Protocol
すべての動物を飼育し、実験動物の管理と使用のための国家と制度ガイドラインに従って世話しました。このプロトコルの倫理承認は、ブリティッシュコロンビア州の動物管理委員会の大学によって付与されました。 300との間体重の雄、SDラット - 450 gが、このプロトコルのために使用しました。
1.ドナー操作
- 3方活栓によって、長い静脈内（IV）カテーテル管に接続された円筒形フラスコに心臓麻痺（RT）の約100ミリリットルを持っています。重力によって心停止提供を可能にする、約80センチメートル作用表面の上にフラスコを上昇させるために、スタンドを使用してください。
- 適切な構造を可視化するために、外科手術用ルーペのペアまたは解剖顕微鏡のどちらかを使用します。
注：我々は現在、3.4で双眼手術用顕微鏡を使用する - 21.3X倍率。 - 麻酔室にドナーを置き、4で麻酔を誘導 - 5％イソフルラン。 オペレーティングプラットフォームにラットを移し、1とノーズコーンにより麻酔を維持 - 2％イソフルラン。乾燥を防ぐために、動物の目に獣医軟膏を適用します。 25 G針でミダゾラム（2ミリグラム/ kg）を腹腔内に投与します。
- 手術用バリカンを使用して、剣状突起から下顎にドナーを剃ります。 （その後のIVアクセスのための）左鼠径部の小さな領域を剃ります。作用面に脱毛剤を塗布、約5分間待機し、ガーゼで髪を削除します。
- 準備ポビドンヨードまたはchlorexidineベースのソリューションで手術部位（我々は唯一のクロルヘキシジンを使用します）。 0.5％リドカイン皮下 - 0.1と切開部位に潜入。
- 麻酔深度とバイタルサインのモニタリングのための無料の右後肢を残して、粘着テープを使用してオペレーティング·プラットフォームに前肢と左後肢を固定します。
- ペダルピンチすることにより、適切な麻酔深度を確認した後、使用して、左鼠径部の折り目に切開を作ります22ブレードメス。鈍的切開によって、左大腿静脈を露出させ、次のように静脈アクセスを取得します。
- 静かに大腿静脈を覆う組織を撤回し、24のG IVで静脈にカニューレを挿入。生理食塩水で満たされたIVチューブの短い長さにIVを接続し、粘着テープで所定の位置にチューブを固定します。
注：ラットにおける大腿静脈カニューレ挿入のための手順はイェスペルセンや同僚14によって他の箇所に記載されています。 - IVチューブに生理食塩水を充填した10mLのシリンジを接続し、静かにIVの正確な位置決めを確実にするために血液を吸引します。
- IVチューブを通して未分画ヘパリンの500 IU、その後3でチューブをフラッシュ - - 300を注入し、生理食塩水5mlの。
- 静かに大腿静脈を覆う組織を撤回し、24のG IVで静脈にカニューレを挿入。生理食塩水で満たされたIVチューブの短い長さにIVを接続し、粘着テープで所定の位置にチューブを固定します。
- 次に、以下のようにドナーをtracheotomize：
- 22ブレードメスを用いて頸静脈ノッチと下顎の間の軟組織に正中切開を行います。 Metzenを使用して、正中線に甲状腺のカプセルに浸透バウムはさみ、および鈍的切開を使用して、そのローブを分離します。
- 鈍的切開を使用して、気管の前面を露出させるために正中線にネックストラップの筋肉を分離します。
- ぶっきらぼうに気管の周りに周面を分析するために、湾曲鉗子を使用してください。 4-0絹のネクタイと気管を取り囲みます。
- アイリスはさみを使用して、前方気管内に横切開を行い、甲状軟骨の約5ミリメートル劣ります。静かに気管カニューレ（14 G IV）を導入し、4-0絹のネクタイを使用して所定の位置に固定します。
- 人工呼吸器に気管カニューレを接続します。人工呼吸器回路を通る酸素およびイソフルランの流れをリダイレクトし、速度、重量13によって予測された一回換気量でドナーを換気。
- 胸の正中線で切開を行います（22ブレードメスを用いて）、xipisternum以下に頸静ノッチで切開部を拡張します。
- 正中線での滞在、骨のカッターを用いて胸骨正中切開を行います。自己保持リトラクターと胸骨のエッジを後退させます。心膜および胸膜腔を入力します。
- 胸腺摘出を行います。それは最初ぶっきらぼうに正中線で胸腺を分割し、その後鈍、鋭い切開の組み合わせを使用して、周囲の構造から分離するのが最も簡単です。
注：離れて優れた胸骨縁から胸腺を解剖時に内胸動脈の起源は、けがをする恐れがあります。出血を防ぐために、止血クリップは、これらの点で、胸腺を除去する前に適用してもよいです。 - Metzenbaumはさみを使用して、および/またはシャープラウアー、下大静脈（IVC）から離れた脂肪ペリ大静脈解剖。 IVCは、下方ダイヤフラムに、上方カーボ心房接合部から脂肪と結合組織の比較的自由であることを確認してください。
- シャープラウアーを使用して、円周方向に上大静脈（SVC）を解放し、4-0絹のネクタイとそれを取り囲みます。
- 次に、解剖周囲の構造のない大静脈を離れ、近位および遠位4-0シルクネクタイとそれを連結します。左鎖骨下動脈を露出させるために静脈の介在部分を切除します。
- 円周方向に鋭いラウアーを使用して、大動脈弓の血管を解放します。腕頭動脈の近位および遠位の外科手術用クリップを適用して、クリップの間にそれを分けます。左総頸動脈と左鎖骨下動脈の未クリップされたままにしておきます。
- 次に、24 G IVカテーテルでSVCにカニューレを挿入。以前に配置された4-0絹のネクタイでカテーテルを固定します。
- 好都合が、穏やかなグラフト収穫の準備をします。
- 鋭いハサミを使用して、横隔膜面にだけ優れたIVCを分割。近くの気道構造が負傷されていないことを確認して、そのカニューレ挿入部位への優れたSVCを分割します。
- 人工呼吸器の電源をオフにして、気管カニューレを外します。近位に気管を横断。
- 鉗子で横に切開気管を持ち、心を削除肺エン圏。心肺移植片が除去されるように、これは鋭い解剖で穏やかなトラクションが必要になります。基本となる食道から気管を分離します。それの長い部分は収穫後そのまま残るように、下行大動脈を傷つけないように注意してください。
心肺移植片の調製
注：この手順のこの部分を完了しながら、アシスタントが受信者のげっ歯類を麻酔し、移植片移植の準備をする必要があります。
- 下に向けて、心臓の前面に手術用ガーゼに心肺移植片を配置します。鋭い解剖を使用して、後部気道への損傷を回避すること、任意の残留食道を削除します。
- 降順胸部大動脈の位置を確認し、16 Gの鈍先端のカニューレを挿入します。 4-0絹のネクタイで所定の位置にカニューレを固定します。
- 大動脈弓の血管を見つけ、左鎖骨下動脈に外科用クリップを適用します。サブ国連クリップされ、左頸動脈を残しますシークエントの脱気。
- 16 G大動脈カニューレに心臓麻痺チューブを接続することにより、心停止の最初の用量を投与。頸動脈は一時的に心臓麻痺の適切な供給を確保するために鉗子で閉塞されなければなりません。
注：添付の大動脈カニューレを有することの利点は、所望のように心臓麻痺を連続的および/または断続的に投与され得ることです。 45秒 - 30以上の5ミリリットルのボーラスで15分 - 間欠投与のために、我々は、典型的には、すべての10心筋保護を提供します。 - Metzenbaumはさみおよび/または鋭いラウアーを使用して、離れて大動脈から周囲の大動脈脂肪を分析。大動脈は、その挿管サイトに左鎖骨下動脈（遠位弓）からの脂肪および結合組織の比較的自由であることを確認してください。
- 次に、鋭いラウアーを使用して、左主気管支を露出し、4-0絹のネクタイと近位にそれを連結。アイリスのはさみを使用して、合字の左気管支の先端を横断。左肺を連結することにより、左肺全摘術を行います4-0シルクネクタイと動脈と静脈。合字に遠位横断し、左肺を削除します。
- 上記のように、右上と中央ローブの例外を除いて、他のすべての肺葉を削除します。 lobectomiesを行う過程でIVCを負傷しないようにします。
- 大動脈カニューレに心臓麻痺チューブを接続し、受信者が用意されている間、連続心臓麻痺を管理します。滅菌容器（ 例えば、ビーカー）で心肺移植片を配置します。
3.受信者の操作
- 上記、ドナー操作ごとに受信者を麻酔。乾燥状態から、動物の目を保護するために獣医軟膏を使用してください。ペダルピンチによって頻繁に麻酔を確認してください。
- ドナー操作ごとに動物を置き、この時間はバイタルサインと麻酔深度を監視すること自由に右前肢を残します。
- 剣状突起からペニスに腹部を剃ります。 （その後のIVアクセスのための）左鼠径部の小さな領域を剃ります。適用します作用面に薬剤を脱毛、約5分間待機し、ガーゼで髪を削除します。
- 準備ポビドンヨードまたはchlorexidineベースのソリューションで手術部位。 0.5％リドカイン皮下 - 0.1と切開部位に潜入。
- Tracheotomize上記指示されたように、受信者を換気。代わりに、ノーズコーン麻酔下での受信者を維持します。
- 上述したように、大腿静脈にカテーテルを導入します。 IVチューブを通して未分画ヘパリンの500 IU、その後3でチューブをフラッシュ - - 300を注入し、生理食塩水5mlの。
- 剣状突起から陰茎に22ブレードメスで腹部正中切開を行うことで、開腹術を行います。自己保持リトラクターを使用して腹壁を撤回。次に、上方およびラットの左側に腸を撤回。暖かい、生理食塩水に浸したガーゼでラップ。
- 急激にその上の再を通して解剖によってIVCと腹部大動脈を露出させますTRO-腹膜脂肪。
- 湾曲した血管のクランプが使用可能であり、準備ができています。
- 円周方向に近位および遠位IVCと大動脈を解放し、4-0シルクネクタイとそれらを取り囲みます。これらのサイトとの間の空間の3センチメートル - 約2が必要です。
- IVCと大動脈の両方の十分な部分がクランプのジョーの上に露出していることを確認して、湾曲した血管のクランプを慎重に適用されます。
- 生理食塩水を満たした1ml注射器に接続された25 G針でIVCの前壁の切開を行います。ドナーIVCのオリフィスの長さに合わせて、ポッツはさみで切開を拡張します。
- その容器から心肺移植片を取り外し、それは心停止から切断。静脈吻合を実行するために最適な位置に受信者の腹部に移植片を配置します。
注：腹部年代に向けて頂点ポインティングが下腹部を左に心肺移植片は、最終的には、少し斜めに配向することになります。 - かかとを固定とつま先は、9-0ナイロン縫合糸との吻合部の端部。縫合糸の長腕に取り付けられた針、およびそれ以降に接続するための縫合糸の短い方の端を残して、各端部に安全な結び目を作ります。心筋保護の用量を投与します。
- ファッションを実行するには、反対側の短い縫合糸アームに縫合線とネクタイの完全半分。心筋保護の用量を投与します。
- 縫合線の他の半分を完了し、それを結びます。静脈吻合が完了しました。心筋保護の用量を投与
- オリエントは、腹部のに向かって心の頂点ポインティングと心肺移植片は、下腹部を残しました。静脈吻合がよじれやねじれがないことを確認してください。
- テンションフリーと非ねじれた構成でIVCと大動脈吻合の両方を維持し、受信者の大動脈に到達するために必要とされるドナー大動脈の長さを評価します。
- アイリスハサミで（左鎖骨下動脈の遠位）下行大動脈を分割します。
- incisioを作りますnは生理食塩水を満たした1ml注射器に接続された25 G針でレシピエント大動脈の前壁で。ドナー大動脈オリフィスの長さに合わせて、ポッツはさみで切開を拡張します。
- 9-0ナイロン縫合糸を使用して、大動脈受信者にドナー大動脈のつま先（優れた側面）をアンカー。そして、大動脈の内側面に針を渡すとファッションの実行中に、吻合部の2分の1を完了します。
- 大動脈吻合のかかとでは、縫合線（ステッチの方向の遷移）の向きを逆にし、ファッションを実行するには吻合部の横方向の半分を完了します。
- ゆっくりSVCにIVカテーテルを除去し、外科手術用クリップでSVCを連結。
- 未クリップさ左総頸動脈を配置することにより脱空気大動脈。空気が自由に避難できるようになります直立姿勢で、オープン動脈を保持します。
- 簡単に言えば、D（湾曲した血管クランプのジョーを開き、頸動脈が出血することができます電子空気）2 - 3秒。血管クランプを再適用します。
- 頸動脈に外科用クリップを適用します。湾曲した血管のクランプを外します。
- 縫合線での出血を確認してください。存在する場合、（出血の重症度に応じて）9-0ナイロン縫合糸の長さの外科ガーゼや修復に穏やかな圧縮を適用します。
- ドナー心臓は、数分以内に暴行を再開する必要があります。
- 受信者のバイタルサイン、麻酔の深さに細心の注意を払い、必要に応じてボリュームの蘇生を管理します。
- 実験のエンドポイントに応じて、動物の腹部を閉じて、それが麻酔から回復させ、または心血管評価のために動物を準備するのどちらか。
注：移植性評価の例としては、負荷に依存し、負荷に依存しない血行動態の in vivoでの対策、 インビトロランゲンドルフ関数の対策と作業心臓モード、（生存手術で）心エコーやMRIの調査に含まれています。 - に急性端末実験の終わりに、動物を放血によって安楽死させます。
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Representative Results
上記のHAHLT技術は、高度な技術であり、詳細には細心の注意が必要です。 表1のハイライト失敗手順対成功に関連付けられており、技術的な問題のトラブルシューティングを行うためのガイドとして使用することができる重要な要因のいくつか。
受信者の大動脈がアンクランプされた後、グラフト冠状動脈は酸素を豊富に含んだ血液でいっぱいに見られるべきです。したがって、心筋はピンクとよく灌流になる必要があります。技術的には成功した実験では、心臓は移植再灌流後すぐに打つことを開始します。機能回復を可能にする30分 - グラフトは、少なくとも20の期間（IVCをクランプレシピエントと）無負荷状態のままにする必要があります。それに続いて、移植片の負荷条件は、実験の目的に合うように変更することができます。所望のように移植片機能（および成功した結果）のより定量的な尺度を用いることができます。プロトコルで述べたように、 インビボでの インビトロ機能的研究、ならびに心エコーやMRIの調査では 、このような情報を提供する1及び図2は、in vitroでのベースラインの例であり、この方法論を用いて急性誘導することができる圧力容量のデータ閉塞をプリロードすることができます。これらの研究からの血行動態データは、心拍出量、ストローク量、室容積、心拍数、駆出率、収縮末期エラスタンスで研究者を提供し、補充可能なストローク作業をプリロードすることができます。所望に応じて、いくつかの他のパラメータは、定量化することができます。
図1.ベースライン圧力容量のデータ。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図1は、ベースラインのプレスを示します心機能のin vitroでの作業心臓評価からURE容量のデータ。 EDV、拡張末期容積; EDP、拡張末期圧; ESV、収縮末期容積; ESP、収縮末期圧。
図2.予圧閉塞圧力容量のデータ。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2に示すように、心臓機能のin vitroでの作業心臓評価から圧-容積データ閉塞をプリロード。 EDPVR、拡張末期圧 - 容積関係。 ESPVR、収縮末期圧 - 容積関係。
| 成功した手順 | 失敗した手順 | |
| ドナー | ||
| ドナーの安定性 | 安定しました | 不安定な |
| 準備解剖 | 効率的な、限定 | 過剰な非効率的な、 |
| 失血 | 最小限の | 過度の |
| 外植までの時間 | 最小化 | 長引きます |
| 心臓麻痺逮捕 | 急速な | 遅延 |
| グラフト | ||
| 合計虚血時間 | <90分 | > 90分 |
| 心臓麻痺逮捕 | 定期的に維持 | 不完全 |
| 受信者 | ||
| 受信者の安定性 | 安定しました | 不安定な |
| 準備解剖 | 効率的な | 非効率的な |
| クランプタイムズ | <45分 | > 45分 |
| 吻合時間 | <30分 | > 30分 |
| 失血 | 最小限の | 過度の |
| グラフト脱気 | 十分な | 不十分な |
| ボリューム蘇生 | 十分な | 不十分な |
| 成功した再灌流 | はい | いいえ |
| 安定した心機能のリターン | はい | いいえ |
失敗HAHLT手順対成功の表1の特徴。
表1 </ strong>の成功と失敗のドナー、移植片、および受信者の操作に関連する因子の例を示します。
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Discussion
ここに記載の技術の成功は、いくつかの要因に基づいて予測されます。それらの中のキーは、両方のドナーとレシピエント動物の安定性を確保し、安全かつ最小限の血液損失に関連付けられている細心の手術技術を採用し、均一なグラフト冷却との完全な心停止停止を確保し、総虚血時間を最小限に抑え、かつ適切に移植片を脱気されます。上記認めたように、技術者の技術的な複雑さは、その主な制限です。
我々はいくつかの点で以前HAHLT技術を進めてきました。ドナーとレシピエントの動作で説明した変形例は、制御された効率的な方法で必要な動作ステップを実行する手段を提供します。記載心筋保護プロトコルは、虚血期間中に損傷を最小にする理想的な手段です。最終結果は、ジオメトリが傷害が最小化されている、最適化されており、固有の移植片機能があらかじめされたHAHLTグラフトであります可能な限り最大限に務めました。
上記の技術は、動的で、潜在的に近い生理的心室負荷条件でHAHLT移植片を生じます。技術を習得した後、移植片機能のインビボ特性評価における完全な移植構成許可。前述のように、予圧と後負荷条件は急性または慢性的に変更することができ、ドナー肺は急性再換気することができます。移植片の構造と機能を研究する能力を保持しながら、研究者は、容易にかつ広く、多くの医療条件の研究にこのモデルを適用することができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
マーク·J·カーンズは（医師とカナダの外科医のロイヤルカレッジオブを通じて受賞）UBC臨床医研究者プログラムからの支援を受け、UBC 4YF博士フェローシップ。
ジョン·H·ボイドは、ナショナルSanitorium協会と保健研究奨学生のためのマイケルスミス財団です。 CIHRを通じて資金調達。著者らは、灌流機器のセットアップやメンテナンスとの支援のために博士M.アラードとリチャードWamboldtに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Celsior Cardioplegic Soution | Genzyme | The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications. | |
| Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | Model 683 | |
| Vital Sign Monitor | Nonin | Model 9847V | Displays SpO2 and heart rate. |
| IV Cannulae | Jelco | 3063 | 24 - 26 G x 3/4" cannulae. |
| IV Tubing | CareFusion | MP9259-C | Short-length connector tubing (18 cm). |
| Surgical Clips | Teleflex Medical | 001204 | Horizon titanium ligating clips. |
| Sutures | Ethicon, Sharpoint | LA54G, AK-0107 | 3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle). |
| Surgical Instruments | Not Applicable | Not Applicable | The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company. |
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