Protocol
Все животные были размещены и уход в соответствии с национальными и институциональные рекомендации по уходу и использованию лабораторных животных. Утверждение этики для этого протокола был предоставлен университетом комитета по уходу за животными Британской Колумбии. Мужской, Спрэг Dawley крыс весом от 300 - 450 г были использованы для этого протокола.
Операция 1. Донор
- У примерно в 100 мл кардиоплегии (RT) в цилиндрической колбе, подключенного к длительного внутривенного (IV) трубки катетера с помощью 3-ходовым запорным краном. Используйте подставку, чтобы поднять колбу примерно 80 см выше поверхности оперативного, позволяет доставку КАРДИОПЛЕГИИ под действием силы тяжести.
- Для визуализации структур адекватно использовать либо пару хирургических луп или рассекает микроскоп.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы в настоящее время используют бинокулярного микроскопа с операционной 3.4 - 21.3X увеличения. - Поместите донора в анестезиологической камеры и вызывают анестезию 4 - 5% изофлуран. Перевести крысу операционной платформы и поддержания анестезии по носового конуса с 1 - 2% изофлуран. Применить ветеринар мазь для глаз животного, чтобы предотвратить сухость. Администрирование мидазолам (2 мг / кг) внутрибрюшинно с иглой 25 G.
- Использование хирургических ножницы, брить донора от мечевидного отростка до нижней челюсти. Бритье небольшую область в левой паховой области (для последующего доступа IV). Нанесите средство для удаления волос на рабочих поверхностей, подождите примерно 5 мин, и удалить волосы с куском марли.
- Приготовительный хирургические участки с раствором повидон-йод или chlorexidine основе (мы используем только хлоргексидин). Проникнуть инцизионная сайты с 0,1 - 0,5% лидокаина подкожно.
- Закрепите передние конечности и левой задней конечности операционной платформе с клейкой лентой, оставляя правую задней конечности бесплатно для мониторинга глубины анестезии и жизненно важных.
- После обеспечения надлежащего глубину анестезирующего по педали крайнем случае, сделать надрез в левой паховой складки с помощью22-лезвие скальпеля. По тупым, выставить левую общую бедренную вену и получить доступ IV следующим образом:
- Аккуратно убрать ткань, лежащую в бедренную вену, и иглу в вену с 24 G IV. Подключите IV в короткой длины соленой заполненные трубки IV, и закрепите трубку в месте с клейкой лентой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура бедренной венозной катетеризации у крыс описана в других по Jespersen и коллег 14. - Подключите солевой заполненные 10 мл шприц с трубкой IV, и мягко аспирации крови, чтобы обеспечить правильное позиционирование IV.
- Вводите 300 - 500 МЕ нефракционированного гепарина через трубопровод IV, а затем промойте трубки с 3 - 5 мл физиологического раствора.
- Аккуратно убрать ткань, лежащую в бедренную вену, и иглу в вену с 24 G IV. Подключите IV в короткой длины соленой заполненные трубки IV, и закрепите трубку в месте с клейкой лентой.
- Далее, tracheotomize донора следующим образом:
- Сделайте срединный разрез в мягких тканях между яремной вырезки и нижней челюсти с использованием 22-лезвие скальпеля. Проникнуть капсулу щитовидной железы в средней линии, используя МетценBaum ножницы, и отдельные его доли, использующие тупым.
- Использование тупым, отделить ремень мышцы шеи по средней линии, чтобы разоблачить передней поверхности трахеи.
- Используйте изогнутые щипцы прямо рассекать по окружности плоскости вокруг трахеи. Обхватите трахеи с 4-0 шелковый галстук.
- Использование диафрагмы ножницами, сделать поперечный разрез в передней трахеи, примерно 5 мм ниже щитовидного хряща. Аккуратно ввести трахеи канюли (14 г IV) и закрепите его на месте с помощью 4-0 шелковый галстук.
- Подключите трахеи канюли с механической ИВЛ. Перенаправление потока кислорода и изофлураном через цепь вентилятора, и проветрите донора в размере и дыхательного объема прогнозируемого своим весом 13.
- Сделайте надрез по средней линии груди (с использованием 22-лезвие скальпеля), расширяя разрез на яремной выемкой ниже в xipisternum.
- Пребывание в средней линии, Выполните средний стернотомию используя резак кости. Уберите края грудины с самоудерживающийся втягивающим. Введите перикарда и плевральной полости.
- Выполните тимэктомия. Проще всего сначала тупо разделить тимус в средней линии, а затем отделить его от окружающих структур, используя комбинацию тупым и острым рассечение.
ПРИМЕЧАНИЕ: происхождение внутренних грудных артерий может быть ранен, когда рассекает тимуса от вышестоящих грудных ребер. Чтобы предотвратить кровотечение, кровоостанавливающие зажимы могут быть применены перед удалением тимуса в этих точках. - Использование Metzenbaum ножницы и / или резкое Лауэр, рассекают пригородных вены жира от нижней полой вены (НПВ). Убедитесь, что ИВЦ является относительно свободной от жира и соединительной ткани от каво-предсердий перехода сверху, с диафрагмой книзу.
- Используя острый Лауэр, по окружности бесплатно верхней полой вены (ВПВ) и окружить его с 4-0 шелковый галстук.
- Далее, рассекатьосталось полой вены свободной от окружающих структур, и перевязывать его проксимально и дистально с 4-0 шелковых галстуков. Резецировать вмешиваясь часть вены, чтобы выставить левую подключичную артерию.
- По окружности бесплатно дуги аорты суда, использующие резкое Лауэр. Применить проксимальных и дистальных хирургические зажимы в безымянной артерии, и разделить его между клипами. Оставьте левую общую сонную артерию и левой подключичной артерии ООН-обрезанную.
- Далее, иглу ВПВ с катетером 24 G IV. Закрепите катетер с ранее размещенных 4-0 шелковый галстук.
- Подготовка к целесообразной, но нежным урожая трансплантата.
- Использование острыми ножницами, разделить IVC просто превосходит поверхности диафрагмы. Разделите SVC превосходит его катетеризации сайте, гарантируя, что около структуры дыхательных путей не пострадал.
- Выключите вентилятор и отсоедините трахеи канюли. Трансекте трахеи проксимально.
- Возьмитесь за перерезают трахеи пинцетом и удалить сердцеи легкие блочный. Это потребует нежное сцепление с резким вскрытия, как трансплантат сердца легких удаляется. Отделите трахею от основной пищевода. Не повредить нисходящей аорты, так что длинные часть его остается неизменным после сбора урожая.
2. Подготовка сердце-легкие трансплантат
ПРИМЕЧАНИЕ: время завершения этой части процедуры, помощник должен быть обезболивающее грызунов получателя и готовится к имплантации трансплантата.
- Поместите трансплантат сердца легких на хирургическое марли с передней поверхности сердца, обращенной вниз. Использование острый рассечение, удалить остатки пищевод, избегая травм задних дыхательных путей.
- Найдите нисходящей грудной аорты и вставьте 16 G тупым наконечником канюли. Закрепите канюли в месте с 4-0 шелковый галстук.
- Найдите дуги аорты сосудов, и применить хирургическое клип на левой подключичной артерии. Оставьте левую сонную артерию ООН отсечение субсеквенция де-проветривание.
- Администрирование первая доза кардиоплегии при подключении труб кардиоплегии в аорты канюли 16 G. Сонной артерии должны быть временно окклюзии щипцами, чтобы обеспечить адекватную доставку кардиоплегии.
ПРИМЕЧАНИЕ: польза от аорты канюли прилагается, что кардиоплегию можно вводить непрерывно и / или периодически, как желательно. Для прерывистого дозирования, мы обычно доставить КАРДИОПЛЕГИИ каждый 10 - 15 мин в 5 мл болюсов в течение 30 - 45 сек. - Использование Metzenbaum ножницы и / или резкое Лауэр, рассекают пери-аортальный жир от аорты. Убедитесь, что аорта относительно свободной от жира и соединительной ткани от левой подключичной артерии (дистальный) арки к ее катетеризации сайта.
- Далее, выставить левую mainstem бронхов, используя острый Лауэр, и перевязывать его проксимально с 4-0 шелковый галстук. Трансекте левого бронха дистальнее лигатуры, используя диафрагмы ножницы. Выполните левый пневмонэктомии путем лигирования левой легочнойартерии и вены с 4-0 шелковых галстуков. Трансекте дистальнее лигатуры и удалить левое легкое.
- Как указано выше, удалить все другие долей легких, за исключением правых верхних и средних долей. Избегайте ранив IVC в процессе выполнения lobectomies.
- Подключите шланг к кардиоплегии аорты канюли и управлять непрерывный кардиоплегии в то время как получатель готовится. Поместите трансплантат сердца легких в стерильный контейнер (например, стакана).
3. Получатель Эксплуатация
- Обезболить получатель, как в работе доноров, выше. Используйте ветеринар мазь для защиты глаз животного от сухости. Подтвердите анестезии часто по педали крайнем случае.
- Поместите животное, как в работе доноров, на этот раз оставляя правую переднюю конечность свободное контролировать жизненно важные признаки и глубины анестезии.
- Бритье живот от мечевидного отростка к пенису. Бритье небольшую область в левой паховой области (для последующего доступа IV). Применитьэпиляции агента в рабочих поверхностей, подождите примерно 5 мин, и удалить волосы с куском марли.
- Приготовительный хирургические участки с повидон-йодом или chlorexidine-решения. Проникнуть инцизионная сайты с 0,1 - 0,5% лидокаина подкожно.
- Tracheotomize и проветрите получателя, как указано выше. Кроме того, поддерживать емкость под нос конуса анестезии.
- Ввести катетер в бедренную вену, как описано выше. Вводите 300 - 500 МЕ нефракционированного гепарина через трубопровод IV, а затем промойте трубки с 3 - 5 мл физиологического раствора.
- Выполните лапаротомии путем срединный разрез брюшной с 22 лезвиями скальпеля от мечевидного отростка к пенису. Уберите брюшной стенки с использованием самоудерживающийся втягивающим. Далее, убрать кишечника сверху и слева крысы. Оберните их в теплой соленой, пропитанной марли.
- Expose аорты IVC и брюшной резким рассекает через вышележащие ReТро-перитонеального жира.
- Есть изогнутый зажим судно доступны и готовы.
- По окружности освободить IVC и аорты проксимально и дистально и окружить их с 4-0 шелковых галстуков. Там должно быть примерно 2 - 3 см пространства между этими сайтами.
- Осторожно применять изогнутые зажим сосудов, обеспечивая достаточную часть как IVC и аорты подвергаются выше челюстей зажима.
- Сделать разрез в передней стенке нижней полой вены с иглой 25 G, подключенного к физиологическим заполненные 1 мл шприца. Расширьте разрез с ножницами Поттс, чтобы соответствовать длине донора IVC отверстия.
- Удалить трансплантат сердца легких из контейнера и отключите его от кардиоплегии. Поместите трансплантата в животе получателя в оптимальном положении для выполнения венозный анастомоз.
ПРИМЕЧАНИЕ: трансплантата сердце-легкое, в конечном счете быть ориентированы наклонно немного, с вершины указывая на живот годов в левом нижнем квадранте. - Безопасный каблуки ног заканчивается анастомоза с 9-0 нейлона шва. Tie безопасное узел на каждом конце, в результате чего иглу, прикрепленную к длинного плеча шва, а короткий конец нити, чтобы быть привязаны к позже. Администрирование дозу кардиоплегии.
- В управлении моде, полная половина линии шва и галстук на противоположной короткой шва руку. Администрирование дозу кардиоплегии.
- Заполните вторую половину шва и связать его вниз. Венозный анастомоз завершена. Администрирование дозу кардиоплегии
- Восточный трансплантата сердце-легкое с верхушки указывая сердца к живота годов в левом нижнем квадранте. Убедитесь, что венозная анастомоза не перекручен или витой.
- Оценить длину донорской аорты, которые будут необходимы для достижения аорты получатель, поддерживая как IVC и аорты анастомозов в натяжных свободной и снимите с изломом конфигураций.
- Разделите нисходящую аорту (дистальнее левой подключичной артерии) с ножницами ириса.
- Сделать incisioн в передней стенке аорты реципиента с иглой 25 G, подключенного к физиологическим заполненные 1 мл шприца. Расширьте разрез с ножницами Поттс, чтобы соответствовать длине донора аорты отверстия.
- Закрепите палец (выше аспект) донора аорты получателю аорты с помощью 9-0 нейлона шов в. Затем пропустите иглу в медиальной части аорты и завершить половину анастомоза в управлении моду.
- В пятой аорты анастомоза, обратный ориентацию линии шва (перехода в направлении строчки), и завершить боковую половину анастомоза в управлении моду.
- Медленно снимите IV катетер в ВПВ, и перевязывать ВПВ с хирургической клипа.
- Де-воздух аорты путем размещения не-обрезается левой общей сонной артерии. Удерживая артерию открытой, в вертикальном положении, что позволит воздуху свободно эвакуировать.
- Кратко открыть челюсти изогнутой зажима сосуда и позволяют сонной артерии кровотечение (dе-воздух) для 2 - 3 сек. Re-применять зажим сосудов.
- Нанесите хирургического клип на сонной артерии. Снимите изогнутый зажим сосудов.
- Проверьте кровотечение шовных линий. Если присутствует, нежный сжатие с хирургической марли или ремонта длиной 9-0 нейлоновой нити (в зависимости от интенсивности кровотечения).
- Донорское сердце должно возобновить избиения в течение нескольких минут.
- Обратите пристальное внимание на жизненно важных получателя, глубины анестезии, и управлять громкости реанимации мере необходимости.
- В зависимости от экспериментальных конечных точек, либо закрыть живот животного, и пусть он оправиться от наркоза, или подготовить животное для сердечно-сосудистой оценке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры оценки трансплантата включают в естественных мер в зависимости от нагрузки и нагрузки зависит гемодинамики, меры в пробирке функции в Langendorff и режимы работы сердца, и (в хирургии выживания) эхокардиографии или МРТ исследования. - Наконец острых терминальных экспериментов, животные эвтаназии кровопусканием.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Техника HAHLT описано выше, сугубо технический и требует пристального внимания к деталям. Таблица 1 приведены некоторые из ключевых факторов, связанных с успешным по сравнению с неудачных процедур, и могут быть использованы в качестве руководства для устранения неполадок с техническими трудностями.
После аорты получатель unclamped, привитые коронарных артерий следует рассматривать заполнить кислородом крови. Соответственно, миокард должен стать розовый и хорошо перфузии. В технически успешных экспериментов, сердце начнет биться вскоре после трансплантата реперфузии. Трансплантат должен быть оставлен в ненагруженном состоянии (с получателем IVC зажат) в течение по меньшей мере 20 - 30 мин, чтобы позволить для восстановления функций. После этого, условия нагрузки трансплантата может быть изменен в соответствии с экспериментальными целей. Могут быть использованы Другие количественные меры функции трансплантата (и успешного исхода) по желанию. Как отмечено в протоколе, в естественных условиях в пробирке функциональных исследований, а также эхокардиографии и МРТ исследований может предоставить такую информацию. Цифры 1 и 2 являются примерами экстракорпорального базовой линии в и поджать окклюзии данные давления громкости, которые могут быть получены остро с этой методологии. Гемодинамические данные этих исследований могут обеспечить следователям сердечного выброса, ударного объема, объемы камеры, частоты сердечных сокращений, фракции выброса, конечного систолического эластичности и поджать recruitable работу хода. Некоторые другие параметры могут быть определены количественно, если это желательно.
Рисунок 1. Исходные давления объем данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 1 показан базовый нажмитеЮр-объем данных из рабочей в пробирке оценки сердечной функции сердца. КДО, конечного диастолического объема; EDP, конечного диастолического давления; ESV, объем конечного систолического; ESP, конец систолическое давление.
Рисунок 2. Предварительная загрузка окклюзии давления объем данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 показывает поджать-окклюзия данные давления объем от в пробирке рабочего оценки сердечной функции сердца. EDPVR, конечного диастолического давления объем отношения; ESPVR, конец систолическое давление-объем отношений.
| Успешное Порядок | Неудачный Порядок | |
| Донор | ||
| Донор Стабильность | Стабильный | Неустойчивый |
| Подготовительный Рассечение | Эффективное ограниченной | Неэффективное, Чрезмерное |
| Потеря Крови | Минимальный | Чрезмерное |
| Время эксплантата | Минимизация | Длительный |
| Кардиоплегического Арест | Быстрый | Задерживается |
| Трансплантат | ||
| Всего Ишемическая Время | <90 мин | > 90 мин |
| Кардиоплегического Арест | Поддерживается Периодически | Неполный |
| Получатель | ||
| Получатель Стабильность | Стабильный | Неустойчивый |
| Подготовительный Рассечение | Эффективный | Неэффективное |
| Зажим раз | <45 мин | > 45 мин |
| Анастомоз Время | <30 мин | > 30 мин |
| Потеря Крови | Минимальный | Чрезмерное |
| Прививка Де-трансляция | Адекватный | Недостаточный |
| Объем реанимации | Адекватный | Недостаточный |
| Успешное Реперфузия | Да | Нет |
| Возвращение Стабильный функции сердца | Да | Нет |
Таблица 1. Характеристики Успешная Versus Неудачные процедуры HAHLT.
Таблица 1 </ STRONG> предоставляет примеры факторов, связанных с успешной и неудачной донора, взяточничества и операций получателей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успех с методикой, описанной здесь будет основываться на нескольких факторах. Ключевой среди них будет обеспечение стабильности как доноров, так и получателей животных, приняв тщательного технику операции, что является безопасным и ассоциируется с минимальной кровопотерей, обеспечивая полную кардиоплегический арест с равномерным охлаждением трансплантата, минимизируя общее время ишемического и адекватно де-трансляция трансплантата. Как признается выше, техническая сложность техники является ее главным ограничением.
Мы выдвигали предыдущие методы HAHLT в нескольких отношениях. Изменения, описанные в доноров и реципиентов операций обеспечивают средства выполнения необходимых оперативных мер в контролируемой и эффективной манере. Протокол защита миокарда описанная идеальным средством минимизации травм во время ишемического периода. Конечным результатом является HAHLT трансплантат, в котором геометрия оптимизирована, травмы было сведено к минимуму, а внутренняя функция трансплантата была предварительнослужил в максимально возможной степени.
Описанная методика дает HAHLT трансплантата с динамическими и потенциально почти физиологических условиях желудочка загрузкой. После того, как техника была освоена, то разрешения конфигурации трансплантации комплектные естественных характеристик функции трансплантата. Как отмечалось, предварительной нагрузки и постнагрузки условия могут быть изменены остро или хронически, и донор легких может быть остро повторно вентилируемые. Следователи легко и широко применить эту модель для изучения многих медицинских условий, при этом сохраняя возможность изучить структуру и функции трансплантата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Марк Дж Кернс получает поддержку от клинициста следователь Программы UBC (вручается по Королевского колледжа врачей и хирургов Канады), и UBC 4YF исследовательских стипендий.
Джон Х. Бойд Национальная ассоциация санатория и Майкл Смит Фонд исследований в области здравоохранения Scholar. Финансирование через CIHR. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра М. Аллард и Ричард Wamboldt за помощь в установке и обслуживании оборудования перфузии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Celsior Cardioplegic Soution | Genzyme | The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications. | |
| Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | Model 683 | |
| Vital Sign Monitor | Nonin | Model 9847V | Displays SpO2 and heart rate. |
| IV Cannulae | Jelco | 3063 | 24 - 26 G x 3/4" cannulae. |
| IV Tubing | CareFusion | MP9259-C | Short-length connector tubing (18 cm). |
| Surgical Clips | Teleflex Medical | 001204 | Horizon titanium ligating clips. |
| Sutures | Ethicon, Sharpoint | LA54G, AK-0107 | 3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle). |
| Surgical Instruments | Not Applicable | Not Applicable | The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company. |
References
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S. A technique for heart transplantation in the rat. Arch Surg. 89 (1964), 649-652 (1964).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Exp Clin Transplant. 9 (2), 128-133 (2011).
- Wiedemann, D., Boesch, F., Schneeberger, S., Kocher, A., Laufer, G., Semsroth, S. Graft function after heterotopic rat heart transplant with an isolated reperfused working heart: a methodic consideration. Exp Clin Transplant. 10 (2), 154-157 (2012).
- Chen, Z. H., Xia, S. S. The technique of heterotopic heart-lung transplantation in the rat. J Tongji Med Univ. 6 (2), 67-70 (1986).
- Ibrahim, M., Navaratnarajah, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. J Surg Res. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Asfour, B., Hare, J. M., et al. A simple new model of physiologically working heterotopic rat heart transplantation provides hemodynamic performance equivalent to that of an orthotopic heart. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 927-936 (1999).
- Figueiredo, J. -L., Nahrendorf, M., Sosnovik, D. E., Weissleder, R. MRI of a novel murine working heart transplant model. Circ Heart Fail. 2 (3), 272-274 (2009).
- Wen, P., Wang, X., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplant Proc. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Didié, M., Biermann, D., et al. Preservation of left ventricular function and morphology in volume-loaded versus volume-unloaded heterotopic heart transplants. A.Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (4), H533-H541 (2013).
- Galiñanes, M., Zhai, X., Hearse, D. J. The effect of load on atrophy, myosin isoform shifts and contractile function: studies in a novel rat heart transplant preparation. J Mol Cell Cardiol. 27 (1), 407-417 (1995).
- Yokoyama, H., Ohmi, M., Murata, S., Nakame, T., Tabayashi, K., Mohri, H. Proposal of a working left heart model with a heterotopic transplantation technique in rats. J Heart Lung Transplant. 14 (4), 706-712 (1995).
- Maruyama, T., Swartz, M. T., McBride, L. R., Pennington, D. G. Working heart model of heterotopic heart-lung transplantation in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 107 (1), 210-215 (1994).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J Vis Exp. (59), 3496-3410 (2012).
- Habertheuer, A., Kocher, A., et al. Innovative, simplified orthotopic lung transplantation in rats). J Surg Res. 185 (1), 419-425 (2013).
