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Biology

マラリア蚊。送信のためのマルチ検出分析

Published: February 28, 2015
doi:
10.3791/52385
, , , ,
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology,School of Veterinary Medicine, University of California – Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory,School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Abstract

ハマダラカ種複合体は、アフリカの蚊を送信する主要なマラリアが含まれています。これらの種は、そのような医学的に重要であるので、いくつかの特徴は、典型的には、疫学的研究を支援するために、分子アッセイを使用して特徴づけられる。これらの特性は、種の同定、殺虫剤抵抗、寄生虫感染状況、およびホストの好みが含まれています。 ハマダラカ複合体の集団は、形態学的に区別できないので、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、伝統的に種を識別するために使用される。種が分かると、いくつかの下流のアッセイは、日常的にさらなる特性を解明するために行われる。例えば、パラ遺伝子におけるKDRとしても知られている突然変異は、DDTおよびピレスロイド殺虫剤に対する耐性を付与する。さらに、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）またはマラリア原虫DNAの検出PCRアッセイは、蚊の組織に存在する寄生虫を検出するために使用される。最後に、combinatioPCRおよび制限酵素消化物のnは、ホスト固有のDNAのための蚊吸血をスクリーニングすることによって、ホスト·プ（動物の血液対例えば 、ヒト）を解明するために使用することができる。私たちは、一度に96または384のサンプルについて、単一の多重反応ジェノタイピング33SNPsに上記アッセイの全てを兼ね備えたマルチ検出アッセイ（MDA）を開発した。 MDAは、種、 プラスモディウム検出、およびホスト血液を識別するための複数のマーカーが含まれているので、偽陽性または陰性の発生の可能性が大幅に形質ごとに1つのマーカーを含む、前のアッセイから減少する。この堅牢でシンプルなアッセイは、コスト効率と既存のアッセイの時間の割合は、これらの重要な蚊の特性を検出することができます。

Introduction

ハマダラカarabiensis、ハマダラカcoluzziiとハマダラカは、アフリカ1におけるマラリア伝送に関与する主要なベクトルです。これら3種は2形態学的に区別できないとだけ分子アッセイ3-9で区別することができます。また、日常的疫学的および集団遺伝学研究を支援するために行われ、多くの下流のアッセイが存在する。これらには、（1）分化アイランド10-12のための遺伝子型決定アッセイを、 パラ遺伝子のアミノ酸コドン位置番目 1014で非同義SNPを認識する（2）遺伝子型決定アッセイ（ ノックダウン抵抗 、又はkdrの 、SNP）13を含む-18、（3）寄生虫の検出PCR 19-23、及び（4）蚊の中腸24,25にホスト固有のDNAをスクリーニングする。

私たちは、の目標を持つ単一の多重反応にすべてのこれらのアッセイを組み合わせたマルチ検出アッセイ（MDA）を開発アフリカのマラリアベクトルの疫学的に重要な特性をalyzing。 MDAアッセイは、（1）種を検出するための複数のマーカー（A.のarabiensis、A.のハマダラカ、A.のcoluzzii、または3つの他の（なし））kdrの SNPの中で示される、（2）殺虫剤抵抗性（L1014F とL1014S両方）を含む二つの主要なマラリア原虫の、（3）存在下、熱帯熱マラリア原虫およびP.三日熱マラリア原虫 、一鳥類六哺乳類宿主から（4）血液源。

伝統的に、これらのアッセイは、別個のポリメラーゼ連鎖反応を行った。すべてのこれらのアッセイは、従来のPCRプラットフォームを使用して行われている場合には、8-10 PCR反応アッセイを実施し、ゲル電気泳動工程を伴う必要があります。ここで紹介するMDA法は全体で約5時間かかりますしながら、文書化の結果への準備から、個々のPCR反応は、4-5時間かかります。これだけで人件費の90％の節約と等価である。 MDAはここで紹介する5ドルの費用すべての33のSNPの遺伝子型を決定するためにサンプルあたり。これはサンプルあたり約1.50ドルのコスト、これシングルアガロースゲルベースアッセイよりもかなり安価である。 MDAがカバーするすべての特性を検出するアッセイは、サンプルあたり$ 12〜15の費用で8-10別々のアガロースゲルに基づくアッセイの最小値を必要とするであろう。また、MDAは大幅に各寄生虫またはホストソースを検出するための少なくとも3つのマーカーを利用することにより、偽陽性または陰性のを発生させる可能性を低減します。

我々が利用プラットフォームはマラリアベクトルに限定されるものではなく、医学、獣医学、および基本的な生物学26-28など、多種多様な用途で使用することができる。深い関連研究または集団遺伝学サンプル（数百程度）を多数同時に複数のマーカーのための費用対効果のアッセイスクリーニングが必要含む研究。 2つ以上の別々のPCRアッセイを利用するほとんどの研究は、低コストで迅速な結果を得るために、MDAを実装することができます。 </p>

Protocol

1. PCR増幅 1.5ミリリットルのマイクロチューブに（補足表S1を参照してください）​​すべてのPCRプライマーを混ぜる。各SNPは、2つのプライマー（順方向および逆方向）を有している。各PCRプライマーのストック濃度を100μmに保たれていることを確認します。 （補足表S2を参照してください）​​ベンチでのピペッティング誤差と時間を削減するために500〜1,000の反応のための十分な?…

Representative Results

種の同定： サンプルは3種の一つではない場合は、次の5個のSNPは、一緒に、3個のSNP（01073から213、04679から157と10313の3種（A.のarabiensis、AをcoluzziiとA.ハマダラカ ）（ 表4）。識別する-052）を増幅することができない。 殺虫剤抵抗性を推測するためのKDR遺伝子型： パラ電位依存性ナ?…

Discussion

飛行時間（MALDI-TOF）質量分析法33-37 – PCR増幅、エビアルカリホスファターゼ（SAP）反応、SNP拡張、伸長産物の調節、およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化：MDAは、5つの主要なステップから構成されている。最初のPCR増幅工程は、十分な鋳型DNAがSNP伸長工程で使用できるように各SNPに隣接するDNAを増幅する。 SAPの反応は以下のSNP伸長工程を妨害する可能性が使用されていない…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、博士に感謝。タンザニアから蚊の標本を提供するためのグラスゴー大学のUCデービス博士カタリーナKreppelでアンソニー·コーネルとローラ·ノリス。私たちは、ザンビアから蚊のサンプルを共有するための公衆衛生のジョンズホプキンススクールさんスミタ·ダス博士ダグラスノリスに感謝。我々はまた、アッセイデザインのトレーニングのために獣医遺伝学研究所の李氏V.ミロンに感謝。この作品はR01AI 078183とR21AI062929を付与国立衛生研究所によってサポートされていました。

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.
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Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).
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