Protocol
Todos os animais foram alojados e tratados em conformidade com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório e Nacional. Aprovação ética para este protocolo foi concedido pela Universidade do Comitê Animal Care da British Columbia. Macho, ratos Sprague-Dawley machos pesando entre 300-450 g foram usados para este protocolo.
1. Doador de Operação
- Possui cerca de 100 ml de solução cardioplégica (RT) em um balão cilíndrico ligado ao longo intravenosa (IV) por um tubo de cateter torneira de 3 vias. Use um suporte para elevar o balão a cerca de 80 centímetros acima da superfície de trabalho, permitindo a entrega cardioplegia por gravidade.
- Para visualizar estruturas adequadamente, use um par de lupas cirúrgicas ou um microscópio de dissecação.
NOTA: Atualmente usamos um microscópio cirúrgico binocular com 3.4 - ampliação 21.3X. - Coloque o doador em uma câmara de anestésico e induzir a anestesia com 4-5% de isoflurano. Transferir o rato a uma plataforma de operação e manutenção da anestesia através do nariz-cone com 1-2% de isoflurano. Aplicar veterinário pomada para os olhos do animal para prevenir o ressecamento. Administrar o midazolam (2 mg / kg), intraperitonealmente com uma agulha G 25.
- Usando cortadores cirúrgicos, raspar o doador do processo xifóide do esterno a mandíbula. Raspar uma pequena região da virilha esquerda (para acesso subsequente IV). Aplicar um agente para depilar as superfícies operativas, esperar cerca de 5 min, e remover o cabelo com um pedaço de gaze.
- Prepare os locais cirúrgicos com uma solução baseada em clorexidina iodopovidona ou (nós usamos somente clorexidina). Infiltrar nos sites incisional com 0,1-0,5% de lidocaína por via subcutânea.
- Obtenha os membros dianteiros e membro esquerdo para a plataforma operacional com fita adesiva, deixando o membro posterior direito livre para monitoramento de profundidade anestésica e os sinais vitais.
- Depois de assegurar a profundidade da anestesia adequada por pedal pitada, fazer uma incisão no sulco virilha esquerda usandoum bisturi 22-lâmina. Por dissecção romba, expor a veia femoral comum esquerda e obter acesso IV como se segue:
- Suavemente retrair o tecido que cobre o veia femoral, e canular a veia com um 24 g IV. Conecte o IV para um curto período de IV tubulação cheio de solução salina, e fixar o tubo no lugar com fita adesiva.
NOTA: O procedimento de punção venosa femoral em ratos é descrito em outros lugares por Jespersen e colegas 14. - Ligar uma seringa de 10 ml cheio de solução salina para a tubagem IV, e suavemente aspirar sangue para garantir o posicionamento correcto do IV.
- Injectar 300-500 UI de heparina não fraccionada através da tubagem IV, e, subsequentemente, lavar a tubagem com 3-5 ml de solução salina.
- Suavemente retrair o tecido que cobre o veia femoral, e canular a veia com um 24 g IV. Conecte o IV para um curto período de IV tubulação cheio de solução salina, e fixar o tubo no lugar com fita adesiva.
- Em seguida, o doador tracheotomize como se segue:
- Adicione uma incisão na linha média em tecidos moles entre o entalhe jugular e da mandíbula, utilizando um bisturi 22-lâmina. Penetrar a cápsula da glândula tireóide na linha média usando Metzentesoura Baum, e separados seus lóbulos usando dissecção romba.
- Utilizando uma dissecção romba, separar os músculos do pescoço cinta na linha média para expor a superfície anterior da traqueia.
- Use uma pinça curva sem rodeios para dissecar um plano circunferencial em torno da traquéia. Cercar a traqueia com um laço de seda 4-0.
- Usando uma tesoura de íris, fazer uma incisão transversal na traquéia anterior, aproximadamente 5 mm inferior à cartilagem tireóide. Suavemente introduzir a cânula traqueal (a 14 G IV) e fixá-lo no lugar usando o laço de seda 4-0.
- Conecte a cânula traqueal a um ventilador mecânico. Redirecionar o fluxo de oxigênio e isoflurano através do circuito do ventilador, e ventilar o doador a um ritmo e volume corrente previsto pelo seu peso 13.
- Realizar uma incisão na linha média do tórax (usando um bisturi 22-lâmina), estendendo-se a incisão na incisura jugular para um valor inferior a xipisternum.
- Mantendo-se na linha média, Executar uma esternotomia mediana usando um cortador de osso. Retrair as bordas do esterno com uma válvula de auto-retenção. Digite o pericárdio e cavidade pleural.
- Executar uma thymectomy. É mais fácil de dividir primeiro sem rodeios o timo na linha mediana, e então separá-lo de estruturas adjacentes usando uma combinação de dissecção brusca e precisa.
NOTA: A origem das artérias torácicas internas pode ser lesado quando dissecando o timo longe das bordas do esterno superiores. Para prevenir o sangramento, clipes hemostáticos pode ser aplicado antes de retirar o timo nesses pontos. - Com uma tesoura Metzenbaum e / ou um Lauer afiada, dissecar peri-cava gordura longe da veia cava inferior (VCI). Certifique-se de que a VCI é relativamente livre de gordura e tecido conjuntivo a partir da junção cavo-atrial superiormente, para o diafragma inferiormente.
- Usando um Lauer afiada, livre circunferencial da veia cava superior (SVC) e cercar-lo com um laço de seda 4-0.
- Em seguida, dissecar odeixou veia cava livre de estruturas adjacentes, e ligar-lo proximal e distal com 4-0 gravatas de seda. Ressecar a parte interveniente da cava para expor a artéria subclávia esquerda.
- Circunferencial livre os vasos do arco aórtico usando um Lauer afiado. Aplicar clips cirúrgicos proximal e distal à artéria inominada, e dividi-lo entre os clipes. Deixe a artéria carótida comum esquerda e un-cortado artéria subclávia esquerda.
- Em seguida, canular a SVC com um cateter 24 G IV. Fixe o cateter com o anteriormente colocado 4-0 gravata de seda.
- Prepare-se para uma colheita do enxerto expediente, mas suave.
- Usando uma tesoura afiada, dividir o IVC apenas superior à superfície diafragmática. Divida o SVC superior ao seu sítio de punção, assegurando que as estruturas das vias aéreas próximas não estão feridos.
- Desligue o ventilador e retire a cânula traqueal. Transecto a traqueia proximal.
- Segure a traquéia seccionado com uma pinça, e remover o coraçãoe pulmões em blocos. Isso vai exigir tração suave com dissecção afiada como o enxerto de coração-pulmão é removido. Separa-se a traqueia a partir do esófago subjacente. Evitar ferir a aorta descendente, de modo que uma grande parte dele permanece intacto após a colheita.
2. Preparação do Coração-pulmão Graft
NOTA: ao completar esta parte do procedimento, o assistente, deve ser anestesiar o roedor destinatário e se preparando para a implantação do enxerto.
- Inserir o enxerto de coração-pulmão de gaze cirúrgica com a superfície anterior do coração voltado para baixo. Usando dissecção afiada, remover qualquer esôfago residual, evitando prejuízo para as vias respiratórias posteriores.
- Localize a aorta torácica descendente e inserir um 16 G de ponta romba cânula. Segurar a cânula no lugar com uma gravata de seda 4-0.
- Localize os vasos do arco aórtico, e aplicar um grampo cirúrgico da artéria subclávia esquerda. Deixe a artéria carótida esquerda un-cortado para a subsequent de-aeração.
- Administrar a primeira dose de cardioplegia, ligando o tubo de cardioplegia à cânula aórtica 16 L. A artéria carótida deve ser temporariamente fechada com uma pinça para garantir a entrega adequada de cardioplegia.
NOTA: Uma vantagem de ter a cânula aórtica ligada é que cardioplegia pode ser administrada de forma contínua e / ou intermitente, como desejado. Para dosagem intermitente, que normalmente entregar cardioplegia cada 10 - 15 minutos em 5 ml bolus sobre 30 - 45 seg. - Com uma tesoura Metzenbaum e / ou um Lauer afiada, dissecar a gordura peri-aórtico longe da aorta. Certifique-se de que a aorta é relativamente livre de gordura e tecido conjuntivo a partir da artéria subclávia esquerda (arco distal) ao seu sítio de punção.
- Em seguida, expor o brônquio fonte esquerdo usando um Lauer afiada, e ligar-lo proximamente com um laço de seda 4-0. Transecto a distal brônquio esquerdo para a ligadura da íris usando uma tesoura. Executar uma pneumonectomia esquerda ligando o pulmonar esquerdaartéria e veia com 4-0 gravatas de seda. Transecto distal à ligadura e remover o pulmão esquerdo.
- Como acima, remover todos os outros lobos pulmonares com exceção dos lobos superior e médio direito. Evitar ferir o IVC no processo de realização de lobectomia.
- Ligue a tubagem de cardioplegia à cânula aórtica e administrar cardioplegia contínua, enquanto o destinatário está sendo preparado. Inserir o enxerto de coração-pulmão, num recipiente estéril (por exemplo, um copo).
3. Destinatário Operação
- Anestesiar destinatário de acordo com a operação de dador, acima. Use veterinário pomada para proteger os olhos do animal de secura. Confirme anestesia com freqüência por pedal pitada.
- Posicione o animal de acordo com a operação doador, desta vez deixando o membro anterior direito livre para monitorar os sinais vitais e profundidade anestésica.
- Raspar o abdômen do processo xifóide do esterno ao pênis. Raspar uma pequena região da virilha esquerda (para acesso subsequente IV). Aplique umaagente para depilar as superfícies operativas, esperar cerca de 5 min, e remover o cabelo com um pedaço de gaze.
- Prepare os locais cirúrgicos com um iodopovidona ou solução baseada clorexidina. Infiltrar nos sites incisional com 0,1-0,5% de lidocaína por via subcutânea.
- Tracheotomize e ventilar o destinatário como indicado acima. Como alternativa, manter o destinatário sob anestesia nariz-cone.
- Introduzir um cateter na veia femoral como descrito acima. Injectar 300-500 UI de heparina não fraccionada através da tubagem IV, e, subsequentemente, lavar a tubagem com 3-5 ml de solução salina.
- Executar uma laparotomia fazendo uma incisão na linha média abdominal com um bisturi 22-blade de processo xifóide do esterno ao pênis. Retrair a parede abdominal utilizando um afastador auto-retenção. Em seguida, retirar as entranhas superiormente e para o lado esquerdo do rato. Envolvê-los em, gaze embebida com solução salina quente.
- Expor a aorta abdominal IVC e por acentuadamente dissecando através da re sobrepostagordura tro-peritoneal.
- Ter uma braçadeira navio curvo disponível e pronto.
- Circunferencial libertar a VCI e aorta proximal e distal e cercar-los com laços de seda 4-0. Não deve ser de aproximadamente 2-3 cm de espaço entre estes sítios.
- Cuidadosamente aplicar o grampo vaso curvo, assegurando que uma porção suficiente de ambos VCI e aorta são expostos por cima das maxilas da peça de aperto.
- Realizar uma incisão na parede anterior da VCI com uma agulha de 25 G ligada a uma seringa de 1 ml cheio de solução salina. Estender a incisão com tesoura de Potts para corresponder ao comprimento do dador VCI orifício.
- Remova o enxerto de coração-pulmão de seu recipiente e desconecte-o cardioplegia. Coloque o enxerto no abdômen do destinatário em uma posição ideal para realizar a anastomose venosa.
NOTA: O enxerto de coração-pulmão acabará por ser orientada ligeiramente oblíqua, com o ápice apontando para as abdômen do quadrante inferior esquerdo. - Prenda o calcanhare dedo do pé termina da anastomose com 9-0 nylon de sutura. Dê um nó segura em cada extremidade, deixando a agulha ligada a um braço longo do fio de sutura e uma extremidade curta do fio de sutura para ser ligada a mais tarde. Administrar uma dose de cardioplegia.
- Na gestão de moda, completa a metade da linha de sutura e gravata para o braço adversária sutura curto. Administrar uma dose de cardioplegia.
- Complete a outra metade da linha de sutura e amarrá-lo para baixo. A anastomose venosa é completa. Administrar uma dose de cardioplegia
- Orient o enxerto de coração-pulmão com apontando o ápice do coração em direção aos abdômen do quadrante inferior esquerdo. Certifique-se de que a anastomose venosa não está dobrada ou torcida.
- Avaliar o comprimento da aorta do doador, que será necessária para alcançar a aorta do receptor, mantendo tanto IVC e anastomose da aorta em configurações livre de tensão e desdobrado.
- Divida a aorta descendente (distal à artéria subclávia esquerda) com uma tesoura de íris.
- Realizar uma incision na parede anterior da aorta do receptor com uma agulha de 25 G ligada a uma seringa de 1 ml cheio de solução salina. Estender a incisão com tesoura de Potts para corresponder ao comprimento do orifício aórtico dador.
- Ancorar o dedo do pé (aspecto superior) da aorta dador até ao receptor aorta utilizando uma sutura 9-0 nylon. Em seguida, passe a agulha para a face medial da aorta e completar metade da anastomose na execução de moda.
- No calcanhar da anastomose da aorta, inverter a orientação da linha de sutura (uma transição na direcção de costura), e concluir a metade lateral da anastomose no funcionamento da forma.
- Lentamente remover o cateter IV na SVC, e ligar o SVC com um grampo cirúrgico.
- De-ar da aorta, localizando a artéria carótida comum esquerda un-cortado. Segurar a artéria aberta, em posição vertical, que vai permitir que o ar a ser evacuado livremente.
- Resumidamente abrir as maxilas do grampo vaso curvo e permitir que a artéria carótida para sangrar (de-air) para 2-3 sec. Reaplicar o grampo navio.
- Aplique um grampo cirúrgico à artéria carótida. Remover o grampo vaso curvo.
- Verifique se há sangramento nas linhas de sutura. Se estiver presente, aplicar compressão suave com gaze cirúrgica ou de reparação com um comprimento de 9-0 sutura de nylon (dependendo da gravidade do sangramento).
- O coração do doador deve retomar batendo em poucos minutos.
- Preste atenção aos sinais vitais do destinatário, profundidade da anestesia, reanimação e administrar o volume conforme necessário.
- Dependendo dos endpoints experimentais, quer fechar abdômen do animal e deixá-lo recuperar da anestesia, ou preparar o animal para avaliação cardiovascular.
NOTA: Exemplos de avaliação de enxerto incluem em medidas in vivo de hemodinâmica dependente da carga e independente de carga, in vitro medidas de função em Langendorff e modos coração de trabalho, e (em cirurgia sobrevivência) ecocardiográficos ou inquéritos de ressonância magnética. - Nofinal de experiências agudas de terminais, os animais são sacrificados por exsanguinação.
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Representative Results
A técnica HAHLT descrito acima é altamente técnica e requer muita atenção aos detalhes. Tabela 1 destaca alguns dos principais fatores associados ao sucesso contra procedimentos mal sucedidos, e pode ser usado como um guia para a resolução de problemas dificuldades técnicas.
Após a aorta do receptor está desapertada, as artérias coronárias de enxerto deve ser visto a encher com sangue oxigenado. Assim, o miocárdio deve tornar-se rosa e bem perfundido. Em experimentos tecnicamente bem-sucedidos, o coração começa a bater logo após a reperfusão do enxerto. O enxerto deve ser deixado num estado sem carga (com destinatário VCI apertada) por um período de pelo menos 20 - 30 minutos para permitir a recuperação funcional. Depois disso, as condições de carga do enxerto pode ser alterado para se adequar objetivos experimentais. Mais medidas quantitativas da função do enxerto (e um resultado positivo) podem ser utilizados como desejado. Como observado no protocolo, in vivo em estudos funcionais in vitro, bem como ecocardiográfica e investigações de MRI pode fornecer essa informação. As Figuras 1 e 2 são exemplos de in vitro da linha de base e pré-carregar-oclusão de dados de pressão de volume que podem ser derivados de forma aguda com esta metodologia. Os dados hemodinâmicos destes estudos podem fornecer investigadores com o débito cardíaco, o volume sistólico, volumes de câmara, freqüência cardíaca, fração de ejeção, elastância sistólica-end, e pré-carga de trabalho do curso recrutável. Vários outros parâmetros pode ser quantificada, como desejado.
Figura 1. Linha de Base de Dados de pressão-volume. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 1 mostra imprensa linha de baseure dados de volume de uma avaliação cardíaca in vitro de trabalho da função cardíaca. EDV, volume diastólico final; EDP, pressão diastólica final; ESV, volume sistólico final; ESP, pressão sistólica final.
Figura 2. Preload-oclusão dados de pressão-volume. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 2 mostra-oclusão pré-carregar dados de pressão-volume de uma avaliação cardíaca in vitro de trabalho da função cardíaca. EDPVR, relação pressão-volume diastólica final; ESPVR, relação pressão-volume sistólico final.
| Procedimento de sucesso | Procedimento sem êxito | |
| Doador | ||
| Doador de Estabilidade | Estável | Instável |
| Preparatório Dissection | Eficiente, Limited | Ineficiente, excessiva |
| Perda De Sangue | Mínimo | Excessivo |
| Hora de Explante | Reduzido ao mínimo | Prolongado |
| Parada cardioplégica | Rápido | Atrasado |
| Enxerto | ||
| Total de tempo isquêmico | <90 min | > 90 min |
| Parada cardioplégica | Mantido Periodicamente | Incompleto |
| Beneficiário | ||
| Estabilidade Destinatário | Estável | Instável |
| Preparatório Dissection | Eficiente | Ineficiente |
| Braçadeira Vezes | <45 min | > 45 min |
| Anastomose Tempo | <30 min | > 30 min |
| Perda De Sangue | Mínimo | Excessivo |
| Enxerto De-aeração | Adequado | Inadequado |
| Volume Resuscitation | Adequado | Inadequado |
| A reperfusão bem-sucedida | Sim | Não |
| Retorno da função cardíaca estável | Sim | Não |
Tabela 1. Características dos sucedida Versus Procedimentos HAHLT sem êxito.
Tabela 1 </ Strong> fornece exemplos de fatores associados ao doador bem e mal sucedidas, concussão, e operações beneficiárias.
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Discussion
O sucesso com a técnica descrita aqui vai ser em função de diversos factores. O principal entre eles será assegurar a estabilidade de ambos os animais doadores e receptores, adotando a técnica operatória meticulosa que é seguro e associado com a perda de sangue mínima, garantindo parada cardioplégica completo com arrefecimento uniforme enxerto, minimizando o tempo de isquemia total, e de forma adequada de-arejar o enxerto. Como reconheceu acima, a complexidade técnica da técnica é a sua limitação chefe.
Temos avançado técnicas HAHLT anteriores em vários aspectos. As modificações descritas em operações de doadores e receptores proporcionam um meio de executar os passos operacionais necessários de uma forma controlada e eficiente. O protocolo de proteção miocárdica descrito é um meio ideal de minimizar prejuízo durante o período isquêmico. O resultado final é um enxerto HAHLT em que a geometria foi otimizada, o prejuízo foi minimizada, e função do enxerto intrínseca foi préservido na maior medida possível.
A técnica descrita acima produz um enxerto HAHLT com condições de carga ventricular dinâmicos e potencialmente quase fisiológicas. Uma vez que a técnica foi dominada, as licenças de configuração transplante completas na caracterização vivo da função do enxerto. Como se observa, as condições de pré-carga e pós-carga pode ser alterada de forma aguda ou crônica, e dos doadores de pulmão pode ser aguda re-ventilado. Os investigadores podem facilmente e amplamente aplicar este modelo para o estudo de várias condições médicas, embora mantendo a capacidade de estudar a estrutura e a função do enxerto.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Mark J. Kearns recebe o apoio do Programa UBC Clínico Investigator (concedidos a partir do Royal College of Physicians e Surgeons of Canada), ea UBC 4YF Doutorado Fellowship.
John H. Boyd é um Sanitorium Associação Nacional e Michael Smith Fundação para a Pesquisa de Saúde Escolar. Financiamento através CIHR. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. M. Allard e Richard Wamboldt por sua assistência com a instalação e manutenção de equipamentos de perfusão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Celsior Cardioplegic Soution | Genzyme | The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications. | |
| Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | Model 683 | |
| Vital Sign Monitor | Nonin | Model 9847V | Displays SpO2 and heart rate. |
| IV Cannulae | Jelco | 3063 | 24 - 26 G x 3/4" cannulae. |
| IV Tubing | CareFusion | MP9259-C | Short-length connector tubing (18 cm). |
| Surgical Clips | Teleflex Medical | 001204 | Horizon titanium ligating clips. |
| Sutures | Ethicon, Sharpoint | LA54G, AK-0107 | 3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle). |
| Surgical Instruments | Not Applicable | Not Applicable | The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company. |
References
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