Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.
Den Anopheles gambiae arter Komplexet omfattar den stora malaria sänder mygg i Afrika. Eftersom dessa arter är av sådan medicinsk betydelse, finns flera drag vanligtvis karaktäriseras med molekylär analyser till stöd i epidemiologiska studier. Dessa egenskaper omfattar artbestämning, insektsresistens, parasitinfektion status, och värd önskemål. Eftersom populationer av Anopheles gambiae komplexet är morfologiskt oskiljbara, är en polymerase chain reaction (PCR) traditionellt används för att identifiera arter. När arten är känd, är flera nedströms analyser rutinmässigt för att belysa ytterligare egenskaper. Till exempel, mutationer kända som KDR i en para gen ger resistens mot DDT och pyretroidinsekticider. Dessutom är enzymkopplade immunsorbentanalyser (ELISA) eller Plasmodium parasit-DNA detektions PCR-analyser som används för att detektera parasiter som finns i mygga vävnader. Slutligen, en combination av PCR och restriktionsenzymdigereringar kan användas för att belysa värd preferens (t.ex., människa kontra djurblod) genom screening av mygga blodmjöl för värdspecifik DNA. Vi har utvecklat en multi-detekteringsanalys (MDA) som kombinerar alla av de ovannämnda analyserna i en enda multiplex reaktion genotypning 33SNPs för 96 eller 384 sampel i taget. Eftersom MDA innehåller flera markörer för arter, Plasmodium upptäckt, och värdblod identifiering, är sannolikheten för att generera falska positiva eller negativa kraftigt reducerad från tidigare analyser som inkluderar endast en markör per drag. Denna robusta och enkla analys kan upptäcka dessa nyckel mygga drag kostnadseffektivt och på en bråkdel av tiden av befintliga analyser.
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii och Anopheles gambiae är de stora vektor ansvarar för malariatransporten i Afrika 1. Dessa tre arter är morfologiskt oskiljbara 2 och kan endast särskiljas genom molekylära analyser 3-9. Dessutom finns det många nedströms analyser rutinmässigt genomförda för att hjälpa epidemiologiska och populationsgenetiska studier. Dessa inkluderar (1) en genotypning analys för specieringsberäkningar öar 10-12, (2) en genotypning analys erkännande av icke-synonyma SNP i 1014: e aminosyran kodonposition av para-genen (knock-down motstånd eller KDR, SNP) 13 -18, (3) parasit detektering PCR 19-23, och (4) screening för värdspecifik DNA i mygga midguts 24,25.
Vi utvecklade en multi-detekteringsanalys (MDA) som kombinerar alla dessa analyser i en enda multiplex reaktion med målet av enalyzing epidemiologiskt viktiga egenskaper hos malaria vektorer i Afrika. I MDA-analysen innehåller flera markörer för att upptäcka (1) art (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii eller annan (ingen av de tre)), (2) insektsresistens representerade i KDR SNP (både L1014F och L1014S) , (3) närvaron av två stora malariaparasiter, Plasmodium falciparum och P. vivax, och (4) blodkälla från en höns och sex däggdjursvärdar.
Traditionellt har dessa analyser utfördes i separata polymeraskedjereaktioner. När alla dessa analyser görs med hjälp av en konventionell PCR-plattform, kräver det genomför 8-10 PCR-reaktionsanalyser och medföljande gelelektrofores steg. Varje enskild PCR-reaktion från förberedelser till dokumenterar resultaten tar 4-5 timmar, medan MDA metod som presenteras här tar ca 5 timmar i helhet. Detta motsvarar en 90% besparing i enbart arbetskostnader. MDA presenteras här kostar $ 5per prov till genotyp alla 33 SNP. Detta är betydligt billigare än de enskilda agarosgel baserade analyser, som kostar ca $ 1,50 per prov. Analyser som detekterar alla kännetecken som omfattas av MDA skulle kräva minst 8-10 separata agarosgel baserade analyser till en kostnad av $ 12-15 per prov. Dessutom MDA minskar avsevärt risken för att generera ett falskt positivt eller negativt genom att använda minst tre markörer för varje parasit eller värdkälla detektering.
Plattformen vi utnyttjade är inte begränsat till malaria vektorer men kan användas i en mängd olika tillämpningar som medicin, veterinärmedicin, och grundläggande biologi 26-28. Fördjupad associationsstudier eller populationsgenetik studier med en stor (i ordning efter 100s) antal prover kräver kostnadseffektiva analyser screening för flera markörer samtidigt. De flesta studier som använder två eller flera separata PCR-analyser kunde genomföra MDA för snabbare resultat till en lägre kostnad. </p>
MDA består av fem viktiga steg: PCR amplifiering, räkor alkaliskt fosfatas (SAP) reaktion, SNP förlängning, förlängningsproduktkonditione, och matrisassisterad laserdesorption / jonisering – flygtiden (MALDI-TOF) masspektrometri 33-37. Den första PCR-amplifiering steg förstärker DNA som flankerar varje SNP så att tillräckligt mall-DNA kommer att finnas tillgängliga på SNP förlängningssteg. SAP reaktionen neutraliserar oanvända dNTP som kan störa den följande SNP förlängningssteget. SNP fö…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Drs. Anthony Cornel och Laura Norris vid UC Davis och Dr. Katharina Kreppel vid University of Glasgow för att ge mygga prover från Tanzania. Vi tackar Ms Smita Das och Dr. Douglas Norris från Johns Hopkins School of Public Health för att dela mygga prov från Zambia. Vi tackar även Mr Lee V. Millon vid Veterinär Genetics Laboratory för träning på analys design. Detta arbete stöddes av National Institute of Health bevilja R01AI 078.183 och R21AI062929.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |