Protocol
Alla djur inhystes och vårdas i enlighet med nationella och institutionella riktlinjer för vård och användning av försöksdjur. Etik godkännande för detta protokoll beviljades av University of British Columbia Animal Care kommittén. Sprague-Dawley-råttor som vägde mellan 300-450 g användes för detta protokoll.
1. Donator Drift
- Har ca 100 ml kardioplegi (RT) i en bägare ansluten till lång intravenös (IV) kateterrör med en 3-vägs kranen. Använd ett stativ för att lyfta kolven till ca 80cm ovanför den operativa ytan, vilket möjliggör kardioplegi leverans av tyngdkraften.
- Att visualisera strukturer adekvat, antingen använda ett par av kirurgiska luppar eller en dissekera mikroskop.
OBS: Vi använder för närvarande ett binokulärt operationsmikroskop med 3,4 - 21.3X förstoring. - Placera givaren i en anestesikammare och inducera anestesi med 4-5% isofluran. Överför råtta till en operativ plattform och underhålla anestesi genom noskonen med 1 - 2% isofluran. Applicera veterinär salva till djurets ögon att förhindra torrhet. Administrera midazolam (2 mg / kg) intraperitonealt med en 25 G-nål.
- Med hjälp av kirurgiska Clippers, raka givaren från xiphisternum till underkäken. Raka en liten region i vänster ljumske (för efterföljande IV-åtkomst). Applicera en depilating medel till de operativa ytorna, vänta ca 5 minuter, och ta bort hår med en bit gasbinda.
- Prep kirurgiska platserna med povidon-jod eller chlorexidine-baserad lösning (vi bara använda klorhexidin). Infiltrera incisional platser med 0,1-0,5% lidokain subkutant.
- Säkra frambenen och vänster bakben till arbetsplattformen med tejp, vilket lämnar höger bakbenen gratis för anestesidjupsmonitorering och vitala.
- Efter att säkerställa lämpligt anestesidjups av pedal nypa, gör ett snitt i den vänstra ljumsken veck använderen 22-blad skalpell. Genom trubbig dissektion, exponera den vänstra gemensamma lårbensvenen och få IV tillgång på följande sätt:
- Dra försiktigt vävnaden som ligger över lårbensvenen och kanylera venen med en 24 G IV. Anslut IV till en kort längd av saltlösning fylld IV slang och fäst slangen på plats med tejp.
OBS: Förfarandet för lårbens venös kanyle hos råttor beskrivs på annat håll genom Jespersen och kollegor 14. - Anslut en saltlösningsfylld 10 ml spruta till IV-slangar och försiktigt aspirera blod för att säkerställa korrekt positionering av IV.
- Injicera 300-500 IE ofraktionerat heparin genom IV slangar och spola därefter slangen med 3 - 5 ml koksaltlösning.
- Dra försiktigt vävnaden som ligger över lårbensvenen och kanylera venen med en 24 G IV. Anslut IV till en kort längd av saltlösning fylld IV slang och fäst slangen på plats med tejp.
- Därefter tracheotomize givaren enligt följande:
- Gör en mittlinjen snitt i de mjuka vävnaderna mellan hals hack och underkäken med hjälp av en 22-blad skalpell. Penetrera kapseln i sköldkörteln i mittlinjen med hjälp av Metzenbaum sax, och separata dess lober använder dissektion.
- Använda dissektion, separera band musklerna i nacken i mittlinjen för att exponera den främre ytan av luftstrupen.
- Använd en böjd pincett att rakt på sak dissekera en periferi plan runt luftstrupen. Omringa luftstrupen med en 4-0 sidenslips.
- Använda iris sax, göra en tvärgående snitt i främre luftstrupen, ungefär 5mm sämre än sköld brosk. Försiktigt införa trakealkanylen (14 G IV) och fäst den på plats med hjälp av 4-0 sidenslips.
- Anslut trakeal kanyl till en mekanisk ventilator. Omdirigera flödet av syre och isofluran genom ventilationskretsen och ventilera givaren med en hastighet och tidalvolym förutspåtts av sin vikt 13.
- Gör ett snitt i mittlinjen på bröstet (med hjälp av en 22-blad skalpell), som sträcker sig snittet i hals hack till under xipisternum.
- Vistas i mittlinjen, Utför en median sternotomi använder ett ben kniv. Dra in kanterna på bröstbenet med en självhållande sårhake. Ange hjärtsäck och pleurala håligheter.
- Utför en tymektomi. Det är lättast att först rakt på sak dela bräss i mittlinjen, och därefter separera det från omgivande strukturer med hjälp av en kombination av trubbig och skarp dissektion.
OBS: Ursprunget för de interna bröstkorg artärer kan skadas när dissekera tymus från de överlägsna sternala kanterna. För att förhindra blödning, kan hemostatiska klämmor appliceras innan du tar bort bräss på dessa punkter. - Använda Metzenbaum sax och / eller en skarp Lauer, dissekera peri-caval fett bort från den nedre hålvenen (IVC). Säkerställ att IVC är relativt fria från fett och bindväv från Cavo-atriell korsningen mycket fint, till membranet inferiorly.
- Använd en vass Lauer, perifer fri övre hålvenen (SVC) och omge det med en 4-0 sidenslips.
- Nästa, dissekeravänster hålvenen fri från omgivande strukturer, och ligera det proximalt och distalt med 4-0 sidenslipsar. Resekera den mellanliggande delen av cava att exponera vänster subclavia.
- Perifer gratis aortabågen fartyg som använder en skarp Lauer. Applicera proximala och distala kirurgiska klipp till Innominate artär, och dela det mellan klippen. Lämna vänstra gemensamma halspulsådern och vänstra subclavia artär un-klippta.
- Därefter kanylera SVC med en 24 G IV kateter. Säkra katetern med den tidigare placerade 4-0 sidenslips.
- Förbered dig för ett ändamålsenligt, men mild transplantat skörd.
- Med hjälp av vass sax, dela IVC bara överlägsen diafragma ytan. Dela SVC överlägsen sin kanyle webbplats, se till att närliggande luftvägsstrukturer inte skadas.
- Stäng av fläkten och koppla trakealkanylen. Transekt trakea proximalt.
- Ta tag i transected luftstrupen med pincett och ta bort hjärtatoch lungor eget block. Detta kommer att kräva försiktigt dra med skarp dissektion som hjärt-lungtransplantat tas bort. Separera trakea från den underliggande matstrupen. Undvika att skada den nedåtgående aorta, så att en lång del av det förblir intakt efter skörd.
2. Framställning av Hjärt-lung Graft
OBS: när du fyller i denna del av förfarandet, bör en assistent vara anesthetizing mottagaren gnagare och förbereder sig för transplantat implantation.
- Placera hjärt-lungtransplantat på kirurgisk gasväv med den främre ytan av hjärtat nedåt. Genom att använda skarp dissektion, ta bort eventuella matstrupen, undvika skador på bakre luftvägarna.
- Leta reda på fallande bröstaortan och infoga en 16 G trubbig spets kanyl. Säkra kanylen på plats med en 4-0 sidenslips.
- Leta aortabågen fartyg, och tillämpa en kirurgisk klämma till vänster subclavia. Lämna den vänstra halspulsådern un-klippta för subSequent avluftning.
- Administrera den första dosen av kardioplegi genom att ansluta kardioplegia slangen till 16 G aortakanylen. Den halspulsådern måste tillfälligt tilltäppt med pincett för att säkerställa tillräcklig leverans av kardioplegi.
OBS: En fördel att ha aorta kanylen fäst är att kardioplegi kan administreras kontinuerligt och / eller intermittent så önskas. För intermittent dosering, levererar vi normalt kardioplegi var 10 - 15 min i 5 ml bolus under 30 - 45 sek. - Använda Metzenbaum sax och / eller en skarp Lauer, dissekera peri-aorta fett bort från aorta. Säkerställ att aorta är relativt fri från fett och bindväv från vänster subclavia (distala bågen) till dess kanyle webbplats.
- Därefter exponera den vänstra huvudbronken med en skarp Lauer, och ligera det proximalt med en 4-0 sidenslips. Transekt vänster luftrör distalt om ligatur med hjälp av iris sax. Gör en vänster pneumonektomi genom ligering av vänstra lungartär och ven med 4-0 sidenslipsar. Transekt distalt om ligatur och avlägsna den vänstra lungan.
- Som ovan, ta bort alla andra lunglober med undantag av de rätta övre och mellersta lober. Undvik att skada IVC i färd med att utföra lobectomies.
- Anslut kardioplegia slangen till aortakanylen och administrera kontinuerlig kardioplegi medan mottagaren håller på att utarbetas. Placera hjärt-lungtransplantat i en steril behållare (t.ex. en bägare).
3. Mottagare Drift
- Söva mottagaren enligt donatoroperationen ovan. Använd veterinär salva för att skydda djurets ögon från torrhet. Bekräfta anestesi ofta av pedal nypa.
- Placera djuret enligt donatoroperationen, den här gången lämnar rätt forelimb fri att övervaka vitala funktioner och anestesidjups.
- Raka buken från xiphisternum till penisen. Raka en liten region i vänster ljumske (för efterföljande IV-åtkomst). Applicera endepilating medel till de operativa ytorna, vänta ca 5 minuter, och ta bort hår med en bit gasbinda.
- Prep kirurgiska platserna med povidon-jod eller chlorexidine-baserad lösning. Infiltrera incisional platser med 0,1-0,5% lidokain subkutant.
- Tracheotomize och ventilera mottagaren enligt ovan. Alternativt, hålla mottagaren i noskonen anestesi.
- Införa en kateter i den femorala venen, såsom beskrivits ovan. Injicera 300-500 IE ofraktionerat heparin genom IV slangar och spola därefter slangen med 3 - 5 ml koksaltlösning.
- Utför en laparotomi genom att göra en mittlinje buksnitt med en 22-blad skalpell från xiphisternum till penis. Dra bukväggen med hjälp av en självhållande upprullningsdon. Därefter dra tarmarna mycket fint och råttans vänstra sida. Slå dem i varmt, saltlösning indränkt gasbinda.
- Exponera IVC och bukaorta av kraftigt dissekera genom liggande retro-peritoneal fett.
- Ha en krökt kärl klämma tillgängliga och redo.
- Perifer befria IVC och aorta proximalt och distalt och omringa dem med 4-0 sidenslipsar. Det bör finnas en 2 - 3 cm utrymme mellan dessa platser.
- Applicera försiktigt den böjda fartyget klämman och se till att en tillräckligt stor del av både IVC och aorta exponeras ovanför klämmans käftar.
- Gör ett snitt i den främre väggen av IVC med en 25 G nål förbunden med en saltlösningsfylld 1 ml spruta. Förläng snittet med Potts sax för att matcha längden av givar IVC öppningen.
- Ta bort hjärt-lungtransplantat från dess behållare och koppla bort den från kardioplegi. Placera transplantatet i mottagarens buk i en optimal position för att utföra den venösa anastomos.
OBS: hjärt-lungtransplantat slutändan kommer att orienteras något snett, med spetsen pekande mot buken vänstra nedre kvadranten. - Säkra hälenoch tå ändar anastomosen med 9-0 nylon sutur. Knyt därefter en ordentlig knut i varje ände, lämnar nål fäst vid en lång arm sutur, och en kort slutet av sutur vara bunden till ett senare tillfälle. Administrera en dos av kardioplegi.
- I löpande mode, komplett hälften av suturlinjen och slips till motsatta kort sutur arm. Administrera en dos av kardioplegi.
- Slutföra den andra hälften av suturen linjen och knyta den nedåt. Den venös anastomos är klar. Administrera en dos av kardioplegi
- Orient hjärt-lungtransplantat med hjärtats spetsen pekar mot buken vänstra nedre kvadranten. Se till att det venösa anastomos inte krokig eller vriden.
- Bedöma längd givar aorta som kommer att krävas för att nå mottagaren aorta, underhålla både IVC och aorta anastomoser i spänningsfritt och un-snodda konfigurationer.
- Dela den nedåt aorta (distalt vänster subclavia) med en iris sax.
- Gör en incision i den främre väggen av mottagarens aorta med en 25 G nål förbunden med en saltlösningsfylld 1 ml spruta. Förläng snittet med Potts sax för att matcha längden av givaraortaöppningen.
- Förankra tå (överlägsna aspekt) av givaren aorta till mottagaren aorta med hjälp av en 9-0 nylonsutur. Därefter, passerar nålen till den mediala sidan av aorta och fylla hälften av anastomosen i körklart mode.
- Vid hälen av aorta anastomos, kasta om orienteringen av suturlinjen (en övergång i riktning mot sömmen), och fylla den laterala hälften av anastomos i körklart mode.
- Långsamt bort IV-kateter i SVC och ligera SVC med en kirurgisk klämma.
- De luft aorta genom att placera FN-klippta vänstra gemensamma halspulsådern. Håll artären öppen, i upprätt läge som gör att luft att fritt evakueras.
- Öppna korthet käftar den krökta kärlklämman och tillåta karotidartären att blöda (de-luft) 2 - 3 sek. Åter tillämpa fartyget klämma.
- Applicera en kirurgisk klämma till karotidartären. Ta bort den krökta fartyget klämma.
- Kontrollera blödning på sutur linjer. Om det finns, tillämpa ett lätt tryck med kirurgisk gasväv eller reparation med en längd av 9-0 nylon sutur (beroende på hur allvarlig blödning).
- Donatorhjärtat ska återupptas slå inom några minuter.
- Var uppmärksam på mottagarens vitala, anestesidjup och administrera volym återupplivning vid behov.
- Beroende på de experimentella ändpunkter, antingen stänga djurets buk och låt den återhämta sig från anestesi, eller förbereda djur för kardiovaskulär bedömning.
OBS: Exempel på bedömning av transplantat inkluderar in vivo åtgärder för lastberoende och lastoberoende hemodynamik, in vitro-mått på funktion i Langendorff och arbetshjärtlägen, och (i överlevnad kirurgi) ekokardiografiska eller MRI undersökningar. - Påslutet av akuta terminal experiment, djuren avlivas genom avblodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den HAHLT teknik som beskrivs ovan är mycket tekniskt och kräver stor omsorg om detaljer. Tabell 1 belyser några av de viktigaste faktorerna i samband med framgångsrika kontra misslyckade förfaranden, och kan användas som en guide för felsökning tekniska problem.
Efter mottagaren aorta är ospänt bör transplantat kransartärer ses att fylla med syresatt blod. Därför bör hjärtmuskeln blir rosa och väl perfusion. I tekniskt lyckade experiment, kommer hjärtat att börja slå strax efter transplantat reperfusion. Transplantatet bör lämnas i ett obelastat tillstånd (med mottagare IVC fastklämd) under en period av åtminstone 20 - 30 min för att medge funktionell återhämtning. Efter detta, kan den ympade s belastningsförhållanden ändras för att passa experimentella syften. Fler kvantitativa mått på transplantatfunktion (och ett lyckat resultat) kan användas om så önskas. Som påpekas i protokollet, in vivo in vitro funktionella studier, liksom ekokardiografisk och MRI undersökningar kan ge sådan information. Figur 1 och 2 är exempel på in vitro baslinjen och förspänning-ocklusionstrycket-volymdata som kan härledas akut med denna metod. Hemodynamiska data från dessa studier kan ge utredarna med hjärtminutvolym, slagvolym, kammarvolymer, hjärtfrekvens, ejektionsfraktion, slutsystoliska elastans och förspänning rekryter stroke arbete. Flera andra parametrar kan kvantifieras, såsom önskas.
Figur 1. baslinjetryck volymer data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 1 visar utgångsläget tryckerure volymer data från en in vitro arbetar hjärtat bedömning av hjärtfunktionen. EDV, slutdiastoliska volym; EDP, slutdiastoliska tryck; ESV, slutslagvolym; ESP, slut systoliska trycket.
Figur 2. Förspänning-ocklusionstrycket-volymdata. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 visar förspänning-ocklusion tryck-volymdata från ett in vitro arbets hjärtat bedömning av hjärtfunktionen. EDPVR, slutdiastoliska tryck-volymförhållande; ESPVR, slutsystoliska tryck-volymförhållandet.
| Framgångsrik Procedur | Misslyckad Procedur | |
| Donator | ||
| Donator Stabilitet | Stabil | Instabil |
| Förberedande Dissektion | Effektiv, Limited | Ineffektiva, Driven |
| Blodförlust | Kortaste | Överdriven |
| Dags att explant | Minimerad | Långvarig |
| Kardioplegisk Gripande | Snabb | Försenad |
| Transplantat | ||
| Total ischemisk tid | <90 min | > 90 min |
| Kardioplegisk Gripande | Underhålls Periodvis | Ofullständig |
| Mottagare | ||
| Other Stabilitet | Stabil | Instabil |
| Förberedande Dissektion | Effektiv | Ineffektiva |
| Clamp Gånger | <45 min | > 45 min |
| Anastomos Tid | <30 min | > 30 min |
| Blodförlust | Kortaste | Överdriven |
| Graft avluftning | Adekvat | Otillräcklig |
| Volym Resuscitation | Adekvat | Otillräcklig |
| Lyckad reperfusion | Ja | Nej |
| Retur av stabil hjärtfunktionen | Ja | Nej |
Tabell 1. Kännetecken för framgångsrik Versus Misslyckade HAHLT förfaranden.
Tabell 1 </ Strong> ger exempel på faktorer som är förknippade med framgångsrika och misslyckade givare, transplantat, och mottagande verksamheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framgång med den teknik som beskrivs här kommer att bygger på flera faktorer. Key bland dem kommer att vara att säkerställa stabiliteten i både givare och mottagare djur, anta noggrann operationsteknik som är säker och i samband med minimal blodförlust, vilket garanterar fullständig kardioplegisk stillestånd med enhetlig transplantat kylning, vilket minimerar total ischemisk tid, och tillräckligt avluftning transplantatet. Som erkänt ovan, är tekniken tekniska komplexitet dess chef begränsning.
Vi har avancerad tidigare HAHLT tekniker i flera avseenden. De ändringar som beskrivs i givar- och mottagarländerna verksamhet ger ett medel för att utföra nödvändiga operativa åtgärder på ett kontrollerat och effektivt sätt. Den hjärtinfarkt skydd protokoll som beskrivs är en perfekt sätt att minimera skadan under den ischemiska perioden. Slutresultatet är en HAHLT transplantat där geometri har optimerats, har skador minimerats, och inneboende transplantatfunktion har varit preeras i största möjliga utsträckning.
Den ovan beskrivna tekniken ger ett HAHLT transplantat med dynamiska och potentiellt nästan fysiologiska ventrikulär-belastningsförhållanden. När tekniken har bemästrat, transplantationen konfigurations tillåter komplett in vivo karakterisering av transplantatfunktion. Som nämnts, kan preload och afterload förhållanden ändras akut eller kroniskt, och donatorlung kan akut åter ventilerad. Utredarna kan lätt och i stort sett tillämpa denna modell för studier av många sjukdomstillstånd, samtidigt som man behåller möjligheten att studera transplantat struktur och funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Mark J. Kearns får stöd från UBC sjukvårds Investigator Program (tilldelas genom Royal College of Physicians och kirurger i Kanada), och UBC 4YF Doktor.
John H. Boyd är en nationell Sanitorium Association och Michael Smith Stiftelsen för hälsoforskning Scholar. Finansiering genom CIHR. Författarna vill tacka Dr M. Allard och Richard Wamboldt för deras hjälp med installation och underhåll av perfusion utrustning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Celsior Cardioplegic Soution | Genzyme | The solution is kept on ice throughout the procedure. We prepare our own solution, with slight modifications. | |
| Rodent Ventilator | Harvard Apparatus | Model 683 | |
| Vital Sign Monitor | Nonin | Model 9847V | Displays SpO2 and heart rate. |
| IV Cannulae | Jelco | 3063 | 24 - 26 G x 3/4" cannulae. |
| IV Tubing | CareFusion | MP9259-C | Short-length connector tubing (18 cm). |
| Surgical Clips | Teleflex Medical | 001204 | Horizon titanium ligating clips. |
| Sutures | Ethicon, Sharpoint | LA54G, AK-0107 | 3-0 silk reel, and 9-0 prolene suture (single-armed, DR5 needle). |
| Surgical Instruments | Not Applicable | Not Applicable | The instruments used are generic, and can be purchased from any surgical supply company. |
References
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S. A technique for heart transplantation in the rat. Arch Surg. 89 (1964), 649-652 (1964).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Exp Clin Transplant. 9 (2), 128-133 (2011).
- Wiedemann, D., Boesch, F., Schneeberger, S., Kocher, A., Laufer, G., Semsroth, S. Graft function after heterotopic rat heart transplant with an isolated reperfused working heart: a methodic consideration. Exp Clin Transplant. 10 (2), 154-157 (2012).
- Chen, Z. H., Xia, S. S. The technique of heterotopic heart-lung transplantation in the rat. J Tongji Med Univ. 6 (2), 67-70 (1986).
- Ibrahim, M., Navaratnarajah, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. J Surg Res. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Asfour, B., Hare, J. M., et al. A simple new model of physiologically working heterotopic rat heart transplantation provides hemodynamic performance equivalent to that of an orthotopic heart. J Heart Lung Transplant. 18 (10), 927-936 (1999).
- Figueiredo, J. -L., Nahrendorf, M., Sosnovik, D. E., Weissleder, R. MRI of a novel murine working heart transplant model. Circ Heart Fail. 2 (3), 272-274 (2009).
- Wen, P., Wang, X., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplant Proc. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Didié, M., Biermann, D., et al. Preservation of left ventricular function and morphology in volume-loaded versus volume-unloaded heterotopic heart transplants. A.Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (4), H533-H541 (2013).
- Galiñanes, M., Zhai, X., Hearse, D. J. The effect of load on atrophy, myosin isoform shifts and contractile function: studies in a novel rat heart transplant preparation. J Mol Cell Cardiol. 27 (1), 407-417 (1995).
- Yokoyama, H., Ohmi, M., Murata, S., Nakame, T., Tabayashi, K., Mohri, H. Proposal of a working left heart model with a heterotopic transplantation technique in rats. J Heart Lung Transplant. 14 (4), 706-712 (1995).
- Maruyama, T., Swartz, M. T., McBride, L. R., Pennington, D. G. Working heart model of heterotopic heart-lung transplantation in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 107 (1), 210-215 (1994).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J Vis Exp. (59), 3496-3410 (2012).
- Habertheuer, A., Kocher, A., et al. Innovative, simplified orthotopic lung transplantation in rats). J Surg Res. 185 (1), 419-425 (2013).
