Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.
एनोफ़ेलीज़ gambiae प्रजातियों जटिल अफ्रीका में मच्छरों संचारण प्रमुख मलेरिया भी शामिल है। इन प्रजातियों जैसे चिकित्सा महत्व के होते हैं, क्योंकि कई लक्षण आम तौर पर महामारी विज्ञान के अध्ययन में सहायता करने के लिए आणविक assays का उपयोग विशेषता है। ये लक्षण प्रजातियों की पहचान, कीटनाशक प्रतिरोध, परजीवी के संक्रमण की स्थिति, और मेजबान वरीयता शामिल हैं। एनोफ़ेलीज़ gambiae परिसर की आबादी आकृति विज्ञान अप्रभेद्य हैं के बाद से, एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) पारंपरिक प्रजातियों की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रजातियों के नाम से जाना जाता है, एक बार कई बहाव के assays के नियमित आगे विशेषताओं को स्पष्ट करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, एक पैरा जीन में KDR के रूप में जाना जाता म्यूटेशन डीडीटी और pyrethroid कीटनाशकों के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays के (ELISAs) या प्लाज्मोडियम परजीवी डीएनए का पता लगाने पीसीआर assays के मच्छर के ऊतकों में मौजूद परजीवी का पता लगाने के लिए किया जाता है। अन्त में, एक combinatioपीसीआर और प्रतिबंध एंजाइम हज़म के एन मेजबान विशिष्ट डीएनए के लिए मच्छर bloodmeal स्क्रीनिंग से मेजबान वरीयता (जैसे, पशु रक्त बनाम मानव) को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम एक समय में 96 या 384 नमूनों के लिए एक एकल मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रिया जीनोटाइपिंग 33SNPs में aforementioned के assays के सभी को जोड़ती है कि एक बहु-खोज परख (एमडीए) विकसित किया है। एमडीए प्रजातियों, प्लाज्मोडियम का पता लगाने, और मेजबान रक्त की पहचान के लिए कई मार्करों शामिल है, क्योंकि झूठी सकारात्मक या नकारात्मक पैदा करने की संभावना बहुत विशेषता प्रति केवल एक मार्कर शामिल है कि पिछले assays से कम है। इस मजबूत और सरल परख लागत प्रभावी ढंग से और मौजूदा assays के समय का एक अंश में इन प्रमुख मच्छर लक्षण पता लगा सकते हैं।
एनोफ़ेलीज़ arabiensis, एनोफ़ेलीज़ coluzzii और एनोफ़ेलीज़ gambiae अफ्रीका एक में मलेरिया संचरण के लिए जिम्मेदार प्रमुख वैक्टर हैं। ये तीन प्रजातियों आकृति विज्ञान के दो पृथक कर रहे हैं और केवल आणविक assays के 3-9 से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। इसके अलावा, नियमित रूप से महामारी विज्ञान और जनसंख्या आनुवंशिकी के अध्ययन में सहायता करने के लिए आयोजित कई बहाव के assays के होते हैं। ये प्रजातीकरण द्वीपों 10-12 के लिए (1) एक जीनोटाइपिंग परख, (2) अमीनो एसिड कोडोन पैरा जीन की स्थिति वें 1014 में गैर पर्याय SNPs पहचानने एक जीनोटाइपिंग परख (तोड़े नीचे प्रतिरोध, या KDR, एसएनपी) 13 में शामिल -18, (3) परजीवी का पता लगाने पीसीआर 19-23, और मच्छर midguts 24,25 में मेजबान विशिष्ट डीएनए के लिए (4) स्क्रीनिंग।
हम एक के लक्ष्य के साथ एक एकल मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रिया में इन सभी assays के जोड़ती है कि एक बहु-खोज परख (एमडीए) विकसितअफ्रीका में मलेरिया वैक्टर epidemiologically महत्वपूर्ण विशेषताओं alyzing। एमडीए परख एकाधिक (1) प्रजातियों का पता लगाने के लिए मार्कर (ए arabiensis, ए gambiae, ए coluzzii, या तीन) के दूसरे (कोई नहीं) KDR SNPs में प्रतिनिधित्व, (2) कीटनाशक प्रतिरोध भी शामिल है (L1014F और L1014S दोनों) दो प्रमुख मलेरिया परजीवी की, (3) मौजूदगी, प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम और पी वैवाक्स, और एक एवियन और छह स्तनधारी मेजबान से (4) रक्त स्रोत है।
परंपरागत रूप से, इन assays अलग पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रियाओं में आयोजित की गई। इन सभी assays के एक पारंपरिक पीसीआर मंच का उपयोग कर रहे हैं, यह 8-10 पीसीआर प्रतिक्रिया assays के संचालन और जेल वैद्युतकणसंचलन चरणों के साथ की आवश्यकता है। यहाँ प्रस्तुत एमडीए विधि समग्रता में लगभग 5 घंटा लेता है, जबकि दस्तावेजीकरण परिणाम के लिए तैयारी से प्रत्येक व्यक्ति पीसीआर प्रतिक्रिया, 4-5 घंटा लेता है। अकेले यह श्रम लागत में एक 90% बचत के बराबर है। एमडीए यहाँ प्रस्तुत $ 5 लागतनमूना प्रति सभी 33 SNPs जीनोटाइप के लिए। यह काफी कम खर्चीला नमूना प्रति बारे में $ 1.50 की लागत जो एक agarose जेल आधारित assays, से अधिक है। एमडीए द्वारा कवर सभी विशेषताओं का पता लगाने के assays नमूना प्रति $ 12-15 की लागत से 8-10 अलग agarose जेल आधारित assays की एक न्यूनतम आवश्यकता होगी। इसके अलावा, एमडीए बहुत प्रत्येक परजीवी या मेजबान स्रोत का पता लगाने के लिए कम से कम तीन मार्कर का उपयोग करके एक झूठी सकारात्मक या नकारात्मक पैदा करने का मौका कम कर देता है।
हम उपयोग किया मंच मलेरिया वैक्टर तक सीमित नहीं है, लेकिन इस तरह की चिकित्सा, पशु चिकित्सा, और बुनियादी जीव विज्ञान 26-28 के रूप में आवेदनों की एक विस्तृत विविधता में इस्तेमाल किया जा सकता है। में गहराई से नमूनों की एक बड़ी (100s के क्रम में) संख्या को शामिल एसोसिएशन पढ़ाई या जनसंख्या आनुवंशिकी के अध्ययन के लिए एक साथ कई मार्करों के लिए लागत प्रभावी assays के स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है। दो या दो से अधिक अलग पीसीआर assays के उपयोग कि अधिकांश अध्ययन एक कम कीमत पर जल्दी परिणाम के लिए एमडीए लागू कर सकता है। </p>
– उड़ान (MALDI-TOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री 33-37 के समय पीसीआर प्रवर्धन, झींगा alkaline फॉस्फेट (एसएपी) प्रतिक्रिया, एसएनपी विस्तार, विस्तार उत्पाद कंडीशनिंग, और मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर / आयनीकरण: एमडीए पांच प्?…
The authors have nothing to disclose.
हम डीआरएस धन्यवाद। तंजानिया से मच्छर नमूनों प्रदान करने के लिए ग्लासगो विश्वविद्यालय में यूसी डेविस और डॉ कथरीना Kreppel पर एंथोनी Cornel और लौरा नॉरिस। हम जाम्बिया से मच्छर के नमूने बांटने के लिए सार्वजनिक स्वास्थ्य के जॉन्स हॉपकिन्स स्कूल से सुश्री स्मिता दास और डॉ डगलस नॉरिस धन्यवाद। हम यह भी परख डिजाइन पर प्रशिक्षण के लिए पशु चिकित्सा आनुवंशिकी प्रयोगशाला में श्री ली वी मिलोन धन्यवाद। इस काम R01AI 078,183 और R21AI062929 अनुदान स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया।
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |