Enkel metod för fluorescens-DNA<em> In situ</em> Hybridisering till kläm Kromosomer
Summary
Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.
Abstract
DNA in situ-hybridisering (DNA-ISH) är en vanligt använd metod för kartläggning sekvenser till specifika kromosomområden. Detta tillvägagångssätt är särskilt effektiv vid kartläggning mycket repetitiva sekvenser till heterochromatic regioner där beräkningsmetoder inför oöverkomliga utmaningar. Här beskriver vi en strömlinjeformad protokoll för DNA ISH som kringgår formamid tvättar som är standard stegen i andra DNA ISH-protokoll. Vårt protokoll är optimerat för hybridisering med korta enkelsträngat DNA-prober som bär fluorescerande färgämnen, som effektivt markerar repetitiva DNA-sekvenser inom heterochromatic kromosomala regioner över ett antal olika typer insektsvävnads. Dock kan program utökas för att använda med större prober och visualisering av enstaka exemplar (icke-repetitiva) DNA-sekvenser. Vi visar denna metod genom att kartlägga flera olika repetitiva sekvenser till klämd kromosomer från Drosophila melanogaster neurala celler och Nasoniavitripennis spermatocyter. Vi visar hybridiseringsmönster för både små, kommersiellt syntetiserade sonder och för en större sond för jämförelse. Denna procedur använder enkla laboratorieutrustning och reagenser, och är idealisk för utredare som har liten erfarenhet av att utföra DNA ISH.
Introduction
DNA in situ-hybridisering (DNA-ISH) är en vanligt använd metod för kartläggning sekvenser till specifika kromosomområden. Probes till lösnummer regioner inom eukromatin kan genereras genom en handfull metoder, inklusive nick-translation eller slut märkning av långa DNA-produkter 1,2 och införlivandet av deoxygenin (DIG) -attached nukleotider och deras erkännande genom ett brett utbud av grupp-konjugerade antikroppar 1-3. Visualisering av euchromatic sekvenser i få eller enstaka kopia nummer kräver användning av antingen enkla, stora sonder med hög specifik aktivitet eller en cocktail av flera, mindre sonder som kollektivt förbättrar signal.
Däremot mycket repetitiva sekvenser som finns i heterokromatin, såsom satellit-DNA, är lättare mål för DNA ISH eftersom de finns normalt som tiotals till tusentals upprepningar klustrade i enstaka kromosomområden som kallas block. Transposabla element kan också varafinns i höga kopietal vid distinkt kromosom loci 2. I dessa fall, kan enkel prober med låg specifik aktivitet effektivt märka heterochromatic sekvenser på grund av deras hybridisering på multipla ställen. Prober till repetitiva sekvenser kan syntetiseras kommersiellt som korta oligonukleotider (30-50 bp) och kemiskt konjugerad med någon av flera olika fluorescerande grupper. Kartläggning repetitiva sekvenser inom heterokromatin genom genomet-sekvenseringsteknologier är svårt på grund av utmaningar som uppstått i byggställningar inom mycket repetitiva satellitblock 4-6,7. För närvarande står ISH som det mest effektiva sättet att kartlägga dessa sekvenser på en sub-kromosomnivå. Denna strategi är viktigt för att kartlägga ett stort antal repetitiva sekvenser som håller avslöjats av pågående genomet och transkriptom sekvensestudier.
Effektiviteten och enkel kartläggning repetitiva sekvenser på glidmonterade kromosomer skulle greatly förbättras genom ett förenklat protokoll för DNA ISH. Till exempel, befintliga protokoll för DNA ISH involverar flera tvättar av hybridiserade vävnader i formamidlösning 2,8, vilket bidrar väsentligt till den tid som krävs för kartläggning sekvenser och även producera stora mängder kemiskt avfall för denna kostsamma reagens. Här beskriver vi en reviderad DNA ISH metod som kringgår behovet av formamid tvättar och utnyttjar grundläggande laboratorieutrustning och reagenser. Denna metod var ursprungligen avsedd för snabb kartläggning av mycket repetitiva DNA-sekvenser i heterochromatic regioner av Drosophila larver neuroblaster genom kommersiellt syntetiserade oligonukleotider som är konjugerade med fluorescens färgämnen. Men denna metod fungerar även för att kartlägga repetitiva sekvenser genom att använda större prober syntetiserade på andra sätt 9,10 och över flera olika vävnads och kromosomtyper. Dessutom kan denna metod användas för att kart euchromatic sekvenser genom användning av längre eller multiple, korta sönder inom euchromatic sekvensen av intresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA ISH används ofta för att kartlägga specifika sekvenser till kromosomer. Vi har beskrivit ett enkelt förfarande för DNA-ISH optimerad för högt kopietal, heterochromatic sekvenser. Istället för att använda tvättar i en formamidlösning, vilket är ett krav i andra befintliga DNA ISH-protokoll, placerar vi vävnads monterade diabilder direkt på en förvärmd blocket att denaturera DNA. Denna metod kringgår användning av stora mängder formamid. Ett kritiskt steg för att producera skarpa hybridiseringssig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.
Materials
| Company | |
| Materials | |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich |
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont |
| 22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | Fisher |
| Sigmacote | Sigma |
| Filter paper (75-150mm) | |
| Paraffin wax paper | |
| Heat block with thermometer | |
| Dry incubator | |
| Razor blades | |
| Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes) | |
| Coplin jars (with slide grooves) | |
| Aluminum foil | |
| Pasteur pipettes | |
| 1.5 mL microfuge tubes | |
| Nail polish (clear or colored) | |
| 2-20 μL micropipette and plastic tips | |
| 20-25 standard metal paperclips linked to form a chain | |
| Company/Notes | |
| Reagents | |
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents |
| Acetic acid | Sigma |
| Liquid nitrogen | |
| 100% Ethanol, chemical grade | |
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |
| Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen) | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe) | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 |
| Hybridization buffer | Recipe below |
| 4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween) | Recipe below |
| 0.1X SSC (Saline-sodium citrate) | Recipe below |
| Blocking solution | Recipe below |
| SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween) | Recipe below |
| 1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween) | Recipe below |
| 1X PBS (Phosphate-buffered saline) | |
| Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O) | |
| Formamide | Sigma Aldrich |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories |
References
- Blattes, R., Kas, E. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
- Dimitri, P. Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila. Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).
- Pardue, M. L. In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).
- Hoskins, R. A., et al. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biology. 3 (12), (2002).
- Hoskins, R. A., et al. Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).
- Treangen, T. J., Salzberg, S. L. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).
- He, B., et al. Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster. Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).
- Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura. Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).
- Ferree, P. M., Barbash, D. A. Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila. PLoS Biology. 7 (10), e1000234 (2009).
- Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset. The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).
- Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes. Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
