Protocol
1. Geração de células humanas de carcinoma de ovário OVCAR-3 estavelmente transduzidas com Lentiviruses Contendo o Reporter Construct SOX2 Região Regulatory
- Gerar partículas lentivirais por transfecção da linha celular 293T HEK-embalagem com uma construção repórter reconhecer uma região reguladora SOX2 como descrito 10,21.
NOTA: O repórter construir contém ainda um domínio desestabilização do System Shield ProteoTuner à frente da proteína tdTomato fluorescência. Shield1 se liga ao domínio desestabilização impedindo assim o proteassoma para degradar a proteína de fluorescência 22. - Transduzir células OVCAR-3 com partículas lentivirais durante um período de tempo de 24 horas. Em seguida, remover o sobrenadante viral e lavar as células com solução salina de fosfato tamponada (PBS) e cultivadas em meio completo (meio RPMI suplementado com 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina).
- 48 horas depois, 10 ug / ml puromicina foram adicionados às culturas e mantidas durante 5 dias para permitir a selecção de células transduzidas adequadamente.
2. Preparação de células de classificação e Galvanização
- Adicionar Shield1 a 1: 1000 de diluição 24 h antes da separação de células. Use estavelmente transduzidas OVCAR-3 em células sem tratamento Shield1 como controlos negativos (Figura 1). Aspirar meios de balão, lavar as células com PBS 1x e trypsinize células com 0,05% Tripsina-EDTA durante 3 min.
- Pare tripsina utilizando meio completo (ver acima), contar o número de células, as células de centrifugação a 300 xg à temperatura ambiente (15 - 25 ° C) durante 5 min.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender as células cuidadosamente em 0,5-1 ml de PBS estéril.
- Use 40 um filtro cap filtro de células para obter a suspensão de uma única célula.
- Ajustar a contagem de células a 5 milhões de células por ml.
- Prepare baixa fixação placas ultra-96 poços com 100 ul esferas médio (MEGM suplementado com fatores de crescimento, citocinas e suplementos,B-27, heparina-sódio; ou DMEM / F12 suplementado com factores de crescimento, citocinas e suplementos, B-27, heparina-sódio, com ou sem adição de 1% de metilcelulose, ver também a Tabela 1). Opcionalmente adicionar antibióticos para o meio a uma concentração de 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina para minimizar o risco de possível contaminação.
- Ordenar as células em RFP- preparadas placas de 96 poços a partir de cima e RFP +, uma célula por cavidade (ensaio de esferas único baseado em células), e 100 células por poço (de ensaio de multi esferas baseados em células), respectivamente. Execute classificador de células tipo em comercialmente disponível (ver Materiais) usando o modo de única célula, Sort setup: 100 μ bocal, pressão do invólucro 20 psi, e rendimento de máscara 0, pureza máscara de 32, a máscara de fase 16.
- Avaliar a eficiência do plaqueamento por microscopicamente conseguir poços contendo células (para o ensaio de base celular único) e por contagem do número de células em poços individuais (para o ensaio baseado em células múltiplas; Figura 2
- Incubar as células em condições normais médias em esferas (para a composição ver passo 2.6) a 37 ° C e 5% de CO 2. Suplemento de bFGF por dia (20 ng / ml) e EGF (20 ng / ml).
- Após uma semana, contar o número de esferas de tumor emergente usando um microscópio padrão com 4X ou ampliação de 10X e um microscópio de fluorescência para detectar o sinal de fluorescência a partir do sistema repórter integrada. Contagem de esferas com um diâmetro superior a 100 um, como esferas "grandes" e as esferas com um diâmetro de 50 - 100 mm como "pequenos" esferas (Figura 3). Tenha certeza de que você contar esferas reais e não celular clusters.
NOTA: Em ensaios baseados em células individuais formação esfera é mais fácil para marcar microscopicamente após 10 (contra 7) dias de cultura. - Calcular a proporção de células formadoras de esfera em RFP + e células, respectivamente RFP- em ensaios baseados em células individuais (uma placa de 96 poços para cada experiência individual) ou de multi-célula baesferas ensaios sed (um bem para cada experimento indivíduo), como apresentado por Shaw et al. 16
NOTA: Proporção de células formando esfera (%) = (número de esferas) / (número de células semeadas) x 100
3. Passaging Serial de Esferas
- Colocar o conteúdo de cada cavidade dentro de um tubo estéril adequado e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Para baseados em células múltiplas esferas ensaios, reúna as esferas de um bem. Lava-se a bem 3 - 5 vezes com PBS e centrifugação mais 2 min. Para individuais baseados em células esferas ensaios, coletar esferas individuais. Devido ao baixo número de células, utilizar tubos de 1,5 ml para centrifugação e lavagem passos.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de 0,05% de tripsina-EDTA.
- A fim de conseguir a separação celular óptimo, incubar a suspensão de células a 37 ° C durante 5 min num agitador suave. Otimizar tripsiniza�o tempo para a sua linha de células de menor taxa de morte celular: se nenhuma grandeesferas é triturado visível delicadamente com uma pipeta de ponta de 100 mL. No caso de grandes esferas ainda estão presentes, incube com tripsina outro 3 min e, em seguida, avançar para a etapa de trituração. No caso de um único ensaios baseados em células para se certificar de optimizar o tempo de rendimento óptimo das células de células vivas durante o passo de tripsinização.
- Para inactivar a tripsina, adicionar 500 ul meio completo e centrifugação a 300 xg durante 10 min, no caso de ensaios de células individuais, centrifugar durante mais 2 min.
- Remover sobrenadante e ressuspender as células em meio de esferas cuidadosamente.
- Usar um filtro de 40 um filtro de células de tampão para se obter uma suspensão de célula única.
- No caso de se utilizar células RFP- em ensaios bassed de células multi-RFP + e, avaliar a percentagem de células fluorescentes em cada poço após ressuspensão através de análise de citometria de fluxo.
- Para os ensaios de replating série de células individuais, sementes de 1 célula por cavidade em um novo ultra-baixo fixação placa de 96 poços preparados tal como acima descrito. A partir de uma esfera individual, semear aproximadamente 20 poços individuais. Para os ensaios de esferas replating primários múltiplos baseados em células, as células de semente obtido a partir de um poço de esferas primárias para uma nova placa de 96 poços e contar o número de células no dia seguinte por microscopia.
- Avaliar a percentagem de células formadoras de esfera em esferas secundárias ensaios usando a fórmula descrita no passo 2.11.
Análise 4. Resultado
- Analisar os resultados de experimentos realizados em triplicatas independentes e usar o teste t de Student dois lados para analisar os valores normalmente distribuídos e de outra forma Mann-Whitney-testes para análise estatística.
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Representative Results
Em ensaios de esferas convencionais, cerca de 40% de RFP + OVCAR-3 células vs. 20% de células RFP- deu origem a uma esfera tumor individual no ensaio de esferas primário (Figura 4A). Além disso, as esferas formadas por RFP + células eram maiores em tamanho do que os que são formados por células RFP-.
Quando colocadas em ensaios baseados em células individuais, células RFP + também formou mais esferas do que as células RFP-, confirmando os resultados acima. No entanto, havia uma tendência para a geração de um número de esferas por plaqueadas na simples versus o ensaio de múltiplos baseados em células (Figura 4A, B), indicando que, neste ensaio de formação de esferas pode ser inclinado por meio de artefactos, tais como técnicas de fusão esfera mecânica ou dissociação no meio de cultura não aderente.
Para explorar ainda mais esses aspectos, em comparação a influência da densidade de revestimento de células na formação de esferas. Nós plaqueadas células através de diluição limitante a partir de 1000 células para 1 célula por poço em 96Bem placas e descobriram que os números de esferas emergentes eram altamente dependente dos números de células plaqueadas inicialmente. Surpreendentemente, os números mais elevados de esferas foram contadas a partir de números mais baixos de células plaqueadas em ambos MGEM e meio DMEM / F12-base, demonstrando que as modalidades de facto altamente chapeamento distorcer os resultados neste ensaio (Figura 5). Em contraste, quando as células foram imobilizadas por adição de 1% de metilcelulose de DMEM / F12 com base em esferas 23,24 forma a eficiência de formação de esfera foi maioritariamente independente da densidade celular.
Para explorar a influência das condições de cultura de esferas sobre as propriedades CSC, analisou-se a percentagem de células que expressam sinal de fluorescência vermelha após 7 dias de incubação no ensaio de esferas. Nós descobrimos que na baseados em células múltiplas esferas culturas cerca de 35% das células de RFP + esferas perdeu o seu sinal de fluorescência vermelha após sete dias de cultura (Figura 6A), o que sugere que eles têm underguma diferenciação, enquanto 65% mantiveram uma RFP + sinal sugerindo a capacidade de auto-renovação. Em contraste, as células geradas a partir de esferas a partir de células inicialmente RFP- permaneceu negativo RFP (Figura 6A), o que indica que não é possível restabelecer o potencial de células estaminais sob estas condições.
A microscopia de fluorescência realizada em esferas geradas a partir de células individuais confirmaram esses resultados mostram que as esferas individuais derivados RFP + células continham tanto RFP células RFP- + e enquanto esferas derivadas de células RFP- manteve-se negativa para o sinal vermelho.
Foram observados resultados semelhantes em ensaios de replating de ambas as condições.
Figura 1. Fluxo de Trabalho de lentivírus transdução, seleção e classificação de células RFP- RFP + e. Depois de transdução de lentivírus ea seleção positiva de As células transduzidas com sucesso através da exposição puromicina, RFP- e células + RPF são classificadas por FACS em poços individuais de uma placa de 96 poços em meio de esferas. Para baseados em células múltiplas esferas ensaios, 100 células são colocadas em um poço. Chapeamento de eficiência é avaliada por microscopia realizados após a classificação. Spheres foram marcados por microscopia após sete a dez dias, dissocia-se em células individuais, analisados através de citometria de fluxo e replated em esferas secundárias. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagem de células RFP- ordenada RFP + e após o plaqueamento. RFP Individual + e células RFP- ordenados em cada poço de uma placa de 96 poços são analisados para uma correcta chapeamento usando uma (fluorescente) microscópio."target =" _ w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise de formação de formação de esferas em ensaios baseados em células individuais. As esferas são analisados após sete a dez dias. (A) Grande (diâmetro> 100 mm) e (B) pequeno (diâmetro 50 - 100 mm). Esferas são distinguidos microscopicamente com base no tamanho Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Eficiência de tumor esferas formação de RFP +e RFP- OVCAR-3 em células de vários ensaios baseados contra esferas de uma única célula. A comparação de eficiência de esfera primário e secundário de células OVCAR-3, tal como testado em vários (A) versus individuais baseados em células Os ensaios esferas (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. celular densidade de revestimento fortemente impactos esfera contagens de células OVCAR-3 no ensaio de esferas com base em células de multi realizada no estado líquido, mas não em culturas de metilcelulose suplementado. A utilização de diferentes densidades celulares e meio de crescimento tem sido relatado na literatura para o cancro do ovário Esferas de ensaios. Para analisar possíveis vieses introduzidos por estas variáveis, as células são colocadas em placas a diferendensidades nt em 200 mL de diferentes meios de cultura esferas (MGEM, DMEM / F12 com todos os suplementos, conforme detalhado na seção de protocolo, ou DMEM / F12 com todos os suplementos e contendo 1% de metilcelulose) e formação de esfera é marcado após 7 dias (A) . Mostrado em (B) são imagens de microscopia de células plaqueadas a diferentes densidades tomadas um dia após o plaqueamento em meio DMEM / F12 esferas meio de cultura sem metilcelulose. Observe os grupos de células que estão a emergir de alta densidade celular ao invés de células individuais visto em placas de baixa densidade. Barra de escala para as imagens:. 50 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Análise de RFP sinal nas esferas tumor formado a partir de RFP + e respectively RFP- células OVCAR-3 (A) análise de citometria de fluxo para o sinal de RFP em esferas dissociadas derivadas de células RFP + e RFP- (ensaio de esferas com base nas células múltiplas).; (B) Microscopia de esferas derivadas de células RFP- (ensaio esferas base de uma única célula) RFP + e revela sinal RFP heterogêneo nas esferas derivados de RFP +, mas não a partir de células RFP-. Fotos foram tiradas no dia 7 de esferas convencionais e dia 10 para a esfera ensaios baseados em células individuais. Observe o tamanho maior de esferas derivados de RFP + putativos CSCs. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| A origem das células do cancro do ovário humano | Meio de base | Suplementos | Autores |
| OVCAR-3, Caov-3, o material primário | MEGM | 20 ng / ml RegF, 20 ng / ml de bFGF, B-27, 4 ug / ml de heparina, hidrocortisona, insulina (kit SingleQuot) | Bareiss et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml de insulina, 10 ng / ml RegF, 10 ng / ml de bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% de BSA | Ma Li et al. |
| A2780 | DMEM / F12 | 5 ug / ml de insulina, 20 ng / ml RegF, 2% de B-27, 0,4% de BSA | Haiwei Wang et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml de insulina, 20 ng / ml RegF, 10 ng / ml de bFGF, 2% de B-27, 1 ng / ml de hidrocortisona | Yong-Rui Du et al. |
| A2780, material primário | DMEM / F12 | 5 ug / ml de insulina, 20 ng / ml RegF, 10 ng / ml de bFGF, 0,4% de BSA | T. Xiang et al. |
| Material principal | DMEM / F12 > | 5 ug / ml de insulina, 10 ng / ml RegF, 10 ng / ml de bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% de BSA | Te Liu et al. |
| MLS | DMEM / F12 | 10 ng / ml de insulina, 20 ng / ml RegF, 20 ng / ml de bFGF, 2% de B-27 | Soritau et al. |
| 3AO | DMEM / F12 | 1 mg / ml de insulina, 20 ng / ml RegF, 20 ng / ml de bFGF, 2% de B-27 | MF Shi et al. |
| Material principal | DMEM / F12 | 5 ug / ml de insulina, 20 ng / ml RegF, 10 ng / ml de bFGF, 0,4% de BSA | Shu Zhang et al. |
| Material principal | EBM-2 ou X-VIVO | 5 ug / ml de insulina, 20 ng / ml RegF | Ilona Kryczek et al. |
| OVCAR-3 | MEGM | 20 ng / ml RegF, 20 ng / ml de bFGF, B-27, 4 ug / mL de heparina | Dongming Liang et al. |
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Discussion
Esferas culturas é um método amplamente utilizado para testar o potencial de células estaminais do cancro e para enriquecer as células estaminais do tipo em uma ampla variedade de células tumorais humanas 15,25,26. Sob estas condições de cultura, as células cancerosas que não têm capacidade de auto-renovação são esperados para diferenciar e eventualmente sofrem morte celular. Embora eles podem, inicialmente, formar grupos de células tumorais ou mesmo esferas especialmente em ensaios preliminares, eles não são capazes de sustentar a capacidade de formação de esfera em cima do repique de série devido à falta de propriedades de auto-renovação. Esferas ensaios são usados como substitutos ensaios para identificar CSCs e avaliar a sua frequência em populações de células tumorais inteiras.
No entanto, a variabilidade substancial pode ser observada entre as esferas ensaios realizados de acordo com protocolos publicados 5,10,27-35 diferentes (Tabela 1). Em nosso laboratório, temos publicado anteriormente formação esfera partir de células de carcinoma de ovário humano usando MEGM suplementadas com B-27, BFGF, heparina e SingleQuot TM (contendo insulina, RegF e hidrocortisona). Outros laboratórios usar DMEM / F12 Medium todo, enquanto alguns adicionar apenas B-27 e RegF. Neste relatório, ensaio de múltiplos esferas baseadas em células OVCAR-3 em células foram, portanto, realizadas utilizando diferentes condições. Usando MEGM ou DMEM / F12 com todos os suplementos nenhuma diferença significativa na formação de esfera foi observada nestas células (Figura 5A). Além disso, alguns laboratórios têm especulado que a EGF e FGF pode ser rapidamente degradada e estabeleceram protocolos adicionando esses fatores de crescimento diária ao meio. Portanto, em comparação esferas ensaios realizados em um meio no qual EGF e FGF foi adicionado apenas no início dos ensaios com esferas adição diária de EGF e FGF para a cultura de células, e encontramos estes ensaios para se obter resultados equivalentes em células OVCAR-3 (dados não apresentados), o que sugere que a suplementação diária caros e laboriosos com EGF e FGF pode não ser sempre necessário. Se estes resultadossão aplicáveis às células de outras linhas de células de cancro do ovário ou amostras primárias, ou sob diferentes condições experimentais permanece a ser determinada.
No entanto, observou-se um desvio substancial do número de esferas marcados introduzidas por outra variável testada, a densidade do revestimento de células. Surpreendentemente, poços semeados com números mais baixos de células mostraram um maior número de esferas. A limitação da mobilidade celular por metilcelulose a 1% resultou na mesma eficiência de formação de esfera, independente do número de células plaqueadas inicialmente. Estes resultados sugerem que a aglutinação celular e esfera de fusão ou desagregação pode ocorrer modificando números esfera e levando a resultados imprecisos em baseados em células múltiplas esferas ensaios. Quando as células são plaqueadas a uma densidade adequada, ensaios baseados em células múltiplas, contudo, conduzir a resultados bastante comparáveis com os dados obtidos esfera ensaios baseados em células individuais (Figura 4). Para explorar ainda mais esses resultados foram comparados com base de uma única célula e multiensaios utilizando células de carcinoma de ovário classificados em CSCs putativas através de um sistema de expressar repórter RFP lentivírus publicado recentemente para uma região reguladora SOX2 10. Na verdade, ambos os ensaios confirmaram a capacidade melhorada primário e secundário de esfera formando RFP + contra células RFP- (Figura 4A, B). Mais importante, os números mais elevados de esferas observados a partir de células RFP + não foram devidos a maior capacidade proliferativa das células SOX2 expressando (dados não mostrados), que está em linha com os resultados anteriores mostram que a indução de SOX2 promove a formação de esferas e na tumorigenicidade in vivo sem acelerar progressão do ciclo celular 10.
Tomados em conjunto, solteiro esferas baseados em células ensaios são mais trabalhoso e caro, mas que resultam em dados mais precisos, o que também é confirmado pelo maior reprodutibilidade dos resultados entre os experimentos. Desde densidade de revestimento influencia fortemente os resultados em várias células-based suspensão esferas ensaios, a titulação inicial de densidade de revestimento adequado é necessária para cada tipo de célula tumor individual antes de analisar a formação esfera usando estes ensaios. Alternativamente, os ensaios baseados em células individuais mais precisas podem ser usadas iniciais, ou suplementação metilcelulose para aumentar a precisão dos resultados reduzindo artefactos mecânicos. Se a formação de esfera é comparada entre as condições em que a modificação genética ou tratamento medicamentoso pode alterar seriamente a viabilidade das células, reduzindo assim a densidade celular, esfera ensaios baseados em células individuais podem ser obrigatórios para evitar resultados positivos falsos.
Em resumo, sob condições experimentais adequadas tanto o ensaio de esferas multi-base de células e o único ensaio de esferas baseadas em células são capazes de indicar diferenças de potencial esfera entre populações diferentes de células estaminais (e células não estaminais). No entanto, as esferas ensaios baseados em células múltiplas, que normalmente são realizados em culturas líquidas são mais susceptíveis a errors introduzidas pelo projeto experimental através de densidade de revestimento. A suplementação de metilcelulose (1%) para ensaios baseados em células múltiplas pode limitar artefactos relacionados com a agregação e fusão celular esfera. Com base nesses dados, recomendamos individuais baseados em células esferas ensaios a serem realizados a menos que as análises de titulação detalhados foram realizados impacto inicial e negativa das condições experimentais sobre a viabilidade celular e, assim, a densidade celular foi descartada. No entanto, a única esferas baseados em células ensaios são mais trabalhoso e mais caro, e não pode ser exigido em cada configuração experimental. Suplementado com metilcelulose múltiplos baseados em células esferas ensaios podem representar uma outra alternativa, em alguns contextos experimentais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
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