Enkle metode til fluorescens DNA<em> In Situ</em> Hybridisering til mast kromosomer

Summary

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Abstract

DNA in situ hybridisering (DNA ISH) er en almindeligt anvendt metode til kortlægning sekvenser til specifikke kromosomområder. Denne fremgangsmåde er særlig effektiv til at kortlægge stærkt repetitive sekvenser til heterochromatic regioner, hvor beregningsmæssige metoder står uoverkommelige udfordringer. Her beskriver vi en strømlinet protokol for DNA ISH der omgår formamid vaske, der er standard trin i andre DNA ISH-protokoller. Vores protokol er optimeret til hybridisering med korte enkeltstrengede DNA-prober, der bærer fluorescerende farvestoffer, som effektivt markerer repetitive DNA sekvenser i heterochromatic kromosomale regioner i en række forskellige insekt vævstyper. Dog kan ansøgninger forlænges til brug med større sonder og visualisering af enkelt kopi (ikke-repetitive) DNA-sekvenser. Vi viser denne metode ved at kortlægge flere forskellige repetitive sekvenser til knust kromosomer fra Drosophila melanogaster neurale celler og Nasoniavitripennis spermatocytter. Vi viser hybridiseringsmønstre til både små, kommercielt syntetiserede prober og for en større sonde til sammenligning. Denne procedure bruger simple laboratorium leverancer og reagenser, og er ideel til efterforskere, der har lidt erfaring med at udføre DNA ISH.

Introduction

DNA in situ hybridisering (DNA ISH) er en almindeligt anvendt metode til kortlægning sekvenser til specifikke kromosomområder. Sonder til enlige kopi regioner inden euchromatin kan genereres gennem en håndfuld af tilgange, herunder nick-translation eller ende-mærkning af lange DNA-produkter ^1,2 og indarbejdelsen af deoxygenin (DIG) -attached nukleotider og deres anerkendelse gennem en bred vifte af gruppevise konjugerede antistoffer ^1-3. Visualisering af euchromatic sekvenser i få eller enkelt eksemplar nummer kræver brug af enten enkelte, store prober med høj specifik aktivitet eller en cocktail af flere, mindre sonder, som tilsammen øger signal.

I modsætning hertil meget repetitive sekvenser findes i heterochromatin, såsom satellit DNA'er, er lettere mål for DNA ISH fordi de normalt eksisterer som ti til tusindvis af gentagelser grupperet i enkelte kromosomområder kendt som blokke. Transposoner kan også værefundet ved høje kopiantal på særskilte kromosomale loci ^2. I disse tilfælde kan en enkelt prober med lav specifik aktivitet effektivt mærke heterochromatic sekvenser på grund af deres hybridisering ved multiple sites. Prober til repetitive sekvenser kan syntetiseres kommercielt som korte oligonukleotider (30-50 bp) og kemisk konjugeret med enhver af flere forskellige fluorescerende grupper. Kortlægning repetitive sekvenser inden heterochromatin ved at bruge genom-sekventering teknologier er vanskelig på grund af udfordringerne er stødt på i bygning stilladser indenfor meget gentagne satellit blokke ^4-6,7. I øjeblikket ISH står som den mest effektive måde at kortlægge disse sekvenser på sub-kromosom-niveau. Denne strategi er vigtig for at kortlægge et stort antal repetitive sekvenser, der bliver afsløret løbende genom og transkriptom sekventering studier.

Effektiviteten og nem kortlægning repetitive sekvenser på slide-monterede kromosomer ville greatly forstærket af en forenklet protokol for DNA ISH. For eksempel de eksisterende protokoller for DNA ISH involverer flere vaske af hybridiseret væv i formamid løsning ^2,8, således at tilføje væsentligt til den krævede tid til kortlægning sekvenser og også producerer store mængder kemisk affald for dette dyre reagens. Her beskriver vi en revideret DNA ISH metode, omgår behovet for formamid vaske og udnytter grundlæggende laboratorieudstyr og reagenser. Denne fremgangsmåde blev oprindeligt udviklet til hurtig kortlægning af stærkt repetitive DNA-sekvenser i heterochromatic regioner af Drosophila larvestadiet neuroblasts ved anvendelse af kommercielt syntetiserede oligoer, der er konjugeret med fluorescensfarvestoffer. Men denne metode fungerer også til kortlægning repetitive sekvenser ved at anvende større prober syntetiseret ved andre midler ^9,10 og på tværs af flere forskellige væv og kromosom typer. Derudover kan denne fremgangsmåde anvendes til at kortlægge euchromatic sekvenser ved hjælp af længere eller multiple, korte sonder i euchromatic sekvens af interesse.

Protocol

1. Tissue Dissektion og fiksering (60 min) For Drosophila hjerner, placere 3. instar larver i en dråbe 1x PBS (phosphatbufret saltvand). Vælg stor 3. instar larver, der aktivt kravler fra hætteglas eller flasker, der ikke er overfyldte. Brug en ultrafine pincet par at gribe fat i munden kroge og andet pincet par at Grib 2/3 ned på længden af kroppen (figur 1A, B). Træk forsigtigt på munden kroge til at udsætte hjernen, ventrale ganglier, spytkirtler og e…

Representative Results

For at demonstrere denne fremgangsmåde vi hybridiserede et sæt af små kommercielt syntetiserede oligoer, der var kemisk modificeret med fluorescerende konjugater (figur 2), og en længere biotinyleret probe (fremstillet ved nick-translation af et PCR-produkt, figur 2B), til kromosomer fra flere forskellige væv typer (se tabel 1). Målsekvenserne inkluderet satellit gentagelser placeret i pericentromeric (heterochromatic) regioner af mitotiske kromosomer fra D. m…

Discussion

DNA ISH bruges ofte til at kortlægge specifikke sekvenser til kromosomer. Vi har beskrevet en enkel metode til DNA ISH optimeret til højt kopiantal, heterochromatic sekvenser. Snarere end at bruge vaske i en formamid løsning, som er et krav i andre eksisterende DNA ISH-protokoller, lægger vi væv-monterede dias direkte på en forvarmet blok til denaturere DNA. Denne metode omgår anvendelsen af ​​store mængder af formamid. Et afgørende skridt for at producere skarpe hybridiseringssignaler er at bruge frisklave…

Materials

	Company
Materials
Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)	Sigma Aldrich
Ultrafine tweezers (5 gauge)	Dumont
22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear	Fisher
Sigmacote	Sigma
Filter paper (75-150mm)
Paraffin wax paper
Heat block with thermometer
Dry incubator
Razor blades
Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes)
Coplin jars (with slide grooves)
Aluminum foil
Pasteur pipettes
1.5 mL microfuge tubes
Nail polish (clear or colored)
2-20 μL micropipette and plastic tips
20-25 standard metal paperclips linked to form a chain
	Company/Notes
Reagents
16% EM grade paraformaldehyde	Electron Microscopy Reagents
Acetic acid	Sigma
Liquid nitrogen
100% Ethanol, chemical grade
Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos
Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen)	Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3
Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe)	Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3
Hybridization buffer	Recipe below
4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween)	Recipe below
0.1X SSC (Saline-sodium citrate)	Recipe below
Blocking solution	Recipe below
SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween)	Recipe below
1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween)	Recipe below
1X PBS (Phosphate-buffered saline)
Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O)
Formamide	Sigma Aldrich
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector laboratories