Protocol
Alle dyr blev opstaldet og plejes i overensstemmelse med nationale og institutionelle retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr. Etik godkendelse til denne protokol blev ydet af University of British Columbia Animal Care udvalg. Sprague-Dawley hanrotter, der vejede mellem 300-450 g, blev anvendt til denne protokol.
1. Donor Operation
- Har ca. 100 ml kardioplegi (RT) i en cylindrisk kolbe forbundet til lang intravenøs (IV) kateterrør med en 3-vejs stophane. Brug et stativ til at ophøje kolben til ca. 80 cm over den operative overflade, der gør det muligt kardioplegi levering af tyngdekraften.
- At visualisere strukturer tilstrækkeligt, enten bruge et par kirurgiske lupper eller et dissektionsmikroskop.
BEMÆRK: Vi har i øjeblikket bruger en kikkert operativsystem mikroskop med 3.4 - 21.3X forstørrelse. - Placer donor i en bedøvelse kammer og fremkalde anæstesi med 4-5% isofluran. Overfør rotte til et operativsystem platform og opretholde anæstesi ved næsen-kegle med 1-2% isofluran. Anvend dyrlæge salve til dyrets øjne til at forebygge tørhed. Administrere midazolam (2 mg / kg) intraperitonealt med en 25 G nål.
- Ved hjælp af kirurgiske neglesaks, barbere donor fra xiphisternum til underkæben. Barbere en lille region af den venstre lyske (til efterfølgende IV adgang). Påfør et depilating middel med de udløsende overflader, vente ca. 5 minutter og fjerne hår med et stykke gaze.
- Prep de kirurgiske websteder med en povidon-iod eller chlorexidine-baseret løsning (vi bruger kun chlorhexidin). Infiltrere incisional steder med 0,1-0,5% lidokain subkutant.
- Fastgør forbenene og venstre bagben til operativsystemet platform med tape, så den rette bagben gratis for overvågning af bedøvelse dybde og vitale tegn.
- Efter at have sikret passende bedøvelse dybde ved pedal knibe, gør et snit i venstre lyske krølle hjælpen 22-bladet skalpel. Ved stump dissektion, udsætte venstre fælles femorale vene og få IV adgang som følger:
- Forsigtigt tilbagetrække væv overliggende femorale vene, og kanyle venen med en 24 G IV. Tilslut IV til en kort længde af saltvandsfyldt IV slanger, og fastgør slangen på plads med tape.
BEMÆRK: Proceduren for femoral venøs kanyle i rotter er beskrevet andetsteds af Jespersen og kolleger 14. - Tilslut en saltopløsning fyldt 10 ml sprøjte til IV slangen, og forsigtigt aspireres blod for at sikre korrekt positionering af IV.
- Injicer 300-500 IU ufraktioneret heparin gennem IV-slange, og skyl derefter slangen med 3-5 ml saltvand.
- Forsigtigt tilbagetrække væv overliggende femorale vene, og kanyle venen med en 24 G IV. Tilslut IV til en kort længde af saltvandsfyldt IV slanger, og fastgør slangen på plads med tape.
- Dernæst tracheotomize donoren som følger:
- Lav en midtliniesnit i det bløde væv mellem jugularis hak og underkæben ved hjælp af en 22-klinge skalpel. Trænge ind i kapslen af skjoldbruskkirtlen i midtlinjen under anvendelse Metzenbaum saks, og separate sine lapper ved stump dissektion.
- Ved stump dissektion, adskil gjorden musklerne i nakken i midterlinjen at blotlægge den forreste overflade af luftrøret.
- Brug en buet pincet til ligeud dissekere en rundtgående plan omkring luftrøret. Omkranse luftrøret med en 4-0 silkeslips.
- Anvendelse af iris saks, gør et tværgående snit i den forreste trachea, ca. 5 mm ringere end skjoldbrusken. Forsigtigt introducere tracheal kanyle (en 14 G IV) og fastgør det på plads ved hjælp af 4-0 silkeslips.
- Tilslut tracheale kanyle til en mekanisk ventilator. Omdirigere strømmen af ilt og isofluran gennem ventilatoren kredsløb, og ventilere donor med en hastighed og tidalvolumen forudsagt af sin vægt 13.
- Lave et snit i midterlinjen af brystet (under anvendelse af en 22-bladet skalpel), udvidelse af indsnit ved jugular hak til under xipisternum.
- Opholder sig i midterlinjen, Udfør en mediansternotomi anvendelse af en knogle cutter. Træk kanterne af brystbenet med en selvstændig fastholde retraktor. Indtast hjertesækken og pleurale hulrum.
- Udfør en thymektomi. Det er lettest at først ligeud opdele brissel i midterlinjen og derefter adskille den fra de omkringliggende strukturer ved hjælp af en kombination af stump og skarp dissektion.
BEMÆRK: Oprindelsen af de interne thorax arterier kan komme til skade, når dissekere thymus væk fra de overlegne sternale kanter. For at forhindre blødning, kan hæmostatiske klemmer påføres, før du fjerner thymus på disse punkter. - Hjælp Metzenbaum saks og / eller en skarp Lauer, dissekere peri-Caval fedt væk fra inferior vena cava (IVC). Sørg for, at IVC er relativt fri for fedt og bindevæv fra cavo-atrial krydset overlegent, at membranen nedadtil.
- Med en skarp Lauer, periferisk fri den øvre hulvene (SVC) og omringe den med en 4-0 silke slips.
- Dernæst dissekerevenstre vena cava fri fra omgivende strukturer, og liger det proksimalt og distalt med 4-0 silkeslips. Resecere den mellemliggende del af cava at blotlægge den venstre arteria subclavia.
- Omkredsen fri aortabuen fartøjer, der anvender en skarp Lauer. Påfør proksimale og distale kirurgiske klip til innominate arterie, og dele den mellem klippene. Lad den venstre fælles halspulsåren og venstre subclavia arterie un-klippet.
- Dernæst kanyle SVC med en 24 G IV kateter. Fastgør kateteret med den tidligere placeret 4-0 silkeslips.
- Forbered dig på en hensigtsmæssig, men blid graft høst.
- Ved hjælp af skarp saks, opdele IVC bare bedre end den diaphragmatic overflade. Opdele SVC overlegen sit kanylering site, der sikrer, at nærliggende luftvejs strukturer ikke kommer til skade.
- Sluk for ventilatoren og frakoble tracheal kanyle. Transekt luftrøret proximalt.
- Tag fat i overskårne luftrøret med pincet, og fjern hjertetog lunger en-bloc. Dette vil kræve blid trækkraft med skarp dissektion som hjerte-lunge transplantat fjernes. Adskil luftrøret fra den underliggende spiserøret. Undgå at beskadige aorta descendens, således at en lang del af det forbliver intakt efter høst.
2. Forberedelse af hjerte-lunge Graft
BEMÆRK: mens du gennemfører denne del af proceduren bør en assistent være bedøve modtager gnaver og forberede graft implantation.
- Placer hjerte-lunge transplantat på kirurgisk gaze med den forreste overflade af hjertet vender nedad. Ved hjælp af skarp dissektion, fjerne eventuelle spiserør, undgå skade på de bageste luftveje.
- Find den nedadgående thorakalaorta og sæt en 16 G stump spids kanyle. Fastgør kanylen på plads med en 4-0 silkeslips.
- Find aortabuen fartøjer, og anvende en kirurgisk klip til venstre subclavia arterie. Lad den venstre halspulsåre un-klippet til subgende de-luftning.
- Administrere den første dosis af kardioplegi ved kardioplegi slange tilslutning til 16 G aorta kanyle. Halspulsåren skal midlertidigt okkluderet med en pincet for at sikre tilstrækkelig levering af kardioplegi.
BEMÆRK: En fordel at have aortakanylen knyttet er at kardioplegi kan indgives kontinuerligt og / eller med mellemrum som ønsket. Til intermitterende dosering, vi leverer typisk kardioplegi hver 10 - 15 min i 5 ml boli løbet 30-45 sek. - Hjælp Metzenbaum saks og / eller en skarp Lauer, dissekere peri-aorta fedt væk fra aorta. Sørg for, at aorta er relativt fri for fedt og bindevæv fra venstre subclavia arterie (distal bue) til dets kanylering site.
- Dernæst udsætte venstre hovedstammebronkie bronkier med en skarp Lauer, og liger det proximalt med en 4-0 silkeslips. Transekt venstre bronkier distalt for ligatur hjælp iris saks. Udfør en venstre pneumonektomi ved at ligere venstre pulmonalarterie og vene med 4-0 silkeslips. Transekt distalt for ligatur og fjern venstre lunge.
- Som ovenfor, fjerne alle andre lungelapper med undtagelse af højre øvre og midterste lapper. Undgå at beskadige IVC i færd med at udføre lobectomies.
- Slut kardioplegi slangen til aorta kanyle og administrere kontinuerlig kardioplegi mens modtageren er under udarbejdelse. Placer hjerte-lunge transplantat i en steril beholder (fx et bægerglas).
3. Modtager Operation
- Bedøver modtageren som pr donoren operation, ovenfor. Brug dyrlæge salve for at beskytte dyrets øjne fra tørhed. Bekræft anæstesi hyppigt af pedal knivspids.
- Placer dyret som pr donor operation, denne gang forlader højre forben fri til at overvåge vitale tegn og anæstetisk dybde.
- Barbere maven fra xiphisternum til penis. Barbere en lille region af den venstre lyske (til efterfølgende IV adgang). Påfør endepilating middel med de udløsende overflader, vente ca. 5 minutter og fjerne hår med et stykke gaze.
- Prep de kirurgiske websteder med en povidon-iod eller chlorexidine-baseret løsning. Infiltrere incisional steder med 0,1-0,5% lidokain subkutant.
- Tracheotomize og ventilere modtageren som anvist ovenfor. Alternativt opretholde modtageren under næsen-kegle anæstesi.
- Indføre et kateter i den femorale vene som beskrevet ovenfor. Injicer 300-500 IU ufraktioneret heparin gennem IV-slange, og skyl derefter slangen med 3-5 ml saltvand.
- Udfør en laparotomi ved at lave en midterlinjen abdominal incision med en 22-klinge skalpel fra xiphisternum til penis. Træk bugvæggen ved hjælp af en selvstændig fastholde retraktor. Dernæst trække tarme overlegent og rottens venstre side. Pak dem i varmt, saltvand-gennemblødt gaze.
- Udsætte IVC og abdominale aorta ved skarpt dissekere gennem den overliggende retro-peritoneal fedt.
- Har en buet beholder klemme tilgængelige og klar.
- Periferisk befri IVC og aorta proksimalt og distalt og omringe dem med 4-0 silke bånd. Der skal være ca. 2-3 cm mellemrum mellem disse steder.
- Forsigtigt anvende buede kar klemme, der sikrer, at en tilstrækkelig del af både IVC og aorta eksponeres over kæberne på klemmen.
- Lave et snit i den forreste væg af IVC med en 25 G nål forbundet til en saltopløsningsfyldt 1 ml sprøjte. Forlænge snittet med Potts saks til at matche længden af donor IVC åbningen.
- Fjern hjerte-lunge transplantat fra dets beholder og afmontere det fra kardioplegi. Placere implantatet i modtagerens abdomen i en optimal position for at udføre den venøs anastomose.
BEMÆRK: hjerte-lunge transplantat vil i sidste ende være orienteret lidt skråt, med toppunktet peger mod maven s venstre nedre kvadrant. - Fastgør hælenog tå ender af anastomosen med 9-0 nylon sutur. Bind en sikker knude i hver ende, forlader nål fastgjort til en lang arm sutur, og en kort ende af suturen at være bundet til senere. Administrere en dosis af kardioplegi.
- I køreklar mode, komplet halvdelen af sutur linje og slips til det modstående korte sutur arm. Administrere en dosis af kardioplegi.
- Gennemfør den anden halvdel af sutur linje og binde den ned. Den venøse anastomose er fuldendt. Administrere en dosis af kardioplegi
- Vend hjerte-lunge transplantat med hjertets apex peger mod maven s venstre nedre kvadrant. Sørg for, at venøs anastomose ikke er bøjet eller snoet.
- Vurdere længden af donor aorta, der vil være nødvendig for at nå modtageren aorta, vedligeholdelse både IVC og aorta anastomoser i spændinger-fri og un-knæk konfigurationer.
- Opdel den nedadgående aorta (distalt til venstre subclavia arterie) med en iris saks.
- Få et incision i den forreste væg af recipienten aorta med en 25 G nål forbundet til en saltopløsningsfyldt 1 ml sprøjte. Forlænge snittet med Potts saks til at matche længden af donor aorta åbning.
- Forankre tå (superior aspekt) af donor aorta til modtageren aorta bruge en 9-0 nylon sutur. Derefter passerer nålen til den mediale side af aorta og fuldføre halvdelen af anastomosen i køreklar måde.
- Ved hælen af aorta anastomose, vende orienteringen af suturen linje (en overgang i retning af syning), og fuldføre laterale halvdel af anastomose i køreklar måde.
- Langsomt fjerne IV kateter i SVC, og liger SVC med en kirurgisk klip.
- De-air aorta ved at finde ikke-klippet venstre almindelige carotidarterie. Hold arterien åben, i en oprejst position, som vil tillade luft at blive frit evakueret.
- Kortvarigt åbne kæberne af den buede kar klemme og tillade halspulsåren til at bløde (de-luft) til 2 - 3 sek. Re-anvende fartøjet klemme.
- Anvende en kirurgisk klemme til halspulsåren. Fjern den buede kar klemme.
- Check for blødning ved suturlinjer. Hvis tilstede, forsigtigt kompression med kirurgisk gaze eller reparation med en længde på 9-0 nylon sutur (afhængigt af sværhedsgraden af blødningen).
- Donorhjertet bør genoptage slå inden for få minutter.
- Vær meget opmærksom på modtagerens vitale tegn, dybde af anæstesi, og administrere volumen genoplivning efter behov.
- Afhængigt af de eksperimentelle endpoints, enten lukke dyrets mave og lad det komme fra anæstesi, eller forberede dyret for kardiovaskulær vurdering.
BEMÆRK: Eksempler på graft vurdering inkluderer in vivo målinger af load-afhængige og load-uafhængige hæmodynamik, in vitro-foranstaltninger til funktion i Langendorff og arbejdsgrupper hjerte modes, og (i overlevelse kirurgi) ekkokardiografiske eller MR undersøgelser. - Vedende af akutte terminale forsøg blev dyrene aflivet ved forblødning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den HAHLT teknik beskrevet ovenfor, er meget teknisk og kræver stor opmærksomhed for detaljer. Tabel 1 fremhæver nogle af de vigtigste faktorer i forbindelse med vellykket versus mislykkede procedurer, og kan bruges som en guide til fejlfinding tekniske vanskeligheder.
Efter modtageren aorta er fastspændt, bør graft koronararterier ses at fylde med iltet blod. Derfor bør myokardiet bliver pink og godt perfunderet. I teknisk vellykkede eksperimenter, vil hjertet begynder at slå kort efter graft reperfusion. Podning skal efterlades i en ubelastet tilstand (med modtager IVC fastspændt) i en periode på mindst 20 - 30 min for at tillade funktionel restitution. Efter denne, kan transplantatet er belastningstilstande ændres til at passe eksperimentelle formål. Kan anvendes flere kvantitative mål for transplantatfunktion (og et vellykket resultat) som ønsket. Som nævnt i protokollen, in vivo og in vitro funktionelle studier, samt ekkokardiografisk og MR undersøgelser kan give sådanne oplysninger. Figur 1 og 2 er eksempler på in vitro-baseline og preload-okklusion tryk-volumen data, der kan udledes akut med denne metodologi. Hæmodynamiske data fra disse studier kan give efterforskerne med minutvolumen, slagvolumen, kammer volumen, puls, uddrivningsfraktion, ultimo systolisk elastans, og forbelastning recruitable slagtilfælde arbejde. Flere andre parametre kan kvantificeres som ønsket.
Figur 1. Baseline Pressure volumen data. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1 viser baseline trykure volumen data fra en in vitro arbejder hjerte vurdering af hjertefunktionen. EDB, slutdiastolisk volumen; EDP, slutdiastolisk tryk; ESV, ultimo systolisk volumen; ESP, ultimo systoliske blodtryk.
Figur 2. Preload-okklusion Pressure volumen data. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 viser preload-okklusion tryk-volumen data fra en in vitro arbejder hjerte vurdering af hjertefunktionen. EDPVR, ultimo diastolisk tryk-volumen forhold; ESPVR, ultimo systolisk tryk-volumen forhold.
| Vellykket Procedure | Mislykket Procedure | |
| Donor | ||
| Donor Stabilitet | Stabil | Ustabil |
| Forberedende Dissektion | Effektiv, Limited | Ineffektive, Overdreven |
| Blodtab | Minimal | Overdreven |
| Tid til eksplanteres | Minimeret | Langvarig |
| Cardioplegisk Arrest | Rapid | Forsinket |
| Graft | ||
| Total iskæmisk tid | <90 min | > 90 min |
| Cardioplegisk Arrest | Vedligeholdt Periodisk | Ufuldstændig |
| Modtager | ||
| Modtager Stabilitet | Stabil | Ustabil |
| Forberedende Dissektion | Effektiv | Ineffektiv |
| Clamp Times | <45 min | > 45 min |
| Anastomose Time | <30 min | > 30 min |
| Blodtab | Minimal | Overdreven |
| Graft De-luftning | Tilstrækkelig | Utilstrækkelig |
| Volume Genoplivning | Tilstrækkelig | Utilstrækkelig |
| Vellykket Reperfusion | Ja | Ingen |
| Return of Stable hjertefunktion | Ja | Ingen |
Tabel 1. Karakteristik af Vellykket Versus Mislykkede HAHLT Procedurer.
Tabel 1 </ Strong> giver eksempler på faktorer forbundet med vellykket og mislykket donor, graft, og modtagerlandene operationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Succes med teknikken beskrevet her, vil være afhængig af flere faktorer. Key blandt dem vil være at sikre stabilitet i både donor- og modtagerlande dyr, vedtage omhyggelige operativ teknik, der er sikkert og forbundet med minimal blodtab, sikrer komplet cardioplegisk anholdelse med ensartet graft køling, minimerer den samlede iskæmisk tid, og tilstrækkeligt de-luftning transplantatet. Som erkendt ovenfor teknikken tekniske kompleksitet er dens største begrænsning.
Vi har avancerede tidligere HAHLT teknikker i flere henseender. De i donor- og modtager operationer modifikationer er et middel til at udføre nødvendige operative trin på en kontrolleret og effektiv måde. Den myokardiebeskyttelse beskrevne protokol er en ideel måde at minimere skade i den iskæmiske periode. Slutresultatet er en HAHLT graft, hvor geometri er blevet optimeret, er skaden blevet minimeret, og iboende transplantatfunktion har været preserveret i størst muligt omfang.
Teknikken er beskrevet ovenfor giver et HAHLT transplantat med dynamiske og potentielt nær-fysiologiske ventrikel-belastningsforhold. Når teknikken er blevet mestrer de transplantation konfiguration tillader komplet in vivo karakterisering af transplantatfunktion. Som bemærket, kan de forspændte og afterload betingelser ændres akut eller kronisk, og donor lunge kan akut re-ventileret. Efterforskere kan let og bredt anvende denne model til studiet af mange medicinske tilstande, og samtidig bevare evnen til at studere graft struktur og funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Mark J. Kearns modtager støtte fra UBC Behandleren Investigator Program (tildelt via Royal College of Physicians og kirurger i Canada), og UBC 4YF Doctoral Fellowship.
John H. Boyd er en National sanitorium Association og Michael Smith Foundation for Health Research Scholar. Finansiering gennem CIHR. Forfatterne vil gerne takke Dr. M. Allard og Richard Wamboldt for deres hjælp med opsætning og vedligeholdelse af perfusion udstyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Celsior Cardioplegic Soution | Genzyme | The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications. | |
| Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | Model 683 | |
| Vital Sign Monitor | Nonin | Model 9847V | Displays SpO2 and heart rate. |
| IV Cannulae | Jelco | 3063 | 24 - 26 G x 3/4" cannulae. |
| IV Tubing | CareFusion | MP9259-C | Short-length connector tubing (18 cm). |
| Surgical Clips | Teleflex Medical | 001204 | Horizon titanium ligating clips. |
| Sutures | Ethicon, Sharpoint | LA54G, AK-0107 | 3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle). |
| Surgical Instruments | Not Applicable | Not Applicable | The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company. |
References
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S. A technique for heart transplantation in the rat. Arch Surg. 89 (1964), 649-652 (1964).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Exp Clin Transplant. 9 (2), 128-133 (2011).
- Wiedemann, D., Boesch, F., Schneeberger, S., Kocher, A., Laufer, G., Semsroth, S. Graft function after heterotopic rat heart transplant with an isolated reperfused working heart: a methodic consideration. Exp Clin Transplant. 10 (2), 154-157 (2012).
- Chen, Z. H., Xia, S. S. The technique of heterotopic heart-lung transplantation in the rat. J Tongji Med Univ. 6 (2), 67-70 (1986).
- Ibrahim, M., Navaratnarajah, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. J Surg Res. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Asfour, B., Hare, J. M., et al. A simple new model of physiologically working heterotopic rat heart transplantation provides hemodynamic performance equivalent to that of an orthotopic heart. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 927-936 (1999).
- Figueiredo, J. -L., Nahrendorf, M., Sosnovik, D. E., Weissleder, R. MRI of a novel murine working heart transplant model. Circ Heart Fail. 2 (3), 272-274 (2009).
- Wen, P., Wang, X., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplant Proc. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Didié, M., Biermann, D., et al. Preservation of left ventricular function and morphology in volume-loaded versus volume-unloaded heterotopic heart transplants. A.Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (4), H533-H541 (2013).
- Galiñanes, M., Zhai, X., Hearse, D. J. The effect of load on atrophy, myosin isoform shifts and contractile function: studies in a novel rat heart transplant preparation. J Mol Cell Cardiol. 27 (1), 407-417 (1995).
- Yokoyama, H., Ohmi, M., Murata, S., Nakame, T., Tabayashi, K., Mohri, H. Proposal of a working left heart model with a heterotopic transplantation technique in rats. J Heart Lung Transplant. 14 (4), 706-712 (1995).
- Maruyama, T., Swartz, M. T., McBride, L. R., Pennington, D. G. Working heart model of heterotopic heart-lung transplantation in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 107 (1), 210-215 (1994).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J Vis Exp. (59), 3496-3410 (2012).
- Habertheuer, A., Kocher, A., et al. Innovative, simplified orthotopic lung transplantation in rats). J Surg Res. 185 (1), 419-425 (2013).
