Abstract
لتحسين فعالية العلاجية لزرع الخلايا، وقد تم تطوير نظام زرع المعدلة وراثيا، الكروية عن طريق الحقن. يتم إعداد الكروية خلية في نظام الثقافة على لوحات micropatterned المغلفة مع البوليمر للحرارة. يتم تشكيل عدد من الكروية على لوحات، والمقابلة لمناطق التصاق الخلية من 100 ميكرون قطر التي تصطف بانتظام بطريقة ثنائية الأبعاد التي تحيط بها مناطق غير لاصقة التي المغلفة من قبل غليكول البولي ايثيلين (PEG) المصفوفة. الأجسام الشبه الكروية يمكن استردادها بسهولة كما وقف السائل عن طريق خفض درجة حرارة لوحات، وكذلك صيانة بنيتها عن طريق تمرير من خلال إبر الحقن من عيار كبير بما فيه الكفاية (أكثر من 27 G). ويتحقق التعديل الوراثي قبل ترنسفكأيشن الجينات باستخدام الناقل الأصلي غير الفيروسية الجين، nanomicelle polyplex، وهو قادر على إدخال الجينات إلى الخلايا دون تعطيل هيكل كروي. لمتزمتالكروية الكبدية آرى مع transfected الجين، معربا عن luciferase المراسل، يتم الحصول على luciferase المراسل مستدام في الحيوانات المزروعة، جنبا إلى جنب مع الحفاظ على وظيفة خلايا الكبد، كما يتضح من التعبير الألبومين. هذا النظام يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا الجذعية الوسيطة.
Introduction
وقد اجتذب العلاج زرع الخلايا باهتمام واسع لعلاج العديد من الأمراض المستعصية. النشاط ونصف العمر من العوامل الحيوية النشطة التي تفرزها الخلايا المزروعة ضرورية لتحسين الفعالية العلاجية للنظام زرع الخلايا. التعديل الوراثي للخلايا قبل الزرع هو تقنية مفيدة لتنظيم والتلاعب الوظائف الخلوية، بما في ذلك إفراز العوامل النشطة بيولوجيا. ومن المهم أيضا للحفاظ على المكروية مواتية للخلايا لتجنب موت الخلايا أو فقدان نشاط الخلايا. ثلاثي الأبعاد الثقافة (3D) خلية كروي، والتي الخلية الى خلية التفاعلات يتم الحفاظ عليها بشكل جيد، واعد لهذا الغرض، على سبيل المثال، لتحسين إفراز الزلال من خلايا الكبد الأولية وتعزيز متعددة النسب تمايز من الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة ) 1-7.
في هذه الدراسة، وهو نظام تركيبة جديدة من spheroiيستخدم الثقافة د وترنسفكأيشن الجينات لتكون بمثابة منصة لزرع الخلايا المعدلة وراثيا. لخلق خلايا كروي، يتم استخدام نظام الثقافة كروي على لوحات ثقافة micropatterned. في هذه اللوحات، والمحتشدة المناطق التصاق الخلية من 100 ميكرون قطر بانتظام بطريقة ثنائية الأبعاد، وتحيط بها مناطق غير لاصقة المغلفة من قبل مصفوفة PEG 3. قبل البذر وجود عدد كاف من الخلايا، وتشكل صفائف الكروية 3D من 100 ميكرون في القطر المقابلة للسرير الثقافة micropatterned.
واستعاد الكروية دون تعطيل هيكلها 3D باستخدام حساس للحرارة لوحات لزراعة الخلايا، التي تم المغلفة مع البوليمر للحرارة، وبولي (ISO-propylacrylamide) (PIPAAm) 10/08. هي التي شيدت بنية micropatterned على لوحات للحرارة (مبنية خصيصا). ببساطة عن طريق خفض درجة حرارة لوحات، ويتم فصل الكروية من السرير الثقافة وتفريقد في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). وبالتالي، يمكن الحصول على عدد كبير من الأجسام الشبه الكروية مع حجم موحد من 100 ميكرون في شكل تعليق عن طريق الحقن.
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للنظام الثقافة كروي على طبق من ذهب micropatterned. ويتحقق التعديل الوراثي قبل ترنسفكأيشن الجينات باستخدام الناقل الجيني غير الفيروسي الأصلي، nanomicelle polyplex. وهو يتألف من البلازميد الحمض النووي (PDNA) والبولي ايثيلين جلايكول (PEG) بوليمرات كتلة -polycation 11. هذه لديها بنية الأساسية قذيفة مميزة تتكون من قذيفة PEG والنواة الداخلية للPDNA المكثف، مما يسمح آمنة وفعالة إدخال الجينات إلى داخل الخلايا لأغراض علاجية (11). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من ثيالصورة الرقم.
الشكل 2. هيكل nanomicelle polyplex التي شكلتها مجمع الأحماض النووية وبوليمرات كتلة PEG-كتلة polycation. في هذه الدراسة، والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن هيكل كروي لا تتعطل خلال ترنسفكأيشن الجينات التي nanomicelles. بعد transfections بوساطة nanomicelle من الفئران الكروية الكبدية الأولية، ويتم الحصول على فترات طويلة التعبير التحوير لأكثر من شهر مع إفراز الزلال المستمر من خلايا الكبد في مستوى مماثل لتلك التي الكروية untransfected 12. يتم الاحتفاظ أيضا التعبير التحوير وإفراز الزلال من الكروية بعد الشفاء من لوحات للحرارة. ومن الواضح أن nanomicelles يمكن أن تسهل بأمان إدخال الجين دون أن ينال من وظائف الفطرية من التهاب الكبدatocytes. وبالتالي، فإن الجمع بين خلايا كروي مثقف على لوحات micropatterned للحرارة مع إدخال الجينات باستخدام nanomicelles هو منصة واعدة لزرع الخلايا المعدلة وراثيا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات الحيوانية بموافقة لجنة رعاية الحيوان واستخدام من جامعة طوكيو، طوكيو، اليابان.
1. خلية التحضير
- لخلايا الكبد الأولية، واتباع بروتوكول لالكبدية بمعزل عن الفئران عن طريق تعديل خطوتين عملية الهضم كولاجيناز 13،14.
- تخدير سبراغ داولي (SD) الفئران (ذكور، 5 أسابيع من العمر) تحت التخدير استنشاق مع isoflurane. وضع فأر في غرفة متصلة آلة التخدير لتوفير الأيزوفلورين للغرفة. إخراج الفئران بعد النوم، ووضعه على طاولة العمليات مع التهوية باستخدام قناع. السيطرة على الأيزوفلورين تدفق ما يقرب من في 0،4-0،7 لتر / دقيقة عن طريق التحقق من شروط الفئران. يروي الكبد من سبراج داولي (SD) الفئران (ذكور، 5 أسابيع من العمر) من الوريد البابي الكبدي بمحلول خاص مكون من 8 جرام / لتر كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)، و 400 ملغم / لتر كلوريد البوتاسيوم (بوكل)، 78 ملغ / Lالصوديوم ثنائي الهيدرات فوسفات هيدروجين (ناه 2 PO 4 · 2H 2 O)، و 151 ملغم / لتر ثنائي dodecahydrate فوسفات الهيدروجين (نا 2 هبو 4 · 12H 2 O)، 2.38 غ / L 2- [4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1 -piperazinyl] حامض ethanesulfonic (HEPES)، 190 ملغ / L جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic (EGTA)، و 350 ملغم / لتر كربونات الصوديوم الهيدروجينية (NaHCO 3)، و 900 ملغ / L الجلوكوز.
- تعميم حل كولاجيناز عن طريق الكبد.
ملاحظة: يتكون الحل من 500 ملغ / L كولاجيناز، 9.8 جم / الملح L هانك مخزنة، 2.38 جم / مل HEPES، 556 ملغ / مل كلوريد الكالسيوم هيدرات (CaCl 2 · H 2 O)، و 350 ملغ / L NaHCO 3، و 50 ملغ / L مثبط التربسين، مع درجة الحموضة تعديلها إلى 7.2. - إزالة الكبد بعناية، واللحم المفروم برفق على طبق باستخدام شفرة مشرط، إضافة Dulbecco لتعديل متوسطة النسر (DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، وتصفية تعليق الخلية من خلال 100 ميكرونشبكة من النايلون. لإزالة الحطام إضافي، الطرد المركزي تعليق خلية في 20 × ز لمدة 1 دقيقة. في هذه الخطوة، خلايا الكبد هي في طاف.
- كرر الخطوة الطرد المركزي مرتين (أي ما مجموعه ثلاثة centrifugations). أخيرا، الطرد المركزي الخلايا الكبدية في 50 × ز لمدة 3 دقائق لاستعادة لهم في شكل بيليه.
- اعادة تعليق الخلايا الكبدية إلى تركيز 4 × 10 5 خلية / مل في مستنبت خاص يتألف من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS، 1٪ القلم بكتيريا-تخمة (PSQ)، 1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، 0.1 ميكرومول / L ديكساميثازون، و 0.5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 10 مليمول / لتر نيكوتيناميد، 0.2 مليمول / لتر أسكوربات فسفرته (ASC-2P)، و 10 نانوغرام / مل عامل النمو البشري البشرة (hEGF) 15. هذه الوسيلة خاص إلزامي للحفاظ على وظائف الكبد في ظل ظروف في المختبر.
- للحصول على اللجان الدائمة الفئران، الموت ببطء سبراغ داولي (SD) الفئران (ذكور، 5 أسابيع من العمر) من قبل إدارة مفرطة من isoflurانو. بتر في عظام الفخذ وtibias، وجمع الكوسا العظام عن طريق إدخال 22 G الإبرة في رمح من العظام لطرد بها مع 10 مل من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS. جمع الخلايا عن طريق الترشيح من خلال 100 ميكرون شبكة من النايلون.
- البذور الخلايا على أطباق 10 سم ثقافة استخدام DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. للتجارب كروي، استخدم اللجان الدائمة في 5 مقاطع.
2. إعداد 3D الأجسام الشبه الكروية خلية
- تجاريا الحصول على لوحات ثقافة micropatterned، التي تصطف المناطق خلية لاصقة بانتظام في 100 ميكرون قطرها بطريقة ثنائية الأبعاد، وتحيط بها مناطق غير لاصقة المغلفة من قبل مصفوفة PEG.
ملاحظة: للحصول على زرع الخلايا، طلاء إضافي مع البوليمر PIPAAm للحرارة ضروري للسماح للانفصال الخلايا عن طريق التبريد لوحات (راجع الخطوة 5.1). يمكن أن التقلبات في درجات الحرارة تحدث تغييرات في كيمياء البوليمرات هذا8-10. في 37 ° C، PIPAAm هو مسعور قليلا، مما يسمح للخلايا ليتم تربيتها في ظل ظروف طبيعية. انخفاض في درجة حرارة أقل من 32 ° C النتائج في ترطيب السريع من البوليمر، مما أدى إلى انفصال عفوية من الخلايا. - البذور خلايا الكبد أو اللجان الدائمة على لوحات 12-جيدا micropatterned في كثافة 4 × 10 5 خلايا / جيد andincubate لهم عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2. الخلايا سوف تتراكم في مناطق التصاق micropatterned وتشكل تدريجيا الكروية مستديرة في 2 يوما.
ملاحظة: لإعداد الخلايا السيطرة في ثقافة أحادي الطبقة، استخدم العادية لوحات 12-جيدا والبذور الخلايا في كثافة مماثلة، وذلك بعد إجراء مماثل كما هو موضح أعلاه.
3. إعداد Polyplex Nanomicelles
- توليف كوبوليمر كتلة، PEG-PASP (ديت) (بولي [N '- [N - (2-aminoethyl) -2-aminoethyl] aspartamide]) (PEG ميغاواط = 12،000، درجة البلمرة (DP) من PASP (ديت) الجزء = 59)، والمبلمر المتجانس الذي يتكون من فقط الجزء الموجبة [PASP (ديت)] (DP = 55)، وفقا للإجراءات التي سبق وصفها من قبل المؤلفين 11، 16، 17.
- يعد حل المختلط للPEG-PASP (ديت) كتلة من البوليمرات وPASP (ديت) المبلمر المتجانس في نسبة المولي متساوية من المجموعات الأمينية المتبقية في 10 ملي HEPES العازلة (درجة الحموضة 7.3) عن طريق ضبط تركيز البوليمر إلى 33.3 ميكروغرام / مل و 19.1 ميكروغرام / مل على التوالي.
ملاحظة: تركيزات البوليمر المذكورة أعلاه هي القيم التمثيلية لإعداد nanomicelles مع نسبة المتبقية المولي من إجمالي المجموعات الأمينية في البوليمرات اثنين إلى مجموعات الفوسفات في PDNA (N / نسبة P) 10. إن نسبة N / P يمكن أن تختلف اعتمادا على نوع من الخلايا والغرض (لمزيد من التفاصيل، انظر مناقشة). الجمع بين استخدام البوليمرات اثنين يمكن أن يحقق كلا فعالية التدريع PEG وعمل PASP (ديت) لتعزيز endosomalالهروب (لمزيد من التفاصيل، انظر مناقشة) 18. - إعداد ترميز PDNA Gaussia luciferase المراسل، GL4 luciferase المراسل، أو الإريثروبويتين عن طريق الاستنساخ قطاع التعبير عن الجينات المعنية في البلازميد pCAG-GS (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) للحصول على التعبير تحت CAG المروج / محسن باستخدام طقم التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تضخيم PDNA في سلالة القولونية المختصة وتطهيره باستخدام البلازميد نظام تنقية DNA خالية من الذيفان الداخلي. تحديد تركيز PDNA في أحد الامتصاصية من 260 نانومتر للحصول على حل / مل 150 ميكروغرام في 10 ملي HEPES العازلة (درجة الحموضة 7.3).
- لإعداد nanomicelles polyplex، مزيج دقيق الحل PDNA (150 ميكروغرام / مل في 10 ملي HEPES عازلة) والحل الممزوجة مسبقا من البوليمرات اثنين على نسبة 2: 1 (من حيث الحجم).
4. الجينات ترنسفكأيشن إلى الأجسام الشبه الكروية
- احتضان الخلايا (خلايا الكبدأو اللجان الدائمة) لمدة 72 ساعة بعد البذر على لوحات micropatterned للسماح لتشكيل الأجسام الشبه الكروية الناضجة. لترنسفكأيشن الجينات، إضافة 100 ميكرولتر من محلول polyplex nanomicelle (تحتوي على 10 ميكروغرام من PDNA) إلى كل بئر بعد استبدال مستنبت مع 1 مل من المتوسط الطازجة. الاستمرار في الحضانة مع الحل nanomicelle لمدة 24 ساعة.
- لعنصر تحكم باستخدام كاشف ترنسفكأيشن الدهون على أساس، وخلط الحلول PDNA مع كاشف على نسبة الوزن كاشف / PDNA 3. ضبط الجرعة النهائية من PDNA لتكون مساوية لكل من كاشف القائم على الدهون وطرق nanomicelle.
5. الإنعاش وزرع خلية الأجسام الشبه الكروية
- استبدال مستنبت مع 200 ميكرولتر من PBS المبردة ووضع لوحات على الجليد.
ملاحظة: عموما، يمكن للالكروية فصل في حوالي 15 دقيقة، ويمكن استردادها في شكل تعليق للزرع. - بلطف نضح الخلايا في ميكرولتر 200تعليق باستخدام حقنة مع 23 G أو 27 G إبرة لحقن في الجسم الحي.
6. تقييم التعبير التحوير
- لفي التقييم في المختبر للتعبير عن Gaussia luciferase المراسل يفرز في مستنبت، وجمع 50-100 ميكرولتر من المتوسطة بدقة 24 ساعة بعد استبدال مع المتوسط الطازجة. تقدير التعبير luciferase المراسل باستخدام نظام فحص renilla luciferase المراسل التجاري وluminometer وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: لا يزال luciferase المراسل Gaussia مستقر في مستنبت لأكثر من أسبوع. وبالتالي، لتقييم الكفاءة في الوقت الحقيقي من التعبير التحوير، استبدل المتوسطة مع واحدة جديدة قبل جمع العينة المتوسطة. توقيت التغيير المتوسط يمكن أن تكون مرنة. - لتقييم المجراة من التعبير التحوير في الحيوانات المضيفة بعد زرع الخلايا، تخدير BALB / ج الفئران عارية (أنثى؛ 7 أسابيعالعمر) تحت التخدير استنشاق مع isoflurane.
- ضع الماوس في غرفة متصلة آلة التخدير لتوفير الأيزوفلورين للغرفة. اخراج الماوس بعد النوم، ووضعه على طاولة العمليات مع التهوية باستخدام قناع. السيطرة على الأيزوفلورين تدفق ما يقرب من في 0،2-0،5 لتر / دقيقة عن طريق التحقق من شروط الماوس.
- ضخ 200 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تحتوي الكروية مع transfected في GL4 PDNA، معربا عن luciferase المراسل (كما هو موضح في 4.1) في الأنسجة تحت الجلد في منطقة البطن.
- مباشرة بعد حقن D-وسيفيرين (150 ملغ / كغ، طريق الوريد)، وقياس التعبير luciferase المراسل باستخدام نظام التصوير IVIS وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- لتقييم الآثار العلاجية لزرع الخلايا، وضخ 200 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تحتوي الكروية مع transfected في PDNA ترميز الإريثروبويتين فيالأنسجة تحت الجلد في منطقة البطن.
- جمع عينات الدم عن طريق النزيف تحت الفك السفلي للحصول على ما يقرب من 200 ميكرولتر من الدم 19. قياس الهيموجلوبين والهيماتوكريت باستخدام محلل عينة الدم.
ملاحظة: يتم تنظيم عدد الخلايا للزرع من قبل عدد المصنفة على لوحات. لسوء الحظ، فإنه من الصعب تحديد عدد الخلايا المحدد لأن عدد داخل الكروية لا يمكن قياسها.
- جمع عينات الدم عن طريق النزيف تحت الفك السفلي للحصول على ما يقرب من 200 ميكرولتر من الدم 19. قياس الهيموجلوبين والهيماتوكريت باستخدام محلل عينة الدم.
- بعد عدة تجارب، ضع الفئران على وسادة التدفئة على اتصال مع وحدة تحكم في درجة الحرارة حتى الصحوة من التخدير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء الجينات ترنسفكأيشن من Gaussia، معربا عن luciferase المراسل PDNA في الكروية التي شكلتها خلايا الكبد أو اللجان الدائمة باستخدام nanomicelles polyplex أو كاشف ترنسفكأيشن الدهون على أساس السيطرة على 12. وnanomicelles يسببها أي تغيير تقريبا في هيكل كروي مقارنة مع الكروية غير transfected على لوحات micropatterned، في حين أن كاشف السيطرة تعطلت بشكل كبير على هيكل بعد يوم من ترنسفكأيشن (الشكل 3). بعد ترنسفكأيشن باستخدام nanomicelles، إفراز الألبومين ثابت والتحوير (Gaussia luciferase المراسل) التعبير وأبقى أيضا لمدة شهر تقريبا. ومع ذلك، عندما تم استخدام كاشف السيطرة، لم يلاحظ أي إفراز الزلال، على الرغم من أن درجة التعبير التحوير كانت مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من nanomicelles (الشكل 4) 12.
خلال فترة الانتعاش كروي باستخدام لوحات micropatterned حساس للحرارة، ليالي 3Dtructure من الكروية والحفاظ عليها جيدا لكل من خلايا الكبد الأولية واللجان الدائمة في تعليق بعد الشفاء من لوحات تبريد (الشكل 5). كما تم كذلك صيانة الهيكل بعد اجتياز الكروية من خلال إبر الحقن من عيار كبير بما فيه الكفاية، مثل 23 (400 ميكرون) و 27 G (220 ميكرون) الإبر.
بعد الحقن تحت الجلد من الكروية الكبدية استردادها، تم الكشف عن التعبير luciferase المراسل في الحيوانات لأكثر من بضعة أسابيع (الشكل 6) 20. وقد لوحظ التعبير الألبومين من خلايا الكبد المزروعة في الأنسجة المضيف 20، مما يشير إلى أنه تم الحفاظ على وظيفة الخلية من خلال عملية الانتعاش كروي والزرع. لاختبار قدرتها على التطبيقات العلاجية، و transfected الأجسام الشبه الكروية الكبدية أيضا مع الإريثروبويتين ترميز PDNA. بعد الزرع تحت الجلد من الكروية معربا عن erythropoietin، تم الحصول على أثر للدم كبير في الحيوانات لمدة شهر واحد (الشكل 7) 20.
الشكل 3. صور مجهرية من الكروية الكبدية (A، B) والكروية MSC (C، D) على لوحة micropatterned بعد يوم واحد ترنسفكأيشن الجين، وذلك باستخدام nanomicelles polyplex (A، C) أو كاشف القائم على الدهون (B، D). شريط مقياس: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. (A) التحوير التعبير عن Gaussia luciferase المراسل بعد transfecting الأجسام الشبه الكروية الكبدية. (B) إفراز الزلال منالأجسام الشبه الكروية الكبدية أو خلايا الكبد في ثقافة أحادي الطبقة بعد ترنسفكأيشن. و transfected الكروية باستخدام nanomicelle (●) أو التحكم في دهون كاشف ترنسفكأيشن (○)، أو PDNA عارية (▲). ويرد أيضا على إفراز الزلال من سيطرة (untransfected) خلايا الكبد (في الكروية (△) أو ثقافة أحادي الطبقة (×)). وتتمثل النتائج على النحو يعني ± SEM. ن = 4 للثقافة أحادي الطبقة ون = 6 لالكروية. (أعيد طبعها بإذن من المرجع 12). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. صور مجهرية من الكروية الكبدية في تعليق بعد تمريرها من خلال (A) 23- أو (B) 27 إبر الحقن G شريط مقياس: 100 ميكرون.
الرقم 6. luciferase المراسل التعبير في الفئران المضيف بعد زرع خلايا الكبد بعد 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع luciferase المراسل (GL4) -encoding PDNA، تم زرع الكروية الكبدية وحيدة الخلية تعليق من الثقافات أحادي الطبقة في الأنسجة تحت الجلد في منطقة البطن. تم تقييم التعبير luciferase المراسل في الفئران المضيف باستخدام نظام التصوير IVIS (أعيد طبعها بإذن من المرجع 20). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
igure 7 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 52384 / 52384fig7.jpg "/>
الرقم 7. تكون الدم بعد زرع الخلايا الكبدية، معربا عن الإريثروبويتين. خلايا الكبد في كروي وأحادي الطبقة الثقافات و transfected مع الإريثروبويتين ترميز PDNA. بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن، والكروية وحيدة الخلية تعليق من الثقافات أحادي الطبقة تم زرع تحت الجلد في البطن الماوس. في 22 و 28 يوما بعد الزرع، تم قياس (A) الهيموجلوبين و (B) مستويات الهيماتوكريت من عينات الدم. يتم عرض البيانات كما يعني ± SEM. ن = 12 لكروي والجماعات أحادي الطبقة ون = 6 لعناصر غير المعالجة. تم تحديد الدلالة الإحصائية التي كتبها t-الاختبار طالب 2-الذيل في (أعيد طبعها بإذن من المرجع 20). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذه فايجوري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على هيكل 3D من الكروية خلال خطوات إدخال الجينات والانتعاش كروي. فمن الضروري للحفاظ على microenvironments مواتية للخلايا لتجنب موت الخلايا أو فقدان نشاط الخلايا. على سبيل المثال، إفراز الألبومين، وهي وظيفة الفطرية التمثيلية لخلايا الكبد، والحفاظ عليها بشكل جيد في الكروية الكبدية، في حين أن خلايا الكبد في الثقافة أحادي الطبقة التقليدية تفقد بسرعة قدرتها الإفرازية بعد أيام قليلة من البذر 12. للاللجان الدائمة، والكروية يعزز إلى حد كبير كفاءتها من التمايز في الخلايا الشحمية أو بانيات، مع زيادة مستويات التعبير عن الجينات المسؤولة عن تكون الشحم وتكون العظم، وأسفل تنظيم الجينات التي تحافظ على MSC التجديد الذاتي النمط الظاهري 4.
لإدخال الجينات، وقد تم اختبار مختلف الكواشف ترنسفكأيشن سابقا، بما في ذلك تلك القائمة على الدهون (الشكل 3، 4) وتلك القائمة على البوليمر، مثل polyethylenimine. لسوء الحظ، فإن أيا من الكواشف قدم ناجح إدخال الجين دون تعطيل هيكل كروي. خصوصا، الكواشف القائم على الدهون تميل للحث على انقطاع كامل للالكروية، على الرغم من أن التعبير التحوير فعال، حتى في الخلايا المتبقية على لوحات micropatterned. فمن المرجح أن الكواشف القائم على الدهون تحفز زعزعة الاستقرار غشاء كبير، مما يؤدي إلى ارتفاع التعبير التحوير، ولكن تعطل الكروية من خلال تقديم التفاعلات خلية الى خلية غير مستقرة.
في المقابل، تعطلت البوليمر الموجبة للالكروية وإلى حد أقل من الدهون، وخاصة في ظروف انخفاض نسب N / P، لتشكيل polyplexes. بروتوكول قياسي هو موضح هنا يستخدم nanomicelles polyplex التي تمتلك PEG التدريع. بدلا من ذلك، polyplexes مع homopolymers الموجبة، مثل polyethylenimine، ويمكن أيضا أن تستخدم لإدخال الجينات في الكروية. في الواقع، cationiج polyplexes دون سطح PEG توفر عموما عالية التعبير التحوير في في المختبر transfections، وخيارات جذابة اعتمادا على نوع من الخلايا والغرض من زرع كروي.
ومن السمات المميزة لهذا البروتوكول هو استخدام لوحات ثقافة micropatterned المغلفة مع البوليمر للحرارة. يمكن للصفائف micropatterned تنتج عددا كبيرا من الأجسام الشبه الكروية الخلية التي يبلغ قطرها موحد. يستخدم هذا البروتوكول 100 ميكرون صفائف القطر، ولكن هذا الجانب هو مرن؛ ومع ذلك، بأقطار كبيرة جدا، مثل 500 ميكرون، وغالبا ما تسبب نخر الخلية في جوهر الكروية (بيانات غير منشورة). ببساطة عن طريق التبريد لوحات على الجليد، ويمكن الحصول على الأجسام الشبه الكروية في شكل تعليق عن طريق الحقن بواسطة طموح لطيف مع حقنة. وجود قيود المحتمل لهذه التقنية هو حجم الإبرة المستخدمة لحقن الكروية. وأكد أن إبرة 27 G يمكن استخدامها بأمان لالكروية مع 100 ميكرون بقطرالعطر. ومع ذلك، والإبر ضيقة لا يمكن تطبيقها لهذه الأجسام الشبه الكروية. منذ إبرة 27 G هو كبير جدا، وخصوصا لزرع الكروية في الماوس النخاع الشوكي، وهو بديل محتمل لاستخدام السقالات للاحتفاظ الخلايا بداخلها.
هذا البروتوكول يمكن المحتمل تطبيق لعدة أغراض زرع الخلايا. مقارنة بنظام ثقافة تعليق كروي، لوحات micropatterned لديها ميزة وجود عدد كاف من الكروية مع قطر موحدة يمكن الحصول عليها بسهولة. على الرغم من أن طريقة إدخال الجين يمكن أن يكون مرنا، كما ذكر سابقا، nanomicelles polyplex مع PEG التدريع هي فعالة بشكل خاص لتجنب انقطاع كروي. نأمل أن هذا النظام تحسين الآثار العلاجية للخلايا المزروعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نحن نقدر بعمق الدكتور تاكيشي Ikeya والموظفين التقنيين في شركة تويو جوسي، طوكيو، اليابان لتقديم لوحات ثقافة micropatterned للحرارة فضلا عن تقديم المشورة العلمية. كما نشكر السيدة ساتومي اوغورا، السيدة ساي سوزوكي، السيدة اسوكا ميوشي والسيدة Katsue Morii للمساعدة التقنية مع التجارب على الحيوانات. وأيد هذا العمل ماليا في جزء من JSPS KAKENHI غرانت في والمعونة من أجل البحث العلمي، ومركز الابتكار (هيئة النزاهة) برنامج وبرنامج الابتكار S- من وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابان (JST)، وJSPS الحدقة إلى النواة البرنامج، A. شبكات البحوث المتقدمة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| Dexamethasone | Wako Pure Chemical Industries | 041-18861 | |
| Nicotinamide | Wako Pure Chemical Industries | 141-01202 | |
| Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Human epidermal growth factor (hEGF) | Toyobo | PT10015 | |
| Cell-able multi-well plates | Toyo Gosei | PP-12 | |
| Thermosensitive cell culture plates (Upcell) | CellSeed Inc | The micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei) | |
| Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | Promega | E6651 | |
| pDNA expressing Gaussia luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| Mouse erhthropoietin-expressing vector | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | Kindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN | ||
| Escherichia coli DH5α competent cells | Takara | 9057 | |
| Endotoxin-free plasmid DNA purification system | Nippon Genetics | NucleoBond Xtra EF | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries | 639-00951 | |
| Trypsin inhibitor | GIBCO | R-007-100 | |
| Luminometer | Promega | GloMax™ 96 Microplate Luminometer | |
| IVIS Imaging System | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system | |
| Blood sample analyzer | Sysmex | pocH-100i Automated Hematology Analyzer |
References
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes. J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).
- Otsuka, H., et al. Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface. Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications. IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).
- Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohashi, K., et al. Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets. Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Itaka, K., Kataoka, K. Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery. Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).
- Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation. Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).
- Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
- Tateno, C., Yoshizato, K. Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).
- Kanayama, N., et al. A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells. ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).
- Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).
- Uchida, S., et al. PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses. Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).
- Uchida, S., et al. An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy. Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).
