Protocol
1. توليد OVCAR-3 خلايا سرطان المبيض الإنسان Transduced ستابلي مع Lentiviruses احتواء مراسل تعبيد SOX2 منطقة تنظيم
- توليد جزيئات lentiviral عليها بنقل خط خلية 293T التعبئة والتغليف HEK مع بناء مراسل الاعتراف المنطقة التنظيمية SOX2 كما هو موضح 10،21.
ملاحظة: المراسل بناء مزيد يحتوي على نطاق زعزعة استقرار نظام الدرع ProteoTuner قبل البروتين tdTomato مضان. Shield1 يربط إلى المجال زعزعة الاستقرار وبالتالي منع proteasome وأن تتحلل البروتين مضان 22. - تنبيغ OVCAR-3 الخلايا مع جزيئات lentiviral على مدى فترة زمنية من 24 ساعة. بعد ذلك، إزالة طاف الفيروسي وغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ومثقف في المتوسط كاملة (RPMI تستكمل مع 10٪ FBS، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين).
- بعد 48 ساعة، 10 ميكروغرام / مل بوروأضيفت mycin إلى الثقافات والحفاظ لمدة 5 أيام للسماح للاختيار من خلايا transduced بشكل صحيح.
2. إعداد الفرز خلية والتصفيحات
- إضافة Shield1 في 1: 1،000 التخفيف 24 ساعة قبل الفرز الخلية. استخدام transduced ستابلي OVCAR-3 خلايا بدون علاج Shield1 والضوابط السلبية (الشكل 1). وسائل الإعلام نضح من القارورة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X ويعرض للتريبسين الخلايا مع 0.05٪ التربسين-EDTA لمدة 3 دقائق.
- وقف التربسين باستخدام المتوسطة كاملة (انظر أعلاه)، عد أعداد الخلايا، والخلايا الطرد المركزي في 300 x ج في RT (15-25 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
- طاف صب وResuspend الخلايا بعناية في 0،5-1 مل PBS العقيمة.
- استخدام 40 ميكرون الغطاء مصفاة الخلية مرشح للحصول على تعليق وحيد الخلية.
- ضبط عدد الخلايا إلى 5 مليون خلية لكل مليلتر.
- إعداد-مرفق منخفض لوحات 96-جيدا جدا مع 100 ميكرولتر المجالات المتوسطة (MEGM تستكمل مع عوامل النمو، السيتوكينات، والمكملات الغذائية،B-27، heparine الصوديوم. أو DMEM / F12 تستكمل مع عوامل النمو، السيتوكينات، والمكملات الغذائية، B-27، heparine الصوديوم مع أو بدون إضافة 1٪ ميثيل، انظر أيضا الجدول 1). اختياريا إضافة المضادات الحيوية إلى متوسطة بتركيز 100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين للحد من مخاطر التلوث ممكن.
- نوع طلب تقديم العروض + والخلايا RFP- إلى إعداد لوحات 96-جيدا من فوق (1)، خلية لكل بئر (وحيد خلية القاعدة مجالات الفحص) و 100 خلايا لكل بئر (متعدد المجالات خلية القاعدة فحص)، على التوالي. أداء فارز خلية نوع على المتاحة تجاريا (انظر المواد) باستخدام طريقة واحدة الخلية، وترتيب الإعداد: 100 μ فوهة، غمد ضغط 20 رطل، والعائد قناع 0، قناع نقاء 32، قناع المرحلة 16.
- تقييم كفاءة الطلاء بتسجيله مجهريا الآبار التي تحتوي على الخلايا (للمقايسة على أساس وحيد الخلية) وعن طريق عد الأرقام خلية في الآبار الفردية (للفحص متعددة القائم على الخلية؛ الشكل 2
- احتضان الخلايا تحت الظروف القياسية في المجالات المتوسطة (للتكوين راجع الخطوة 2.6) عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. الملحق اليومي bFGF (20 نانوغرام / مل)، وEGF (20 نانوغرام / مل).
- بعد أسبوع واحد، عد الأرقام من المجالات الناشئة الورم باستخدام مجهر القياسية مع 4X أو 10X التكبير ومضان المجهر للكشف عن إشارة مضان من النظام مراسل متكامل. عدد المجالات التي يبلغ قطرها تتجاوز 100 ميكرون كما المجالات "كبيرة"، والمجالات التي يبلغ قطرها 50-100 ميكرون كما المجالات "صغيرة" (الشكل 3). تأكد من أن كنت تعول المجالات حقيقية وليست الخلية مجموعات.
ملاحظة: في المقايسات القائم على خلية واحدة تشكيل المجال هو أسهل ليسجل مجهريا بعد 10 (مقابل 7) أيام من الثقافة. - حساب نسبة الخلايا المكونة المجال في RFP + والخلايا RFP- على التوالي في المقايسات القائم على خلية واحدة (واحد لوحة 96-جيدا لكل تجربة فردية) أو متعددة الخلية بامجالات المقايسات سد (بئر واحدة لكل تجربة فردية) على النحو الذي عرضه شو وآخرون (16).
ملاحظة: نسبة المجال تشكيل الخلايا (٪) = (عدد من المجالات) / (عدد الخلايا المصنف) × 100
3. الركض المسلسل من المجالات
- وضع محتوى كل بئر في أنبوب معقم مناسب وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. لخلية القاعدة متعددة المجالات المقايسات، وجمع معا المجالات من بئر واحد. يغسل جيدا 3-5 مرات مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي 2 دقيقة لفترة أطول. لالقائم على خلية واحدة المجالات المقايسات، وجمع المجالات الفردية. نظرا لانخفاض عدد الخلايا، استخدام 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي وغسل الخطوات.
- إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر من 0.05٪ التربسين-EDTA.
- من أجل تحقيق فصل الخلية الأمثل، واحتضان تعليق خلية عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في شاكر لينة. تحسين trypsinization الوقت لخط الخلية لانخفاض معدل موت الخلايا: إذا لم كبيرةمجالات هي يسحن مرئية بلطف باستخدام ماصة غيض 100 ميكرولتر. في حالة مجالات كبيرة لا تزال موجودة، واحتضان مع التربسين 3 دقائق أخرى ثم انتقل إلى الخطوة سحن. في حالة واحدة المقايسات خلية مقرها تأكد لتحسين العائد الوقت لخلية الأمثل للخلايا الحية خلال الخطوة trypsinization.
- لإبطال نشاط التربسين، إضافة 500 ميكرولتر المتوسطة كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة، في حالة المقايسات خلية واحدة، الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة إضافية.
- إزالة الخلايا طاف و resuspend بعناية في المجالات المتوسطة.
- استخدام 40 ميكرون الغطاء مصفاة الخلية مرشح للحصول على تعليق وحيد الخلية.
- في حالة استخدام RFP + والخلايا RFP- في المقايسات bassed خلية متعددة، وتقييم نسبة الخلايا الفلورسنت في كل إعادة تعليق جيدا بعد عن طريق تدفق عداد الكريات التحليل.
- لفحوصات replating المسلسل من الخلايا واحد، والبذور 1 خلية لكل بئر في فائقة مرفق منخفض لوحة 96-جيدا جديدة أعدت على النحو المفصل أعلاه. من مجال واحد على حدة، البذور حوالي 20 بئرا الفردية. لفحوصات replating من خلية القاعدة الأجواء الأولية متعددة، وخلايا البذور التي تم الحصول عليها من بئر واحدة من المجالات الرئيسية في جديدة لوحة 96 جيدا والعد أعداد الخلايا اليوم التالي بواسطة المجهر.
- تقييم نسبة الخلايا المكونة المجال في المجالات الثانوية فحوصات باستخدام الصيغة هو موضح في الخطوة 2.11.
4. تحليل النتيجة
- تحليل النتائج من التجارب التي أجريت في يثلث مستقلة واستخدام الطلاب على الوجهين في اختبار t لتحليل القيم وزعت بشكل طبيعي وغير ذلك مان ويتني-اختبارات التحليل الإحصائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في المجالات المقايسات التقليدية، وقدم ما يقرب من 40٪ من RFP + OVCAR-3 خلايا مقابل 20٪ من خلايا RFP- الارتفاع إلى مجال الأورام الفردية في المجالات الأساسي فحص (الشكل 4A). وعلاوة على ذلك، كانت المجالات التي شكلتها RFP + خلايا أكبر حجما من تلك التي شكلتها خلايا RFP-.
عندما مطلي في المقايسات القائم على خلية واحدة، شكل خلايا RFP + أيضا المزيد من المجالات من خلايا RFP-، تؤكد النتائج أعلاه. ومع ذلك، كان هناك اتجاه نحو جيل من أقل المجالات في مطلي في احد مقابل متعددة الفحص القائم على الخلية (الشكل 4A، B)، مشيرا إلى أن قد يكون متحيزا في هذا المجال من خلال تشكيل فحص التحف الفنية مثل الانصهار المجال الميكانيكي أو التفكك في مستنبت غير ملتصقة.
لمزيد من استكشاف هذه الجوانب، قارنا تأثير كثافة الطلاء خلية في تشكيل المجالات. نحن مطلي الخلايا باستخدام الحد من التخفيف من 1،000 الخلايا ل1 خلية لكل بئر في 96لوحات حسنا ووجدت أن أعداد المجالات الناشئة كانت تعتمد بشكل كبير على أعداد خلايا مطلي في البداية. والمثير للدهشة، تم إحصاء الأرقام أعلى من المجالات من انخفاض أعداد خلايا مطلي في كل MGEM وDMEM / وسائل الإعلام على أساس F12، مما يدل على أن طرائق الطلاء الواقع إلى حد كبير النتائج التحيز في هذا الاختبار (الشكل 5). في المقابل، عندما يجمد خلايا بإضافة 1٪ ميثيل لDMEM / المجالات على أساس F12 المتوسطة 23،24 كانت كفاءة تكوين المجال معظمها مستقلة من كثافة الخلايا.
لاستكشاف تأثير الظروف الثقافة المجالات على خصائص CSC، قمنا بتحليل نسبة الخلايا معربا الحمراء إشارة مضان بعد 7 أيام من الحضانة في مقايسة المجالات. وجدنا أن في خلية القاعدة متعددة المجالات الثقافات ما يقرب من 35٪ من الخلايا من RFP + المجالات فقدت الحمراء إشارة مضان على بعد سبعة أيام من ثقافة (الشكل 6A)، مما يوحي بأن لديهم undergالتمايز واحد، بينما احتفظت 65٪ من RFP + إشارة يدل على قدرة التجديد الذاتي. في المقابل، ظلت الخلايا من المجالات المولدة من الخلايا RFP- في البداية سلبية طلب تقديم العروض (الشكل 6A)، مشيرا إلى أن أنهم لا يستطيعون إعادة بناء إمكانات الخلايا الجذعية في ظل هذه الظروف.
مضان المجهري تجرى على المجالات المولدة من الخلايا واحد وأكد هذه النتائج تبين أن المجالات احدة مستمدة RFP + خلايا يتضمن كلا RFP + والخلايا RFP- بينما ظلت المجالات المشتقة من خلايا RFP- السلبية للإشارة الحمراء.
ولوحظت نتائج مماثلة في المقايسات replating من كل الظروف.
الشكل 1. سير العمل من lentiviral التنبيغ، واختيار وفرز RFP + والخلايا RFP- بعد تنبيغ lentiviral واختيار الإيجابية لل يتم فرز الخلايا transduced بنجاح عن طريق التعرض بوروميسين، RFP- وخلايا الجبهة الوطنية الرواندية + من قبل FACS في الآبار الفردية لوحة 96-جيدا في المجالات المتوسطة. لخلية القاعدة متعددة المجالات المقايسات، يتم وضع 100 خلية في بئر واحدة. ويتم تقييم كفاءة الطلاء بواسطة المجهر تنفيذها بعد الفرز. وسجل المجالات بواسطة المجهر بعد سبعة إلى عشرة أيام، فصلها في الخلايا واحدة، وتحليلها عن طريق التدفق الخلوي وreplated إلى مناطق الثانوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويتم تحليل الشكل 2. التصوير من مصنفة RFP + والخلايا RFP- بعد الطلاء. RFP واحد + والخلايا RFP- مرتبة في كل بئر من لوحة 96-جيدا لتصفيح الصحيح باستخدام (الفلورسنت) المجهر.w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويتم تحليل تكوين الشكل 3. تحليل تشكيل المجالات في المقايسات القائم على خلية واحدة. المجالات بعد سبعة إلى عشرة أيام. (A) كبير (قطر> 100 ميكرون) و (B) صغيرة (قطرها 50-100 ميكرون). وتتميز مقرها المجالات مجهريا على حجم الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. كفاءة الورم المجالات تشكيل من RFP +وRFP- OVCAR-3 خلايا متعددة في مقابل المجالات المقايسات خلية واحدة على أساس مقارنة بين كفاءة المجال الابتدائية والثانوية من OVCAR-3 الخلايا كما يعاير في متعددة (A) مقابل القائم على خلية واحدة المجالات المقايسات (B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. الخلية كثافة الطلاء بقوة الآثار المجال التهم من OVCAR-3 الخلايا في خلية القاعدة متعددة المجالات الفحص التي أجريت في السائل ولكن تم الإبلاغ ليس في ميثيل تستكمل الثقافات. استخدام كثافات مختلفة من الخلايا وسائط النمو في الأدب لسرطان المبيض الكرات المقايسات. لتحليل التحيز المحتملة التي أدخلتها هذه المتغيرات، ومطلي الخلايا في احالكثافة الإقليم الشمالي في 200 ميكرولتر من مختلف وسائل الإعلام ثقافة المجالات (MGEM، DMEM / F12 مع جميع الملاحق على النحو المفصل في القسم البروتوكول، أو DMEM / F12 مع جميع الملاحق والتي تحتوي على ميثيل 1٪)، وسجل تشكيل المجال بعد 7 أيام (A) . هو مبين في (B) هي الصور المجهري للخلايا مطلي بكثافات مختلفة اتخذت يوم واحد بعد الطلاء في DMEM / F12 الكرات مستنبت دون ميثيل. لاحظ مجموعات الخلايا الناشئة في الكثافة الخلوية عالية بالمقارنة مع الخلايا واحد ينظر في لوحات منخفضة الكثافة. شريط مقياس للصور: 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. تحليل RFP إشارة في المجالات الورم شكلت من RFP + وrespectivاعل RFP- OVCAR-3 خلايا (A) تحليل التدفق الخلوي للإشارة RFP في المجالات فصلها المشتقة من خلايا RFP + وRFP- (بناء خلية متعددة المجالات الفحص)؛ (B) الميكروسكوب من المجالات المستمدة من RFP + والخلايا RFP- (بناء خلية واحدة مجالات الفحص) يكشف غير متجانسة إشارة RFP في المجالات المستمدة من RFP + ولكن ليس من خلايا RFP-. تم التقاط الصور في يوم 7 المجالات التقليدية ويوم 10 لواحدة المقايسات المجال المستندة إلى الخلية. لاحظ حجم أكبر من المجالات المستمدة من RFP + المفترضة الخلايا الجذعية السرطانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مصدر خلية سرطان المبيض البشري | وسط قاعدي | المكملات الغذائية | الكتاب |
| OVCAR-3، Caov-3، المواد الأولية | MEGM | 20 نانوغرام / مل rEGF، 20 نانوغرام / مل bFGF، B-27، 4 ميكروغرام / مل الهيبارين، الهيدروكورتيزون، الأنسولين (SingleQuot عدة) | BAREISS وآخرون. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 10 نانوغرام / مل rEGF، 10 نانوغرام / مل bFGF و 12 نانوغرام / مل LIF، 0.3٪ BSA | لى ما وآخرون. |
| A2780 | DMEM / F12 | 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 20 نانوغرام / مل rEGF، 2٪ B-27، 0.4٪ BSA | Haiwei وانغ وآخرون. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | مل 1 نانوغرام مل الهيدروكورتيزون 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 20 نانوغرام / rEGF، 10 نانوغرام / مل bFGF، 2٪ B-27، / | يونغ-دو روي وآخرون. |
| A2780، المواد الأولية | DMEM / F12 | 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 20 نانوغرام / مل rEGF، 10 نانوغرام / مل bFGF، 0.4٪ BSA | T. شيانغ وآخرون. |
| المواد الأولية | DMEM / F12 > | 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 10 نانوغرام / مل rEGF، 10 نانوغرام / مل bFGF و 12 نانوغرام / مل LIF، 0.3٪ BSA | الشركة المصرية للاتصالات ليو وآخرون. |
| MLS | DMEM / F12 | 10 نانوغرام / مل الأنسولين، 20 نانوغرام / مل rEGF، 20 نانوغرام / مل bFGF، 2٪ B-27 | Soritau وآخرون. |
| 3AO | DMEM / F12 | 1 ملغ / مل الأنسولين، 20 نانوغرام / مل rEGF، 20 نانوغرام / مل bFGF، 2٪ B-27 | MF شي وآخرون. |
| المواد الأولية | DMEM / F12 | 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 20 نانوغرام / مل rEGF، 10 نانوغرام / مل bFGF، 0.4٪ BSA | شو تشانغ وآخرون. |
| المواد الأولية | EBM-2 أو X-VIVO | 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 20 نانوغرام / مل rEGF | إيلونا Kryczek وآخرون. |
| OVCAR-3 | MEGM | 20 نانوغرام / مل rEGF، 20 نانوغرام / مل bFGF، B-27، 4 ميكروغرام / مل الهيبارين | دونغ مينغ ليانغ وآخرون. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المجالات الثقافات هي طريقة تستخدم على نطاق واسع لفحص سرطان الخلايا الجذعية إمكانيات وإثراء للخلايا الجذعية التي تشبه في مجموعة واسعة من الخلايا السرطانية البشرية 15،25،26. في ظل هذه الظروف والثقافة، ومن المتوقع أن يفرق والخضوع في النهاية موت الخلايا الخلايا السرطانية التي تفتقر إلى القدرة التجديد الذاتي. على الرغم من أنها قد تشكل في البداية مجموعات الخلايا أو حتى المجالات الورم خصوصا في المقايسات الابتدائية، فهي ليست قادرة على الحفاظ على القدرة على تشكيل المجال على replating التسلسلي نظرا لعدم وجود خصائص تجديد الذات. وتستخدم المجالات المقايسات كما فحوصات بديلة لتحديد الخلايا الجذعية السرطانية وتقييم وتيرتها في السكان خلية الورم بأكمله.
ومع ذلك، وتقلب كبير ويمكن ملاحظة بين المجالات المقايسات أديت التالية البروتوكولات نشرت مختلفة 5،10،27-35 (الجدول 1). في المختبر لدينا، ونحن قد نشرت في وقت سابق تشكيل المجال من خلايا سرطان المبيض الإنسان باستخدام MEGM تستكمل مع B-27، bFGF، الهيبارين وSingleQuot TM (التي تحتوي على الانسولين، rEGF والهيدروكورتيزون). مختبرات أخرى تستخدم كله DMEM / F12 المتوسطة، في حين أن إضافة بعض فقط B-27 و rEGF. في هذا التقرير، متعددة المجالات خلية القاعدة في فحص OVCAR-3 خلايا وبالتالي تتم باستخدام ظروف مختلفة. باستخدام MEGM أو DMEM / F12 مع جميع المكملات لم يلاحظ أي اختلاف كبير في تشكيل المجال في هذه الخلايا (الشكل 5A). وبالإضافة إلى ذلك، وتكهن بعض المختبرات التي EGF وجمعية جيل المستقبل قد يكون سريعا المتدهورة وأنشأت بروتوكولات إضافة هذه عوامل النمو يوميا إلى المتوسطة. لذلك فإننا مقارنة المجالات فحوصات أجريت في الوسط الذي تم إضافته EGF وجمعية جيل المستقبل فقط في بداية المجالات المقايسات مع اضافة اليومية للEGF وجمعية جيل المستقبل لزراعة الخلايا، ونجد هذه المقايسات لتسفر عن نتائج تعادل في الخلايا OVCAR-3 (لا تظهر البيانات)، مما يوحي بأن مكملات يومية مكلفة وشاقة مع EGF وجمعية جيل المستقبل قد لا يكون من الضروري دائما. ما إذا كانت هذه النتائجتنطبق على الخلايا عن غيرها من خطوط الخلايا السرطانية في المبيض أو العينات الأولية، أو في ظل ظروف تجريبية مختلفة ويبقى أن يحدد فيما بعد.
ومع ذلك، لاحظنا وجود تحيز كبير في أعداد المجالات وسجل عرضته آخر متغير اختبارها، وكثافة الطلاء الخلية. والمثير للدهشة، المصنفة الآبار مع انخفاض أعداد خلايا وأظهرت أرقام أعلى من المجالات. أدى الحد من التنقل خلية بنسبة 1٪ ميثيل في نفس كفاءة تشكيل المجال، مستقل على عدد الخلايا مطلي في البداية. وتشير هذه النتائج إلى أن تكتل الخلية ومجال الانصهار أو تفصيل يمكن أن يحدث تعديل أرقام المجال ويؤدي إلى نتائج غير دقيقة في خلية القاعدة متعددة المجالات المقايسات. عندما ومطلي الخلايا في كثافة المناسبة، المقايسات خلية مقرها متعددة ومع ذلك يؤدي إلى نتائج مماثلة إلى حد ما البيانات التي تم جمعها في واحدة المقايسات المجال القائم على الخلية (الشكل 4). لمزيد من استكشاف هذه النتائج قارنا مقرها خلية واحدة ومتعددةفحوصات باستخدام خلايا سرطان المبيض فرزها الى الخلايا الجذعية السرطانية المفترضة عبر RFP lentiviral نظام معربا عن مراسل نشرت مؤخرا لمنطقة تنظيمية SOX2 10. في الواقع، وأكدت على حد سواء المقايسات وتعزيز قدرة المجال الابتدائية والثانوية تشكيل RFP + مقابل خلايا RFP- (الشكل 4A، B). الأهم من ذلك، كانت الأرقام أعلى من المجالات لوحظ من RFP + خلايا يست بسبب قدرة التكاثري أعلى من الخلايا SOX2 التعبير (لا تظهر البيانات)، وهو ما يتماشى مع النتائج السابقة تبين أن تحريض SOX2 يعزز تشكيل المجالات وtumorigenicity الجسم الحي دون تسريع تقدم دورة الخلية 10.
أخذت معا، واحدة المجالات خلية مقرها المقايسات أكثر شاقة ومكلفة ولكنها تؤدي إلى بيانات أكثر دقة، وهو ما أكده أيضا استنساخ أعلى النتائج بين التجارب. منذ كثافة الطلاء عالية النتائج في التأثيرات المتعددة الخلايا السفلىإد تعليق المجالات المقايسات، مطلوب المعايرة مقدما من كثافة الطلاء كافية لكل نوع من الخلايا السرطانية الفردية قبل معايرة تشكيل المجال باستخدام هذه المقايسات. بدلا من ذلك، المقايسات القائم على خلية واحدة أكثر دقة يمكن استخدام مقدما، أو مكملات ميثيل لتحسين دقة النتائج عن طريق الحد من التحف الميكانيكية. إذا تم مقارنة تشكيل المجال بين الظروف التي يكون فيها التعديل الوراثي أو العلاج من تعاطي المخدرات قد تغير بشدة بقاء الخلايا، مما يقلل كثافة الخلايا، قد تكون واحدة المقايسات المجال خلية القاعدة إلزامية لتجنب نتائج إيجابية كاذبة.
وخلاصة القول، في ظل الظروف التجريبية المناسبة كل من متعدد خلية القاعدة مجالات الفحص واحد المجالات خلية القاعدة فحص قادرون تشير إلى الاختلافات في إمكانية المجال بين مختلف السكان الخلية (الجذعية والخلايا الجذعية غير). ومع ذلك، متعددة المجالات خلية مقرها المقايسات التي عادة تتم في الثقافات السائلة هي أكثر عرضة للالبريدrrors عرضته التصميم التجريبي من خلال كثافة الطلاء. مكملات من ميثيل (1٪) لفحوصات القائم على خلية متعددة يمكن أن تحد من القطع الأثرية ذات الصلة إلى الخلية التثاقل والانصهار المجال. بناء على هذه المعطيات، فإننا نوصي القائم على خلية واحدة المجالات المقايسات التي يتعين القيام بها ما لم تكن قد أجريت تحليلات مفصلة المعايرة تأثير مقدما والسلبي للظروف تجريبية على بقاء الخلية، وبالتالي تم استبعاد كثافة الخلايا خارج. ومع ذلك، واحدة المجالات خلية مقرها المقايسات أكثر شاقة وأكثر تكلفة، وربما لا تكون مطلوبة في كل إعداد التجريبية. تستكمل ميثيل متعددة خلية القاعدة المجالات المقايسات قد تمثل بديلا آخر في بعض الإعدادات التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
- Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
- Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
- Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
- Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
- Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
- Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
- Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
- Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
- Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
- Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
- Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
- Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
- Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
- Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
- Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
- Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
- Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
- Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
- Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
- Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).
