Protocol
Todos los animales fueron alojados y atendidos de conformidad con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y Nacional. Ética aprobación de este protocolo fue concedido por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales de la Columbia Británica. Hombre, ratas Sprague-Dawley que pesaban entre 300-450 g se utilizaron para este protocolo.
1. Donante Operación
- Tienen aproximadamente 100 ml de cardioplegia (RT) en un matraz cilíndrico conectado a (IV) tubo de catéter intravenoso de largo por una llave de paso de 3 vías. Utilice un soporte para elevar el frasco aproximadamente 80 cm por encima de la superficie operativa, permitiendo la entrega cardioplejia por gravedad.
- Para visualizar adecuadamente las estructuras, utilizar un par de lupas quirúrgicas o un microscopio de disección.
NOTA: Actualmente usamos un microscopio quirúrgico binocular con 3,4 - magnificación 21.3X. - Coloque el donante en una cámara anestésica e inducir la anestesia con 4-5% isoflurano. Traslado a la rata a una plataforma operativa y mantener la anestesia por la nariz de cono con 1 - 2% de isoflurano. Aplique un ungüento veterinario para los ojos del animal para evitar la sequedad. Administrar midazolam (2 mg / kg) por vía intraperitoneal con una aguja 25 G.
- El uso de máquinas de cortar quirúrgicas, afeitarse el donante de xiphisternum de mandíbula. Shave una pequeña región de la ingle izquierda (para el acceso posterior IV). Aplicar un agente de depilación a las superficies operativas, espere aproximadamente 5 minutos, y quitar el pelo con un pedazo de gasa.
- Prepara los sitios quirúrgicos con una solución a base de clorhexidina o povidona yodada (sólo usamos clorhexidina). Infíltrate en los sitios de incisión con 0,1 a 0,5% por vía subcutánea de lidocaína.
- Asegure las extremidades anteriores y miembro posterior izquierdo de la plataforma operativa con cinta adhesiva, dejando la extremidad posterior derecha libre para monitorización de la profundidad anestésica y los signos vitales.
- Después de asegurarse de la profundidad anestésica adecuada por pizca pedal, hacer una incisión en el pliegue de la ingle izquierda usandoun bisturí 22-cuchilla. Por disección roma, exponer la vena femoral común izquierda y obtener acceso IV de la siguiente manera:
- Retractar suavemente el tejido que recubre la vena femoral y canular la vena con un 24 G IV. Conecte el IV a un tramo corto de tubo IV lleno de solución salina, y asegurar el tubo en su lugar con cinta adhesiva.
NOTA: El procedimiento para la canulación venosa femoral en ratas se describe en otro lugar por Jespersen y sus colegas 14. - Conectar una jeringa de 10 ml lleno de solución salina al tubo IV, y suavemente aspirar sangre para asegurar el correcto posicionamiento de la IV.
- Inyectar 300 a 500 UI de heparina no fraccionada a través del tubo IV, y lavar posteriormente el tubo con de 3 - 5 ml de solución salina.
- Retractar suavemente el tejido que recubre la vena femoral y canular la vena con un 24 G IV. Conecte el IV a un tramo corto de tubo IV lleno de solución salina, y asegurar el tubo en su lugar con cinta adhesiva.
- A continuación, tracheotomize el donante como sigue:
- Hacer una incisión en los tejidos blandos entre la escotadura yugular y la mandíbula utilizando un bisturí 22-hoja. Penetrar la cápsula de la glándula tiroides en la línea media usando Metzentijeras Baum, y separados de sus lóbulos mediante disección roma.
- Utilizando disección roma, separar los músculos de la correa del cuello en la línea media para exponer la superficie anterior de la tráquea.
- Utilice unas pinzas curvas para diseccionar sin rodeos un plano circunferencial alrededor de la tráquea. Rodear la tráquea con una corbata de seda 4-0.
- Usando tijeras iris, hacer una incisión transversal en la tráquea anterior, aproximadamente 5 mm por debajo del cartílago tiroides. Introducir suavemente la cánula traqueal (un 14 G IV) y fijarlo en su lugar con el empate 4-0 seda.
- Conectar la cánula traqueal a un ventilador mecánico. Redirigir el flujo de oxígeno e isoflurano a través del circuito del ventilador, y ventilar el donante a una velocidad y volumen tidal predicho por su peso 13.
- Hacer una incisión en la línea media del pecho (utilizando un bisturí de hoja 22), que se extiende de la incisión en la muesca yugular a por debajo de la xipisternum.
- Alojarse en la línea media, Realice una esternotomía media con un cortador de hueso. Retraer los bordes del esternón con un retractor de auto-retención. Introduzca el pericardio y cavidades pleurales.
- Realice una timectomía. Es más fácil de dividir primero sin rodeos el timo en la línea media, y luego separarla de las estructuras circundantes utilizando una combinación de disección roma y cortante.
NOTA: El origen de las arterias torácicas internas puede ser herido cuando diseccionando el timo de los bordes esternales superiores. Para prevenir el sangrado, clips hemostáticos se pueden aplicar antes de retirar el timo en estos puntos. - Con unas tijeras de Metzenbaum y / o un fuerte Lauer, diseccionar peri-cava grasa lejos de la vena cava inferior (VCI). Asegúrese de que el IVC está relativamente libre de grasa y tejido conectivo de la unión cavo fibrilación superiormente, al diafragma inferiormente.
- Usando un fuerte Lauer, circunferencialmente libre de la vena cava superior (VCS) y rodear con un empate 4-0 seda.
- A continuación, diseccionar ella izquierda de la vena cava, sin estructuras circundantes, y ligarlo proximal y distal con 4-0 corbatas de seda. Resecar la porción intermedia de cava para exponer la arteria subclavia izquierda.
- Circunferencialmente gratis los vasos del cayado aórtico mediante un fuerte Lauer. Aplicar clips quirúrgicos proximal y distal a la arteria innominada, y dividirlo entre los clips. Deja la arteria carótida común izquierda y un-recortado la arteria subclavia izquierda.
- A continuación, canular la vena cava superior con un catéter de 24 G IV. Asegure el catéter con el colocado previamente 4-0 corbata de seda.
- Prepárese para una cosecha conveniente, pero suave injerto.
- Con unas tijeras afiladas, divida el IVC simplemente superior a la superficie diafragmática. Divida la SVC superior a su sitio de canulación, asegurando que las estructuras de las vías respiratorias cercanos no están heridos.
- Apague el ventilador y desconecte la cánula traqueal. Seccionar la tráquea proximal.
- Sujete la tráquea seccionado con unas pinzas, y quitar el corazóny los pulmones en bloque. Esto requerirá una tracción suave con disección aguda como se retira el injerto de corazón-pulmón. Separar la tráquea desde el esófago subyacente. Evite lesionarse la aorta descendente, por lo que una buena parte de ella se mantiene intacta después de la cosecha.
2. Preparación del corazón-pulmón Graft
NOTA: al completar esta parte del procedimiento, un asistente debe ser anestesiar el roedor destinatario y la preparación para la implantación del injerto.
- Coloque el injerto de corazón-pulmón en gasa quirúrgica con la superficie anterior del corazón hacia abajo. El uso de la disección aguda, eliminar cualquier esófago residual, evitando daños a las vías respiratorias posteriores.
- Localice la aorta torácica descendente e insertar una cánula de punta roma 16 G. Fije la cánula en su lugar con un empate 4-0 seda.
- Localice los vasos del cayado aórtico, y aplicar un clip quirúrgico a la arteria subclavia izquierda. Deja la arteria carótida izquierda un-recortado para subsecuente de-emisión.
- Administrar la primera dosis de cardioplegia mediante la conexión de la tubería de cardioplegia a la cánula aórtica 16 G. La arteria carótida debe ser ocluida temporalmente con fórceps para asegurar la entrega adecuada de cardioplejía.
NOTA: Una de las ventajas de tener la cánula aórtica adjunta es que cardioplejia se puede administrar de forma continua y / o de forma intermitente si lo deseas. Para la dosificación intermitente, que normalmente entregamos cardioplejia cada 10 - 15 min en 5 ml bolos sobre 30 - 45 seg. - Con unas tijeras de Metzenbaum y / o un fuerte Lauer, diseccionar la grasa peri-aórtica lejos de la aorta. Asegúrese de que la aorta es relativamente libre de grasa y tejido conectivo de la arteria subclavia izquierda (arco distal) a su sitio de canulación.
- A continuación, exponer el bronquio principal izquierdo usando un fuerte Lauer, y ligarlo proximal con una corbata de seda 4-0. Seccionar el bronquio izquierdo distal a la ligadura usando tijeras iris. Realice una neumonectomía izquierda ligando el pulmonar izquierdaarteria y vena con 4-0 corbatas de seda. Seccionar distal a la ligadura y quitar el pulmón izquierdo.
- Como anteriormente, eliminar todos los otros lóbulos pulmonares con la excepción de los lóbulos superior y medio derechos. Evite lesionar el IVC en el proceso de realizar lobectomías.
- Conectar el tubo de cardioplegia a la cánula aórtica y administrar cardioplegia continua mientras se prepara el destinatario. Coloque el injerto de corazón-pulmón en un recipiente estéril (por ejemplo, un vaso de precipitados).
3. Receptor Operación
- Anestesiar el receptor como por el funcionamiento de los donantes, arriba. Use ungüento veterinario para proteger los ojos del animal de la sequedad. Confirme la anestesia frecuentemente por pizca pedal.
- Coloque el animal como por la operación de los donantes, esta vez dejando la extremidad anterior derecha libre para monitorear los signos vitales y la profundidad anestésica.
- Afeitarse el abdomen de xiphisternum al pene. Shave una pequeña región de la ingle izquierda (para el acceso posterior IV). Aplique unaagente de depilación a las superficies operativas, espere aproximadamente 5 minutos, y quitar el pelo con un pedazo de gasa.
- Prepara los sitios quirúrgicos con povidona yodada o solución a base de clorhexidina. Infíltrate en los sitios de incisión con 0,1 a 0,5% por vía subcutánea de lidocaína.
- Tracheotomize y ventilar el receptor como se indicó anteriormente. Alternativamente, mantener el receptor bajo anestesia nariz de cono.
- Introducir un catéter en la vena femoral como se describe anteriormente. Inyectar 300 a 500 UI de heparina no fraccionada a través del tubo IV, y lavar posteriormente el tubo con de 3 - 5 ml de solución salina.
- Realice una laparotomía haciendo una incisión abdominal en la línea media con un bisturí 22 palas de xiphisternum al pene. Retirar la pared abdominal utilizando un retractor auto-retención. A continuación, retraer los intestinos superior y al lado izquierdo de la rata. Envuelva en caliente gasa empapada en solución salina.
- Exponer la aorta abdominal por IVC y bruscamente la disección a través de la suprayacente regrasa-tro peritoneal.
- Tener una pinza vaso curvado disponible y listo.
- Circunferencialmente liberar el IVC y la aorta proximal y distal y rodearlos con 4-0 corbatas de seda. No debe ser de aproximadamente 2-3 cm de espacio entre estos sitios.
- Aplicar cuidadosamente la abrazadera curvada recipiente, asegurándose de que una porción suficiente de ambos IVC y la aorta están expuestas por encima de las mandíbulas de la pinza.
- Hacer una incisión en la pared anterior de la IVC con una aguja 25 G conectada a una jeringa de 1 ml lleno de solución salina. Extender la incisión con tijeras Potts para que coincida con la longitud de la donante IVC orificio.
- Retire el injerto de corazón-pulmón de su contenedor y desconéctelo de cardioplejía. Coloque el injerto en el abdomen del receptor en una posición óptima para realizar la anastomosis venosa.
NOTA: El injerto de corazón-pulmón en última instancia, estar orientada ligeramente oblicua, con el vértice apuntando hacia la década de abdomen dejó cuadrante inferior. - Asegure el talóny dedo del pie, extremos de la anastomosis con sutura de nylon 9-0. Haga un nudo seguro en cada extremo, dejando la aguja unida a un brazo largo de la sutura, y un extremo corto de la sutura que estar atado a más tarde. Administrar una dosis de cardioplejía.
- En el funcionamiento de la moda, completa la mitad de la línea de sutura y corbata para el brazo de sutura corto opuestas. Administrar una dosis de cardioplejía.
- Complete la otra mitad de la línea de sutura y atarlo. La anastomosis venosa es completa. Administrar una dosis de cardioplejía
- Oriente el injerto de corazón-pulmón con vértice apuntando del corazón hacia los del abdomen dejó cuadrante inferior. Asegúrese de que la anastomosis venosa no está doblado o retorcido.
- Evaluar la longitud de la aorta del donante que se requiere para llegar a la aorta destinatario, manteniendo tanto IVC y anastomosis aórtica en configuraciones libres de tensión y un-retorcidas.
- Divida la aorta descendente (distal a la arteria subclavia izquierda) con una tijera iris.
- Hacer una incision en la pared anterior de la aorta destinatario con una aguja 25 G conectada a una jeringa de 1 ml lleno de solución salina. Extender la incisión con tijeras Potts para que coincida con la longitud del orificio aórtico donante.
- Anclar el dedo del pie (cara superior) de la aorta donante al receptor aorta utilizando una sutura de nylon 9-0. A continuación, pasar la aguja con el aspecto medial de la aorta y completar la mitad de la anastomosis en el funcionamiento de la moda.
- En el talón de la anastomosis aórtica, invertir la orientación de la línea de sutura (una transición en la dirección de la costura), y completar el medio lateral de la anastomosis en el funcionamiento de la moda.
- Retire lentamente el catéter IV en la vena cava superior, y ligar la vena cava superior con una pinza quirúrgica.
- De aire la aorta mediante la localización de la arteria carótida común-un recortado izquierda. Mantener abierta la arteria, en una posición vertical que permitirá que el aire sea evacuado libremente.
- Abrir brevemente las mandíbulas de la pinza vaso curvo y permite la arteria carótida a sangrar (de-aire) por 2 - 3 seg. Vuelva a aplicar la pinza buque.
- Aplicar un clip quirúrgico a la arteria carótida. Retire la abrazadera vaso curvo.
- Compruebe si hay sangrado en las líneas de sutura. Si está presente, aplicar compresión suave con una gasa o la reparación quirúrgica con una longitud de sutura de nylon 9-0 (dependiendo de la gravedad de la hemorragia).
- El corazón del donante debe reanudar superando en cuestión de minutos.
- Preste mucha atención a los signos vitales del beneficiario, la profundidad de la anestesia, y administrar el volumen de reanimación, según sea necesario.
- Dependiendo de los criterios de valoración experimentales, ya sea cerrar abdomen del animal y dejar que se recupere de la anestesia, o preparar el animal para la evaluación cardiovascular.
NOTA: Los ejemplos de evaluación de injerto incluyen en las medidas in vivo de la hemodinámica dependiente de la carga y la independiente de la carga, las medidas in vitro de la función en Langendorff y modos de trabajo del corazón y (en la cirugía de la supervivencia) ecocardiográficos o investigaciones de resonancia magnética. - En elfinal de los experimentos terminales agudas, los animales son sacrificados por desangramiento.
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Representative Results
La técnica HAHLT descrito anteriormente es muy técnico y requiere mucha atención a los detalles. Tabla 1 se destacan algunos de los principales factores asociados con éxito frente a los procedimientos fallidos, y pueden ser utilizados como una guía para la solución de problemas dificultades técnicas.
Después se suelta la aorta destinatario, las arterias coronarias del injerto deben ser vistos a llenarse de sangre oxigenada. En consecuencia, el miocardio se convierta en rosa y buena perfusión. En experimentos técnicamente exitosos, el corazón comenzará a latir poco después de la reperfusión del injerto. El injerto debe dejarse en un estado descargado (con destinatario IVC sujeta) por un período de al menos 20 - 30 min para permitir la recuperación funcional. Después de eso, las condiciones de carga del injerto pueden ser alterados para adaptarse fines experimentales. Más medidas cuantitativas de la función del injerto (y un resultado exitoso) se pueden emplear como se desee. Como se señala en el protocolo, en vivo en estudios in vitro funcionales, así como ecocardiográfico e investigaciones de RM puede proporcionar dicha información. Las figuras 1 y 2 son ejemplos de línea de base in vitro y la precarga-oclusión de datos de presión-volumen que se pueden derivar de forma aguda con esta metodología. Los datos hemodinámicos de estos estudios pueden proporcionar a los investigadores con el gasto cardiaco, el volumen sistólico, volúmenes de cámara, la frecuencia cardiaca, la fracción de eyección, elastancia telesistólico y precargar trabajo sistólico reclutable. Varios otros parámetros se pueden cuantificar, si lo deseas.
Figura 1. Base de presión-volumen de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La figura 1 muestra la prensa de línea de basedatos ure volumen de una evaluación cardíaca de trabajo in vitro de la función cardíaca. EDV, el volumen diastólico final; EDP, la presión diastólica final; ESV, el volumen sistólico final; ESP, final de la presión sistólica.
Figura 2. precarga-oclusión de presión-volumen de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La figura 2 muestra la precarga-oclusión datos de presión-volumen de una evaluación cardíaca de trabajo in vitro de la función cardíaca. EDPVR, relación presión-volumen diastólico final; ESPVR, relación presión-volumen telesistólico.
| Procedimiento Exitosa | Procedimiento sin éxito | |
| Donante | ||
| Estabilidad del Donante | Estable | Inestable |
| Preparatoria Disección | Eficiente, Limited | Ineficiente, excesivo |
| Pérdida De Sangre | Mínimo | Excesivo |
| Es hora de explante | Minimizado | Prolongado |
| Arresto cardioplégico | Rápido | Retrasado |
| Injerto | ||
| Tiempo total isquémica | <90 min | > 90 min |
| Arresto cardioplégico | Mantenido Periódicamente | Incompleto |
| Beneficiario | ||
| Estabilidad de destinatarios | Estable | Inestable |
| Preparatoria Disección | Eficiente | Ineficiente |
| Clamp Tiempos | <45 min | > 45 min |
| Anastomosis Tiempo | <30 min | > 30 min |
| Pérdida De Sangre | Mínimo | Excesivo |
| Injerto De-emisión | Adecuado | Insuficiente |
| Reanimación de volumen | Adecuado | Insuficiente |
| Reperfusión exitosa | Sí | No |
| Retorno de la función cardiaca estable | Sí | No |
Tabla 1. Características de éxito versus Procedimientos HAHLT sin éxito.
Tabla 1 </ Strong> ofrece ejemplos de los factores asociados a los donantes con éxito y sin éxito, de injerto, y las operaciones de receptores.
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Discussion
El éxito con la técnica descrita aquí se basa en varios factores. Clave entre ellos será garantizar la estabilidad tanto de los animales donantes y receptores, la adopción de la técnica quirúrgica meticulosa que es seguro y asociado con mínima pérdida de sangre, lo que garantiza la detención cardioplégica completo con un enfriamiento uniforme del injerto, lo que minimiza el tiempo de isquemia total y adecuadamente de-a transmitirse el injerto. Como ha reconocido anteriormente, la complejidad técnica de la técnica es su principal limitación.
Hemos avanzado técnicas HAHLT anteriores en varios aspectos. Las modificaciones descritas en las operaciones de donantes y receptores proporcionan un medio de realizar los pasos operativos necesarios de una manera controlada y eficiente. El protocolo de protección miocárdica se describe es un medio ideal de minimizar las lesiones durante el período isquémico. El resultado final es un injerto HAHLT en el que la geometría se ha optimizado, lesión ha sido minimizado, y la función intrínseca de injerto ha sido preservido en la mayor medida posible.
La técnica descrita anteriormente se obtiene un injerto con HAHLT condiciones ventricular-carga dinámica y, potencialmente, cerca-fisiológicos. Una vez que la técnica se ha dominado, los permisos completos en la caracterización in vivo de la función del injerto de configuración trasplante. Como se ha indicado, las condiciones de precarga y la poscarga se pueden alterar de forma aguda o crónica, y pulmón donante puede ser aguda re-ventilados. Los investigadores pueden aplicar fácilmente y ampliamente este modelo para el estudio de muchas condiciones médicas, al tiempo que conserva la capacidad para estudiar la estructura y la función del injerto.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Mark J. Kearns recibe el apoyo del Programa UBC clínico Investigador (otorgado por el Colegio Real de Médicos y Cirujanos de Canadá), y el UBC 4YF Doctoral Fellowship.
John H. Boyd es una Asociación Nacional sanatorio y Michael Smith Fundación para la Investigación de la Salud Escolar. La financiación a través de CIHR. Los autores desean agradecer al Dr. M. Allard y Richard Wamboldt por su ayuda con la instalación y mantenimiento de equipos de perfusión.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Celsior Cardioplegic Soution | Genzyme | The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications. | |
| Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | Model 683 | |
| Vital Sign Monitor | Nonin | Model 9847V | Displays SpO2 and heart rate. |
| IV Cannulae | Jelco | 3063 | 24 - 26 G x 3/4" cannulae. |
| IV Tubing | CareFusion | MP9259-C | Short-length connector tubing (18 cm). |
| Surgical Clips | Teleflex Medical | 001204 | Horizon titanium ligating clips. |
| Sutures | Ethicon, Sharpoint | LA54G, AK-0107 | 3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle). |
| Surgical Instruments | Not Applicable | Not Applicable | The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company. |
References
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