マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、
Summary
ここでは、連続的に細胞 – 基質インピーダンスと生細胞イメージング分析により、非侵襲的に高い時間分解能での細胞接着及び脱接着プロセスを定量化するためのプロトコルを提示する。これらのアプローチは、マトリックス修飾および接着依存性のシグナル伝達事象に対する時間的関係によって誘発される細胞接着/脱接着プロセスのダイナミクスを明らかにした。
Abstract
細胞 – マトリックス接着細胞の形態を制御し、シグナル伝達において重要な役割を果たしている。細胞-マトリックス接着性（ 例えば 、ミエロペルオキシダーゼおよび他のマトリックス修飾酸化剤/炎症の間に放出される酵素）を崩壊させる刺激が多くの疾患において細胞機能、表現型と生存率の病理学的変化をトリガに関与している。ここでは、（病態生理学的マトリックス修飾刺激として内皮細胞およびミエロペルオキシダーゼを用いて）、細胞 – 基質インピーダンスと生細胞イメージングのアプローチを容易に正確に細胞接着およびマトリックス修飾により誘導される脱接着におけるリアルタイムの変化を定量化するために使用することができる方法について説明高い時間分解能でかつ非侵襲的な方法で。 xCELLigence細胞 – 基質インピーダンスシステムは、連続的に金微小電極アレイ上で増殖させた細胞における細胞 – 基板界面での電気インピーダンスを測定することにより細胞 – マトリックス接着面積を定量化する。タイムラプスdifferenの画像解析TiAlの干渉コントラストムービー細胞 – マトリックスの接触面積の変化を示す、経時的な個々の細胞の投影面積の変化を定量化する。両方の技術を正確に細胞接着と脱接着プロセスへの急速な変化を定量化する。微小バイオセンサアレイ上の細胞 – 基質インピーダンスは、堅牢、ハイスループット測定のためのプラットフォームを提供する。生細胞イメージングは、細胞 – 基質インピーダンス測定によって定量化の形態学的変化の性質および力学に関するさらなる詳細を提供する分析。これらの補完的なアプローチは細胞内、細胞外マトリックス成分のミエロ触媒による酸化修飾は、細胞接着の急激な変化をトリガし、形態および内皮細胞におけるシグナル伝達方法に貴重な新しい洞察を提供する。これらのアプローチはまた、他のマトリックス修飾刺激に応答し、関連接着細胞（ 例えば、上皮細胞）における細胞接着のダイナミクスを研究するために適用可能である。
Introduction
細胞とその周囲の細胞外マトリックスとの間の安定した接着剤の接点は、組織恒常性の維持のために必要とされる。例えば、血管の内皮下マトリックスの内皮細胞接着は、内皮層および規制、半透過性、血管障壁1としての恒常性維持機能の完全性を維持する上で重要な役割を果たしている。アクチン細胞骨格は、機械的に中央に指向アクトミオシンの引張力に抵抗することにより、細胞膜の位置を決定する際に重要な役割を果たす細胞 – マトリックス界面での細胞 – マトリックス接着と接着接触する部位におけるマトリックス分子を接着するように結合される。必ずしも細胞 – マトリックス界面における力のバランスを変化させる細胞 – マトリックス接着を改変細胞外刺激、急速にあるイベントは「アウトサイドインシグナル伝達」の形質導入をもたらし、機械刺激感受性シグナル伝達タンパク質によって「感知」。このクロストーク賭け予期する細胞とその周囲の細胞外マトリックスは、細胞の形状、運動性、機能、増殖及び生存2の制御において重要な役割を果たしている。
多様な病態生理学的プロセス（胚発生、炎症、創傷修復および癌転移）は、マトリックス分解酸化剤および/ または酵素3,4により接着剤マトリクス基板のダイナミックリモデリングによって特徴付けられる。例えば、血管の内皮下マトリックスタンパク質を接着剤（ 例えば 、フィブロネクチン）は、反応性酸化剤の局部的な生産にヒト炎症性疾患における修飾または分解のための主要な標的として示唆されている（ 例えば 、次亜塩素酸HOClの）白血球由来酵素による炎症性血管疾患（ 図1）5-9の間、内皮下層内に蓄積ミエロ（MPO）、。 MPO由来の酸化剤および他のマトリックス修飾刺激によって誘導される細胞 – マトリックス接着の変化は、リクある今度は内皮機能とバリアの完全性を乱し、内皮細胞のシグナル伝達、形態学および生存を変化させることによって、 例えば 、エリーは、病理学的プロセスの様々な時に血管の恒常性を変化させることにおいて重要な役割を果たしている。しかし、細胞外マトリックスの修正に接着した細胞の形態学的および細胞シグナル伝達応答は、理解され始めている。
マトリックスの修飾は、細胞接着のダイナミクスと接着依存性の細胞シグナル伝達経路の変化を駆動する方法を理解するために、この技術は、正確に、高い時間分解能で、リアルタイムで細胞 – マトリックス接着の変化を定量化することが必要である。ここでは、相補的な細胞 – 基質インピーダンスと、これらの基準を満たし、非侵襲的な方法で細胞接着及び脱接着過程を定量化するためのプラットフォームを提供し、生細胞イメージング技術を記述する。
私たちはどのようにこれらの細胞 – 基質インピーダンスとライブセルイメージングアプロ示し痛みは、容易には、（i）天然の及び変性マトリクス基板上に細胞接着および拡散（ すなわち 、 デノボ細胞接着）の動態をモニターし、（ii）細胞-マトリックス剥離のダイナミクスを測定するために（ すなわち 、脱接着に用いることができる）マトリックス修飾刺激にさらさ接着細胞による。 xCELLigence細胞 – 基質インピーダンスバイオセンサシステムは、96ウェルの金微小電極アレイの表面における電気インピーダンスを定量することにより細胞 – マトリックス接触の面積の連続的な測定を提供し、「セルインデックス '、無次元の値としてこれらの電気インピーダンスの測定値を表すまた（絶縁）細胞膜と電極表面11との間の平均距離の変化に敏感である一方、細胞-基板コンタクト10（ 図2）の面積に大きく比例する。細胞指数値のさらなる増加はまた、タイト、細胞 – 細胞接触の股関節形成時に達成される。tが、本研究に記載された実験の中勝訴しない11の条件を傍細胞電流が流れを制限する。経時微分干渉コントラスト（DIC）映画の画像解析による経時的な個々の細胞の投影面積の測定は、細胞 – 基質の接触面積の変化の相補的な尺度を提供するとの正確な性質および力学に関する追加情報を提供する細胞 – 基質インピーダンス法によって定量化し、形態学的変化。
具体的には、接着剤、内皮下のマトリックスタンパク質のMPO媒介酸化（ 例えば 、フィブロネクチン）（i）は、精製フィブロネクチンに懸濁した内皮細胞のデノボ癒着を減少させ、（ii）細胞-マトリックスドをトリガする方法を監視するため、これらのアプローチの適用を説明するフィブロネクチン上で確立された接着性を有する内皮細胞における-adhesion。関連BIOCHEMを用いて経時的に分析シグナル並列セルを行うことによりiCalのアッセイ（ 例えば 、ウエスタンブロット法）、接着依存性細胞シグナル伝達事象における接着/脱接着プロセスと関連した変化の間の時間的かつ因果関係を決定することができる。
これらのアプローチは、最近MPOの内皮下の堆積物によって触媒される細胞外マトリックスの酸化は、既存のアクトミオシン収縮力9によって駆動される内皮細胞の細胞-マトリックス接着の急速な減少を誘発することを実証するために使用した。重要なことは、両方の細胞接着の変化と決定されるシグナリング接着依存性細胞との間の時間的関係を可能にすることによって、これらのアプローチは、MPO誘発性マトリックス修飾および細胞の脱接着はSrcキナーゼなどの重要な接着依存性の細胞シグナル伝達経路の変化をトリガすることを同定し依存性パキシリンのリン酸化およびミオシン軽鎖IIリン（ 図1）9。レドックス依存性シグナル、INVのこのモード細胞-マトリックス接着を破壊する細胞外の酸化反応によって、細胞内シグナル伝達事象の活性化をolving、（ 図1）9 "外で酸化還元シグナル伝達」と呼ばれる細胞シグナル伝達の新規のモードを示す。
一般に、これらの補完的な細胞 – 基質インピーダンスバイオセンサーと生細胞イメージングのアプローチは、マトリックス修飾刺激または薬剤は、多種多様な対象の異なる付着細胞型内の細胞接着のダイナミクスの変化、形態学およびシグナル伝達を駆動する方法の異なる明らかに価値があるはず実験的な設定を行います。
以下のプロトコルは、デノボ内皮細胞接着（ 実験1）および内皮細胞脱接着（ 実験2）プロセス上のMPO媒介マトリックス酸化の影響を定量化する方法について説明します。 MPOは、フィブロネクチンおよび他の接着内皮下の細胞外マトリックスタンパク質に貪欲に結合し、私達塩化物イオン（のCl – ）を変換するエス過酸化水素（H 2 O 2）、これらのマトリックスタンパク質を局所的に反応し、その細胞接着性（ 図1）8,9 を破壊する反応性の高い塩素化酸化剤、次亜塩素酸（HOClの） に12。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞 – マトリックス接着及び脱接着プロセスは、細胞 – 基質インピーダンスと生細胞イメージング解析を用いて高時間分解能でリアルタイムで正確に定量することができる。これらのリアルタイムのアプローチは悪い時間分解能を提供し、細胞接着のエンドポイント分析を、上の大きな利点を提供する。正確に高い時間分解能で迅速な脱接着応答を定量化することによって、これらの分析は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
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