Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.
Anopheles gambiae arter Komplekset inneholder den store malaria overføring mygg i Afrika. Fordi disse arter er av en slik medisinsk betydning, karakterisert flere trekk er vanligvis ved hjelp av molekylære assays for å hjelpe til i epidemiologiske undersøkelser. Disse egenskapene inkluderer artsbestemmelse, insektmiddel motstand, parasitt infeksjon status, og vert preferanse. Siden populasjoner av Anopheles gambiae komplekset er ikke skilles morfologisk, er en polymerase kjedereaksjon (PCR) som tradisjonelt brukes for å identifisere arter. Når den art som er kjent, er flere nedstrøms-analyser rutinemessig utført for å belyse ytterligere kjennetegn. For eksempel mutasjoner kjent som KDR i en para-genet gir resistens mot DDT og pyretroide insektmidler. I tillegg, blir enzym-bundne immunosorbentbestemmelser (ELISA) eller plasmodiumparasitten DNA gjenkjenning PCR-analyser brukes til å detektere parasitter tilstede i mygg vev. Til slutt, en Oppkjøpn av PCR, og restriksjonsenzymdigere kan brukes til å belyse verts preferanse (f.eks human vs. dyreblod) ved screening av mygg bloodmeal for vertsspesifikk DNA. Vi har utviklet en multi-deteksjonsanalyse (MDA) som kombinerer alle de ovenfor nevnte analysene, til én multipleks reaksjonen genotyping 33SNPs for 96 eller 384 prøver på en gang. Fordi MDA inkluderer flere markører for arter, Plasmodium deteksjon, og vert blod identifikasjon, er sannsynligheten for å generere falske positiver eller negativer sterkt redusert fra tidligere analyser som omfatter bare én markør per trekk. Denne robuste og enkle analysen kan oppdage disse viktige myggtrekk kostnadseffektivt og i en brøkdel av tiden av eksisterende analyser.
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii og Anopheles gambiae er de viktigste vektorer som er ansvarlige for malaria overføring i Afrika en. Disse tre artene er ikke skilles morfologisk 2 og kan bare skilles ved molekylære assays 3-9. I tillegg er det mange nedstrøms analyser rutinemessig gjennomført for å hjelpe epidemiologiske og populasjonsgenetikk studier. Disse omfatter (1) en genotyping analysen for arts øyer 10-12, (2) en genotyping analysen erkjenner ikke synonymt SNPs i 1014 th aminosyre kodon stilling para genet (knock-down motstand, eller kdr, SNP) 13 -18, (3) parasitt gjenkjenning PCR 19-23, og (4) screening for vertsspesifikk DNA i mygg midguts 24,25.
Vi utviklet en multi-gjenkjenning analysen (MDA) som kombinerer alle disse analysene til en enkelt multipleks reaksjon med mål om enalyzing epidemiologisk viktige kjennetegn ved malaria vektorer i Afrika. MDA analysen inkluderer flere markører for deteksjon (1) arter (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii eller annen (ingen av de tre)), (2) insektmiddel motstand representert i kdr SNPs (både L1014F og L1014S) , (3) nærværet av to store malariaparasitter, Plasmodium falciparum og P. vivax, og (4) blod kilde fra en avian og seks pattedyr verter.
Tradisjonelt ble disse analyser utført i separate polymerase kjedereaksjoner. Når alle disse analysene er gjort ved hjelp av en konvensjonell PCR plattform, krever det å drive 8-10 PCR reaksjons analyser og tilhørende gelelektroforesesystemer trinn. Hver enkelt PCR reaksjon fra forberedelse til å dokumentere resultater tar 4-5 timer, mens MDA Metoden som presenteres her tar ca 5 timer i helheten. Dette tilsvarer en 90% besparelse i lønnskostnader alene. MDA presenteres her koster $ 5per prøve å genotype alle 33 SNPs. Dette er betydelig rimeligere enn de enkle agarosegel baserte analyser, som koster ca $ 1,50 per prøve. Assays detektere alle kjennetegn som omfattes av MDA ville kreve et minimum av 8-10 separate agarosegel-baserte assays til en kostnad på $ 12 til 15 per prøve. Videre MDA reduserer sjansen for å generere et falskt positivt eller negativt ved å benytte minst tre markører for hver parasitt eller vertskilde deteksjon.
Plattformen vi utnyttet er ikke begrenset til malaria vektorer, men kan brukes i en rekke programmer som medisin, veterinærmedisin, og grunnleggende biologi 26-28. Inngående assosiasjonsstudier eller populasjonsgenetikk studier som involverer en stor (i rekkefølge av 100s) antall prøver krever kostnadseffektive analyser screening for flere markører samtidig. De fleste studier som bruker to eller flere separate PCR-analyser kunne implementere MDA for raskere resultater til en lavere kostnad. </p>
MDA er sammensatt av fem store trinn: PCR forsterkning, reker alkalisk fosfatase (SAP) reaksjon, SNP forlengelse, utvidelse produkt condition, og matrise-assistert laserdesorpsjon / ionisering – flyvetid (MALDI-TOF) massespektrometri 33-37. Den første PCR amplifikasjonstrinn forsterker DNA flankerer hver SNP, slik at nok mal DNA vil være tilgjengelig på SNP forlengelse trinn. SAP reaksjon nøytraliserer ubrukte dNTPs som kan forstyrre følgende SNP forlengelse trinn. SNP forlengelse involverer en enkelt ek…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker legene. Anthony Cornel og Laura Norris ved UC Davis og Dr. Katharina Kreppel ved Universitetet i Glasgow for å gi mygg prøver fra Tanzania. Vi takker Ms Smita Das og Dr. Douglas Norris fra Johns Hopkins School of Public Health for å dele mygg prøver fra Zambia. Vi takker også Mr. Lee V. Millon ved Veterinær Genetics Laboratory for trening på analyse design. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health gi R01AI 078183 og R21AI062929.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |