Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos

Published: January 3, 2015 doi: 10.3791/52259
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 2Department of Internal Medicine II, University Hospital Tübingen

Protocol

1. Generación de células humanas de carcinoma de ovario OVCAR-3 estable transduced con lentivirus que contiene el reportero construir Sox2 Región Reguladora

  1. Generar partículas lentiviral por transfección de la línea celular 293T-embalaje HEK con un reportero construir el reconocimiento de una región reguladora Sox2 descrita 10,21.
    NOTA: La construcción informadora contiene además un dominio de desestabilización del sistema de protección ProteoTuner por delante de la proteína de fluorescencia tdTomato. Shield1 se une al dominio de desestabilización evitando así que el proteasoma para degradar la proteína de fluorescencia 22.
  2. Transducir OVCAR-3 células con partículas lentivirales más de un período de tiempo de 24 hr. Después, eliminar el sobrenadante viral y lavar las células con tampón fosfato salino (PBS) y se cultivaron en medio completo (RPMI suplementado con 10% FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina).
  3. 48 horas más tarde, 10 mg / ml puromicina se añadieron a las culturas y se mantuvo durante 5 días para permitir la selección de células transducidas correctamente.

2. Preparación de la clasificación celular y Chapado

  1. Añadir Shield1 a escala 1: 1000 dilución 24 horas antes de la clasificación de células. Utilice células transducidas de forma estable OVCAR-3 sin tratamiento Shield1 como controles negativos (Figura 1). Aspirar los medios de frasco, lavar las células con PBS 1x y trypsinize células con 0,05% de tripsina-EDTA durante 3 min.
  2. Detener la tripsina mediante el uso de medio completo (véase más arriba), contar el número de células, centrifugar las células a 300 xg a temperatura ambiente (15 - 25 ° C) durante 5 min.
  3. Decantar el sobrenadante y volver a suspender las células cuidadosamente en 0,5 a 1 ml de PBS estéril.
  4. Utilice 40 micras filtro tapa filtro de células para obtener la suspensión de una sola célula.
  5. Ajuste el recuento de células a 5 millones de células por ml.
  6. Preparar bajo de fijación placas de ultra 96 ​​pocillos con 100 l esferas medio (MEGM suplementado con factores de crecimiento, citoquinas, y suplementos,B-27, heparina-sodio; o DMEM / F12 suplementado con factores de crecimiento, citoquinas, y suplementos, B-27, heparina-sodio con o sin adición de 1% de metilcelulosa, ver también la Tabla 1). Opcionalmente añadir antibióticos al medio a una concentración de 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina para reducir al mínimo el riesgo de posible contaminación.
  7. Ordenar células RFP- en placas de 96 pocillos preparados desde arriba + RFP y, 1 célula por pocillo (esferas ensayo basado en células individuales) y 100 células por pocillo (multi ensayo esferas basadas en células), respectivamente. Realizar clasificador de células tipo de venta en comercios (ver Materiales) usando el modo de célula única, Sort configuración: 100 μ boquilla, presión de funda 20 psi, y el rendimiento de la máscara 0, la máscara de pureza 32, máscara de fase 16.
  8. Evaluar la eficiencia chapado al anotar microscópicamente los pocillos que contenían células (para el ensayo basado en células individuales) y contando el número de células en pocillos individuales (para el ensayo basado en células múltiples; Figura 2
  9. Se incuban las células en condiciones estándar en esferas medianas (para la composición véase el paso 2.6) a 37 ° C y 5% de CO 2. Suplemento diario bFGF (20 ng / ml) y EGF (20 ng / ml).
  10. Después de una semana, contar números de emergente esferas tumorales utilizando un microscopio estándar con 4X o un aumento de 10X y un microscopio de fluorescencia para detectar la señal de fluorescencia del sistema reportero integrado. Cuente esferas con un diámetro superior a 100 micras como esferas "grandes", y esferas de diámetro 50 - 100 micras como esferas "pequeños" (Figura 3). Asegúrese de que usted cuenta esferas reales y no teléfonos clusters.
    NOTA: En los ensayos basados ​​en células individuales formación esfera es más fácil de marcar microscópicamente después de 10 (frente a 7) días de cultivo.
  11. Calcular la proporción de células de formación de esferas en RFP + y células, respectivamente RFP- en ensayos basados ​​en células individuales (una placa de 96 pocillos para cada experimento individual) o múltiples de células-baensayos sed esferas (uno así para cada experimento individual) expuestos por Shaw et al. 16
    NOTA: Proporción de formar esfera células (%) = (número de esferas) / (número de células sembradas) x 100

3. pasada en serie de esferas

  1. Coloque el contenido de cada pocillo en un tubo estéril apropiado y centrifugar a 300 xg durante 10 min a TA. Por esferas ensayos basados ​​en células múltiples, recoger juntos las esferas de un pozo. Lavar el bien de 3 - 5 veces con PBS y centrifugar 2 min más. Por esferas ensayos basados ​​en células individuales, recoger esferas individuales. Debido al bajo número de celdas, utilice tubos de 1,5 ml para las etapas de centrifugación y lavado.
  2. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 200 l de 0,05% de tripsina-EDTA.
  3. Con el fin de conseguir la separación óptima de la célula, se incuba la suspensión celular a 37 ° C durante 5 min en un agitador suave. Optimizar tripsinación hora de su línea celular a una menor tasa de muerte celular: si no hay grandesesferas es triturado visible suavemente con una punta de pipeta 100 l. En el caso de las grandes esferas todavía están presentes, se incuban con tripsina otros 3 min y luego proceder a la etapa de trituración. En caso de una sola ensayos basados ​​en células que asegúrese de optimizar el tiempo para el rendimiento óptimo de las células de las células vivas durante la etapa de tratamiento con tripsina.
  4. Para inactivar la tripsina, añadir 500 l de medio completo y se centrifuga a 300 xg durante 10 min, en el caso de ensayos de células individuales, se centrifuga durante 2 min adicionales.
  5. Eliminar las células sobrenadante y resuspender cuidadosamente en medio esferas.
  6. Utilice un filtro de tapón del filtro celular 40 micras para obtener una suspensión de una sola célula.
  7. En el caso de utilizar células RFP- en ensayos de células-bassed múltiples RFP + y, evaluar el porcentaje de células fluorescentes en cada pocillo después de la resuspensión citómetro de flujo a través de análisis.
  8. Para los ensayos de resiembra de serie de células individuales, semillas de 1 célula por pocillo en un nuevo bajo de fijación placa de 96 pocillos de ultra preparados como se detalla anteriormente. De una esfera individual, sembrar aproximadamente 20 pozos individuales. Para los ensayos de resiembra de múltiples esferas primarias basados ​​en células, las células de semillas obtienen a partir de un pocillo de esferas primarias en una nueva placa de 96 pocillos y contar el número de células por microscopía día siguiente.
  9. Evaluar la proporción de células de formación de esferas en ensayos de esferas secundarias utilizando la fórmula descrita en el paso 2,11.

Análisis 4. Resultado

  1. Analizar los resultados de los experimentos realizados por triplicado independientes y utilizar la prueba t de Student bilateral para analizar los valores normalmente distribuidos y de otro tipo de Mann-Whitney-Tests para el análisis estadístico.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En los ensayos de esferas convencionales, casi el 40% de RFP + OVCAR-3 células vs. 20% de las células RFP- dio lugar a una esfera tumor individual en el ensayo de esferas primaria (Figura 4A). Por otra parte, esferas formadas por las células RFP + eran más grandes en tamaño que los formados por células RFP-.

Cuando chapada en ensayos basados ​​en células individuales, células RFP + también formaron más esferas que las células RFP-, lo que confirma los resultados anteriores. Sin embargo, hubo una tendencia a la generación de un menor número de esferas por sembraron en la única versus el ensayo basado en células multi (Figura 4A, B), indicando que en este ensayo de formación de esferas pueden estar sesgados a través de artefactos técnicos tales como esfera de fusión o disociación mecánica en el medio de cultivo no adherente.

Para profundizar en estos aspectos, se comparó la influencia de la densidad de placas de células en la formación de esferas. Nos plateó células utilizando dilución límite de 1.000 células de 1 célula por pocillo en 96placas -bien y encontraron que el número de esferas emergentes eran altamente dependientes de los números de células sembradas inicialmente. Sorprendentemente, un mayor número de esferas se cuentan a partir de un menor número de células sembradas en tanto MGEM y DMEM / medios basados ​​en F12, lo que demuestra que las modalidades de hecho chapado altamente sesgar los resultados de este ensayo (Figura 5). En contraste, cuando las células se inmovilizaron mediante la adición de 1% de metilcelulosa a DMEM / F12 esferas a base de 23,24 medio de la eficiencia de formación de esferas era principalmente independiente de la densidad celular.

Para explorar la influencia de las condiciones de cultivo de las esferas en las propiedades de CSC, analizamos el porcentaje de células que expresan la señal de fluorescencia de color rojo después de 7 días de incubación en el ensayo de esferas. Se encontró que en esferas culturas basadas en células múltiples aproximadamente el 35% de las células de RFP + esferas perdió su señal de fluorescencia de color rojo después de siete días de cultivo (Figura 6), lo que sugiere que tienen UNDERGuna diferenciación, mientras que el 65% retenido un RFP + señal de lo que sugiere la capacidad de auto-renovación. En contraste, las células de esferas generados a partir de células inicialmente RFP- permanecieron negativos RFP (Figura 6A), lo que indica que no pueden volver a establecer el potencial de células madre en estas condiciones.

Microscopía de fluorescencia se realiza en las esferas generadas a partir de células individuales confirmó estos resultados muestran que las esferas individuales derivan RFP + células contenían ambos RFP células RFP- + y mientras esferas derivadas de células RFP- siendo negativas para la señal roja.

Se observaron resultados similares en los ensayos de resiembra de ambas condiciones.

Figura 1
Figura 1. Flujo de trabajo de lentiviral transducción, selección y clasificación de células RFP- RFP + y. Después de transducción lentiviral y selección positiva de células transducidas con éxito a través de la exposición a la puromicina, RFP- y las células del FPR + están ordenados por FACS en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos en un medio de esferas. Por esferas ensayos basados ​​en células múltiples, 100 células se colocan en un pocillo. Planchas de eficiencia se evalúa mediante microscopía realizados después de la clasificación. Esferas fueron anotados por microscopía después de siete a diez días, disocian en células individuales, analizadas mediante citometría de flujo y se volvieron a sembrar en esferas secundarias. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Imaging de RFP Ordenada células RFP- + y después de la siembra. RFP- células ordenados en cada pocillo de una placa de 96 pocillos RFP individual + y se analizan para la correcta mediante el uso de un recubrimiento (fluorescente) microscopio.w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
La formación de la Figura 3. Análisis de la formación de esferas en ensayos basados ​​en células individuales. Esferas se analiza después de siete a diez días. (A) Grande (diámetro> 100 micras) y (B) pequeño (diámetro de 50 - 100 micras). Esferas se distinguen microscópicamente basan en el tamaño Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Eficiencia de tumor esferas formación de RFP +y RFP- OVCAR-3 células en múltiples esferas frente ensayos basados ​​en células individuales. Comparación de la eficiencia esfera primaria y secundaria de las células OVCAR-3 como se ensayó en múltiples (A) frente a esferas ensayos basados ​​en células individuales (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. densidad de placas de la célula fuertemente impactos esfera cuenta de OVCAR-3 células en el ensayo basado en esferas multi-celda realizado en líquido, pero no en cultivos de metilcelulosa complementada. El uso de diferentes densidades de células y medios de cultivo han sido reportados en la literatura para el cáncer de ovario esferas ensayos. Para analizar los posibles sesgos introducidos por estas variables, las células se sembraron a diferedensidades nt en 200 l de diferentes medios de cultivo esferas (MGEM, DMEM / F12 con todos los suplementos que se detallan en la sección de protocolo o DMEM / F12 con todos los suplementos y contienen metilcelulosa 1%) y formación de esferas se obtuvo después de 7 días (A) . Se muestra en (B) son imágenes de microscopia de células sembradas en diferentes densidades tomadas un día después de chapado en DMEM / F12 spheres medio de cultivo sin metilcelulosa. Tenga en cuenta los grupos de células emergentes a alta densidad celular en comparación con las células individuales visto en placas de baja densidad. La barra de escala para las fotos:. 50 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Análisis de RFP de la señal en las esferas de tumor formado a partir de RFP + y respectively RFP- OVCAR-3 células (A) análisis de citometría de señal RFP en esferas disociadas derivadas de células RFP + y RFP- flujo (ensayo esferas basada en células múltiples.); (B) Microscopía de esferas derivadas de células RFP- (ensayo esferas basada en células individuales) RFP + y revela señal RFP heterogénea en los ámbitos derivados de RFP + pero no de células RFP-. Fotos fueron tomadas en el día 7 para las esferas convencionales y día 10 para los ensayos de esfera individuales basados ​​en células. Tenga en cuenta el mayor tamaño de las esferas derivadas de RFP + putativos CSC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fuente de células de cáncer de ovario humano Medio básico Suplementos Autores
OVCAR-3, Caov-3, material primario MEGM 20 ng / ml regf, 20 ng ml bFGF /, B-27, 4 mg / ml de heparina, la hidrocortisona, la insulina (kit SingleQuot) Bareiss et al.
SKOV3 DMEM / F12 5 mg / ml de insulina, 10 ng / ml regf, 10 ng / ml de bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% de BSA Li Ma et al.
A2780 DMEM / F12 5 mg / ml de insulina, 20 ng / ml regf, 2% de B-27, 0,4% de BSA Haiwei Wang et al.
SKOV3 DMEM / F12 5 mg / ml de insulina, 20 ng / ml regf, 10 ng / ml bFGF, 2% de B-27, 1 ng / ml de hidrocortisona Yong-Rui Du et al.
A2780, material primario DMEM / F12 5 mg / ml de insulina, 20 ng / ml regf, 10 ng / ml bFGF, 0,4% de BSA T. Xiang et al.
Material de Primaria DMEM / F12 > 5 mg / ml de insulina, 10 ng / ml regf, 10 ng / ml de bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% de BSA Te Liu et al.
MLS DMEM / F12 10 ng / ml de insulina, 20 ng / ml regf, 20 ng ml bFGF /, 2% de B-27 Soritau et al.
3AO DMEM / F12 1 mg / ml de insulina, 20 ng / ml regf, 20 ng ml bFGF /, 2% de B-27 MF Shi et al.
Material de Primaria DMEM / F12 5 mg / ml de insulina, 20 ng / ml regf, 10 ng / ml bFGF, 0,4% de BSA Shu Zhang et al.
Material de Primaria EBM-2 o X-VIVO 5 mg / ml de insulina, 20 ng / ml regf Ilona Kryczek et al.
OVCAR-3 MEGM 20 ng / ml regf, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 mg / ml de heparina Dongming Liang et al.
ontenido "> Cuadro 1. Ejemplos de diferentes fuentes de células (líneas de células y tejidos primarios derivados de la paciente), medios de comunicación y suplementos utilizados para los ensayos de esferas de ovario en informes anteriores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Culturas esferas son un método ampliamente utilizado para ensayar el potencial de células madre de cáncer y enriquecer para las células-madre como en una amplia gama de células tumorales humanas 15,25,26. Bajo estas condiciones de cultivo, se espera que las células cancerosas que carecen de la capacidad de auto-renovación de diferenciar y eventualmente someterse a la muerte celular. Aunque pueden formar inicialmente grupos de células o incluso esferas tumorales especialmente en ensayos primarios, no son capaces de sostener de formación de esferas facultad nada replating serie debido a la falta de propiedades de auto-renovación. Ensayos de esferas se utilizan como ensayos sustitutos para identificar células madre cancerosas y evaluar su frecuencia en poblaciones de células tumorales enteras.

Sin embargo, la variabilidad sustancial se puede observar entre los ensayos de esferas realiza siguiendo diferentes protocolos publicados 5,10,27-35 (Tabla 1). En nuestro laboratorio, hemos publicado previamente formación de esferas de células de carcinoma de ovario humano utilizando MEGM complementados con B-27, BFGF, heparina y SingleQuot TM (que contiene insulina, regf e hidrocortisona). Otros laboratorios utilizan todo medio DMEM / F12, mientras que algunos añaden único B-27 y regf. En este informe, múltiples esferas ensayo basados ​​en células en OVCAR-3 células, por lo tanto se realizaron con diferentes condiciones. Utilizando MEGM o DMEM / F12 con todos los suplementos no se observó diferencia significativa en la formación de esferas en estas células (Figura 5A). Además, algunos laboratorios han especulado que EGF y FGF pueden ser rápidamente degradada y han establecido protocolos de la adición de estos factores de crecimiento diario al medio. Por lo tanto, comparamos los ensayos de esferas realizados en un medio en el que se añadió EGF y FGF sólo al comienzo de los ensayos de esferas con adición diaria de EGF y FGF para el cultivo celular, y encontramos estos ensayos para producir resultados equivalentes en las células OVCAR-3 (datos no presentados), lo que sugiere que la suplementación diaria caro y laborioso con EGF y FGF puede no ser siempre necesario. Si estos resultadosson aplicables a las celdas de otras líneas celulares de cáncer de ovario o muestras primarias, o bajo diferentes condiciones experimentales que queda por determinar.

Sin embargo, se observó un sesgo sustancial en el número de esferas marcados introducidos por otra variable probado, la densidad de placas de células. Sorprendentemente, los pocillos sembrados con un menor número de células mostraron un mayor número de esferas. La limitación de la movilidad celular por 1% de metilcelulosa resultó en la misma eficiencia de la formación de esfera, independiente del número de células sembradas inicialmente. Estos resultados sugieren que la aglutinación de células y esfera fusión o desagregación pueden ocurrir modificar los números de la esfera y que conduce a resultados imprecisos en esferas ensayos basados ​​en células múltiples. Cuando las células se colocaron en placas a la densidad adecuada, ensayos basados ​​en células múltiples sin embargo conducen a resultados bastante comparables a los datos recogidos en los ensayos de esfera individuales basados ​​en células (Figura 4). Para profundizar en estos resultados se compararon basada en células individuales y múltiplesensayos usando células de carcinoma de ovario ordenados en CSC putativos a través de un sistema indicador que expresa RFP lentiviral recientemente publicado por una región reguladora Sox2 10. De hecho, ambos ensayos confirmaron la mejora de la capacidad primaria y secundaria esfera formación de RFP + frente a las células RFP- (Figura 4A, B). Es importante destacar que los números más altos de esferas observadas a partir de células RFP + no se debían a una mayor capacidad proliferativa de las células SOX2 expresar (datos no mostrados), que está en línea con los resultados anteriores que muestran que la inducción de SOX2 promueve esferas formación y en la tumorigenicidad in vivo sin acelerar progresión del ciclo celular 10.

Tomados en conjunto, los ensayos individuales esferas basadas en células son más laborioso y costoso pero dan como resultado datos más precisos, lo que se confirma también por la mayor reproducibilidad de los resultados entre los experimentos. Desde densidad de placas altamente influye en los resultados en la célula multi-based suspensión esferas ensayos, se requiere la titulación inicial de densidad de placas adecuado para cada tipo de célula tumoral individual antes de ensayar la formación de esferas usando estos ensayos. Alternativamente, los ensayos basados ​​en células individuales más precisos pueden ser utilizados por adelantado, o la administración de suplementos de metilcelulosa para mejorar la precisión de los resultados mediante la reducción de artefactos mecánicos. Si la formación esfera se comparó entre condiciones en las que la modificación genética o tratamiento de drogas pueden alterar gravemente la viabilidad de las células, disminuyendo así la densidad celular, ensayos de esfera individuales basados ​​en células pueden ser obligatorios para evitar resultados falsos positivos.

En resumen, bajo condiciones experimentales adecuadas tanto la de múltiples esferas ensayo basado en células y el único ensayo esferas basadas en células son capaces de indicar diferencias en el potencial de la esfera entre las diferentes poblaciones de células (madre y células no madre). Sin embargo, esferas basadas en células ensayos múltiples que comúnmente se llevan a cabo en cultivos líquidos son más susceptibles al correorrors introducidas por el diseño experimental a través densidad de placas. La suplementación de metilcelulosa (1%) para ensayos basados ​​en células múltiples puede limitar artefactos relacionados a la celda aglutinación y fusión esfera. Con base en estos datos, recomendamos esferas ensayos basados ​​en células individuales que se deben realizar a menos que se han realizado análisis detallados de valoración de impacto por adelantado y negativo de las condiciones experimentales sobre la viabilidad celular y por lo tanto la densidad de células se ha descartado. Sin embargo, los ensayos individuales esferas basadas en células son más laboriosos y más caro, y no podrían ser necesarias en cada configuración experimental. Múltiples esferas ensayos basados ​​en células de metilcelulosa suplementada pueden representar una alternativa en algunos parámetros experimentales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low-attachment plate Corning 3474
MEGM Lonza CC-3151
Insulin Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
Hydrocortisone Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
EGF Lonza CC-4136 SingleQuots™ Kit
EGF Sigma E9644 end concentration: 20 ng/ml
FGF PeproTech 100-18B end concentration: 20 ng/ml
B-27 Invitrogen/ Gibco 17504-044 end concentration: 1X
Heparin-Natrium-25000 IE Ratiopharm N68542.02 dilution 1:1,000
Pen/Strep Gibco 15140-122
FCS Gibco 10500-064
RPMI 1640 Gibco 21875-034
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Dulbecco’s PBS (1X) Gibco 14190-094
Shield1 Clontech 632189 dilution 1:1,000
DMEM/F12 Gibco 21041-025
DMEM/F12 (powder) Gibco 42400-010
Methyl cellulose Sigma M0387
Puromycin dihydrochloride Applichem A2856
Cell sorter BD Aria III cell sorter
FACS analyser BD Accuri c6 flow cytometer
Microscope Olympus IX50 Osiris

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
  2. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  3. Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
  4. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
  5. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
  6. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  7. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  8. Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
  9. Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
  10. Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
  11. Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
  12. Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
  13. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  14. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  15. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  16. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  17. Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
  18. Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
  19. Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
  20. Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
  21. Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
  22. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  23. Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
  24. Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
  25. Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
  26. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
  27. Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
  28. Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
  29. Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
  30. Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
  31. Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
  32. Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
  33. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  34. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  35. Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).

Tags

Medicina Número 95 las células madre del cáncer Esferas ensayo de ovario de una sola célula Sox2, carcinoma de ovario
Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. … More

Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays. J. Vis. Exp. (95), e52259, doi:10.3791/52259 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter