse av luftrommet utvidelse. Figur 3A viser en brønn oppblåst lunge, mens figur 3B viser en dårlig oppblåst lunge. Figur 3C viser et bilde av en oppblåst lunge seksjon forberedt for terskel sTEP (makrofager i den alveolære områder er malt hvitt og fartøy og bronkier er malt sort for å generere. Den terskeltrinnet skaper et binært bilde hvor alle piksler i den alveolære plass er hvite og alle pikslene i områder av lungen som ikke alveoler er sort (figur 3D). Figur 3E og 3F viser den vertikale og horisontale alveolar korde lengder som makroene generere, respektivt.

Lungefunksjonstester viser beskjedne (og ikke statistisk signifikante) venstre skift i trykkvolum (PV) looper reflekterer beskjedne tap av elastisk rekyl av lunge forenlig med mild emfysem som utvikler seg i C57BL / 6 WT mus eksponert for CS i 6 måneder ( Figur 4A). Betydelige venstre skift i PV sløyfene er kun observert i murine stammer som er svært følsomme for virkningene av CS eller i CS-eksponerte genet målrettet mus som har en mer alvorlig emfysem fenotype enn CS-eksponerte C57BL / 6 WT mus.

Figure 5 viser representative bilder Massons Trichrome-farget lunge deler av C57BL / 6 WT mus eksponert for luft (Figur 5A) eller CS (Figur 5B) for 6 måneder illustrerer økninger i ECM protein deponering rundt små luftveiene i CS-eksponerte dyr. Figur 5C illustrerer hvordan et bildeanalyseprogram kvantifiserer ECM proteinavsetning rundt luftveiene som har den ønskede indre diameter. Figur 5D viser analysen av ECM-proteiner avsetning rundt luftveier med en diameter på 300-899 um i CS-eksponerte C57BL / 6 WT mus.

Figur 1. En tegneserie av hele kroppen sigarett eksponeringssystem. Er et røykeksponering enhet som er koblet til et røykeksponering kammer. Røyk er trukket fra side-stream samling kammer og røyk er trukket frasigaretter av pumpen, og begge røyk prøver er blandet og fortynnet med omgivende luft i blandekammeret og fortynning (til venstre), og deretter røken strømmer inn i eksponeringskammeret. Forskeren legger mus i burene i eksponeringskammeret (til høyre); mus som er i stand til å bevege seg fritt i burene, og har tilgang til mat og vann for varigheten av eksponering til tobakksrøyk.

Figur 2. oppblåsing av murine lungene. Forskeren fyller en kolbe med sterilt PBS, tetter den med en gummipropp, og inverterer det og sikrer den en avstand på 25 cm over hjertet av dyret ved hjelp av et ringstativ. En intravenøs infusjonssett leverer PBS til lungene via trakeal kanyle. Et kutt ned serologisk pipette settes inn gjennom gummiproppen, og dette gjør det mulig for luft inn i flasken for å erstatte det volum av PBS som drenerer inn i lungs av musene av tyngdekraften.

Figur 3. Emfysem analyse. (A) viser et representativt bilde av Gill's-flekken oppblåst lunge seksjoner fra mus eksponert for luft eller CS i 6 måneder, de sorte piler indikerer et fartøy og alveolære makrofager. (B) viser et representativt bilde av en under-oppblåst lunge som ikke er egnet for analyse. (A) viser "før" og (C) viser "etter" bilde av et representativt lunge seksjon som forskeren forbereder for generering av et binært bilde. De sorte piler i (A) og (C) angir enten et fartøy (som forskeren malinger sort i (C)) eller alveolære makrofager (som forskeren maling hvitt i (C)). (D) < / Strong> viser det binære bildet etter forskeren utfører det avgjørende skritt. (E) og (F) viser den horisontale og vertikale alveolar akkord lengder at forskeren genererer, henholdsvis. Forstørrelse av alle bilder er x 200. Scale bar som representerer 400 um er vist i (A).

Figur 4. Alveolar kordelengde og trykk-volumkurver. (A) viser en typisk analyse av alveolære akkord lengder i C57BL / 6 vekt mus eksponert for luft (n = 13) eller CS (n = 24) i 6 måneder. Stjernen indikerer p <0,001. (B) viser typiske PV løkker utført på C57BL / 6 vekt mus eksponert for luft (n = 13) eller CS (n = 14) i 6 måneder. Data er uttrykt som gjennomsnitt + SEM.

highres.jpg "/>
Figur 5. Liten luftveis ombygging (SAR) vurdering. (A) og (B) viser representative bilder av Massons Trichrome-farget lunge seksjoner fra C57BL / 6 WT mus eksponert for luft (A) eller CS (B) for 6 måneder. (C) viser hvordan bildeanalyse programvaren analyserer SAR i CS-eksponerte mus. (D) viser typiske målinger av tykkelsen av den ekstracellulære matriks-protein lag avsatt rundt små luftrom som har en diameter på 300 til 899 m i C57BL / 6 WT mus eksponert for luft (n = 11) eller CS (n = 16) for 6 månedene. Data er uttrykt som middelverdi ± SEM, og stjernen indikerer p <0,05.

Skala barer er vist på bildene i hver lunge delen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032