Summary
Her presenterer vi en protokoll for kontinuerlig å kvantifisere celle adhesjon og adhesjons-de prosesser med høy tidsmessig oppløsning i en ikke-invasiv måte ved celle-substrat impedans og levende celle bildeanalyser. Disse tilnærmingene avsløre dynamikken i celle adhesjon / de-vedheft prosesser som utløses av matrise modifikasjon og deres tidsmessige forhold til vedheft avhengig signale hendelser.
Abstract
Celle-matrise heft spiller en sentral rolle i å kontrollere cellemorfologi og signalering. Stimuli som forstyrrer celle-matrise-adhesjon (f.eks, myeloperoksidase og andre matriks-modifiserende oksidanter / enzymer som frigjøres under inflammasjon) er involvert i å utløse patologiske forandringer i cellulær funksjon, fenotype og levedyktighet i en rekke sykdommer. Her beskriver vi hvordan celle-substrat impedans og levende celle avbildningsfremgangsmåter lett kan anvendes for nøyaktig å kvantifisere sanntids endringer i celle adhesjon og de-adhesjon indusert av matrise modifikasjon (ved bruk av endoteliale celler og myeloperoksidase som en patofysiologisk matriks-modifiserende stimulus) med høy tidsoppløsning, og i en ikke-invasiv måte. Den xCELLigence celle-substrat impedans system kvantifiserer kontinuerlig område av celle-matriksinteraksjonsprosesser, adhesjon ved å måle den elektriske impedans ved celle-substrat-grensesnitt i celler dyrket på gull microelectrode matriser. Bildeanalyse av time-lapse differential kontrast interferens filmer kvantifiserer endringer i det projiserte område av individuelle celler over tid, som representerer endringer i det området av celle-matriks kontakt. Begge teknikkene nøyaktig kvantifisere raske endringer i mobilnettet vedheft og de-vedheft prosesser. Cell-substrat impedans på microelectrode biosensor arrays gir en plattform for robust, high-throughput målinger. Live-cell imaging analyser gi flere detaljer om natur og dynamikk av de morfologiske endringene kvantifisert ved celle-substrat impedansmålinger. Disse komplementære tilnærminger gi verdifull ny innsikt i hvordan myeloperoxydase-katalysert oksidativ modifikasjon av subcellulære ekstracellulære matrikskomponenter utløser raske endringer i celle adhesjon, morfologi og signalering i endotelceller. Disse metodene er også aktuelt for å studere cellulære vedheft dynamikk i respons til andre matrisemodifiser stimuli og i beslektede adherente celler (f.eks, epiteliale celler).
Introduction
Stabile klebende kontakt mellom cellene og deres omgivende ekstracellulær matriks er nødvendig for opprettholdelse av homøostase vev. For eksempel, endotelial celleadhesjon til subendotel matriks i blodkar spiller en kritisk rolle i å opprettholde integriteten av endotelial laget og homeostatisk funksjon som et regulatorisk, semi-permeabel barriere vaskulær 1. Aktin cytoskjelettet er mekanisk koblet til den selvklebende matriks molekyler på områder av celle-matrise-adhesjon og klebekontakter på celle-matriks-grensesnitt spille en viktig rolle i å bestemme posisjonen av cellemembranen ved å motstå sentralt rettede actomyosin strekkrefter. Ekstracellulære stimuli som endrer celle-matrise-adhesjon nødvendigvis å endre balansen av krefter på celle-matriksinteraksjonsprosesser grensesnitt, en hendelse som er hurtig 'avfølt' ved mekanisk-sensitivt signaleringsproteiner, hvilket resulterer i transduksjon av "utenfor-i signale". Dette krysstale betlom celler og deres omliggende ekstracellulære matrise spiller en nøkkelrolle i å kontrollere celleform, bevegelighet, funksjon, spredning og overlevelse 2.
Forskjellige patofysiologiske prosesser (embryoutvikling, inflammasjon, sårhelbredelse og kreft metastase) er kjennetegnet ved dynamisk remodellering av klebemiddel matrikssubstrater av matrisenedbrytende oksidanter og / eller enzymer 3,4. For eksempel lim subendotelmatriksen proteiner i blodkarene (f.eks fibronektin) er implisert som viktige mål for modifisering eller nedbrytning i humane inflammatoriske sykdommer på grunn av den lokaliserte produksjon av reaktive oksidanter (f.eks, hypoklorsyre, HOCl) av leukocytt-avledede enzym myeloperoksidase (MPO), som akkumuleres i løpet av subendotel inflammatorisk vaskulær sykdom (figur 1) 5-9. Endringer i celle-matrix adhesjon indusert av MPO-avledet oksidanter og andre matrisemodifiserende stimuli er likEly å spille viktige roller i å endre vaskulær homeostase i en rekke patologiske prosesser, for eksempel, ved å forandre endotelial cellesignalisering, morfologi og levedyktighet, som i sin tur perturbs endotelial funksjon og barriereintegritet. Imidlertid er de morfologiske og cellesignale svarene av heftende celler til ekstracellulære matrise modifikasjoner bare begynner å bli forstått.
For å forstå hvordan matrise modifikasjoner drive endringer i celle adhesjon dynamikk og adhesjons-avhengige cellesignalveier, er teknikker som kreves som nøyaktig kvantifisering av endringer i celle-matrise-adhesjon i sanntid med høy tidsoppløsning. Her beskriver vi komplementær celle-substrat impedans og levende celle avbildningsteknikker som oppfyller disse kriteriene og gir en plattform for å kvantifisere celleadhesjon og de-adhesjons prosesser i en ikke-invasiv måte.
Vi viser hvordan disse celle-substrat impedans og levende celle bildebehandling hensiktssmerter kan lett anvendes for å (i) å overvåke dynamikken i celleadhesjon og spredning (dvs. de novo celleadhesjon) på native og det modifiserte matrikssubstrater, og (ii) for å måle dynamikken i celle-matriks løsgjøring (dvs. de-adhesjon ) av adherente celler eksponert for matriks-modifiserende stimuli. Den xCELLigence celle-substrat impedans biosensor system gir en kontinuerlig måling av det området av celle-matriksinteraksjonsprosesser kontakt ved å kvantifisere elektrisk impedans ved overflaten av 96-brønners gull microelectrode matriser og uttrykker disse elektriske impedansmålinger som "celleindeks", en dimensjonsløs verdi som er stort sett proporsjonal med arealet av celle-substrat kontakt 10 (figur 2), mens det også er følsomme for endringer i den gjennomsnittlige avstand mellom (isolerende) cellemembranen og elektrodeoverflaten 11. En ytterligere økning i celleindeksverdier er også oppnådd ved dannelse av tett celle-celle-kontakter that begrense paracellulære strøm flyter, 11 betingelser som ikke gjør seg gjeldende i de eksperimenter som er beskrevet i denne studien. Måling av anslått areal av individuelle celler over tid ved bildeanalyse av time-lapse differensial interferens kontrast (DIC) filmer gir en utfyllende mål på endringer i området av celle-substrat kontakt og gir mer informasjon om den nøyaktige natur og dynamikk av morfologiske endringer kvantifisert ved celle-substrat impedans tilnærming.
Nærmere bestemt beskrives anvendelsen av disse fremgangsmåter for å overvåke hvordan MPO-formidlet oksydasjon av klebe subendotel matriksproteiner (f.eks fibronektin) (i) reduserer de novo adhesjon av suspenderte endotelceller mot renset fibronectin og (ii) utløser celle-matriks de -adhesion i endotelceller med etablert vedheft på fibronektin. Ved å utføre parallell celle signale analyser over tid ved hjelp av relevant Biochemical analyser (for eksempel Western blotting), tidsmessige og årsakssammenhenger mellom adhesjon / de-vedheft prosesser og tilhørende endringer i vedheft avhengige cellesignale hendelser kan bestemmes.
Disse fremgangsmåter ble nylig anvendt for å demonstrere at ekstracellulære matriks oksidasjon katalysert av subendotel forekomster av MPO utløser et hurtig tap i celle-matrise-adhesjon av endotelceller som er drevet av pre-eksisterende actomyosin kontraktile krefter 9. Viktigere, ved at den tidsmessige forholdet mellom endringer i både celleadhesjonen og heft-avhengige celle signale å være bestemt, identifisert disse tilnærmingene som MPO-indusert matrise modifisering og cellulær de-adhesjon utløser endringer i viktige vedheft avhengige cellesignalveier inkludert Src kinase -avhengig paxillin fosforylering og myosinlettkjedefosfatase II fosforylering (figur 1) 9. Denne modusen av Redox-avhengige signalering, invOlving aktivering av intracellulære signalhendelser ved ekstracellulære oksidative reaksjoner som forstyrrer celle-matrise-adhesjon, representerer en ny modus av cellesignale betegnet "utenfor-i redoks-signalering" (figur 1) 9.
Generelt bør disse utfyllende celle-substrat impedans biosensor og levende celle avbildningsfremgangsmåter være verdifulle i å avsløre hvordan ulike matrise-modifiserende stimuli eller agenter drive endringer i celle adhesjon dynamikk, morfologi og signalering innenfor forskjellige adherente celletyper som er utsatt for en rekke eksperimentelle innstillinger.
Følgende protokoll beskriver hvordan å kvantifisere effekten av MPO-mediert matrise oksidasjon på de novo endotelceller adhesjon (Forsøk 1) og endotelceller de-adhesjon (Eksperiment 2) prosesser. MPO bindes kraftig til fibronektin og andre klebe subendotel ekstracellulære matrix proteiner og osses hydrogenperoksid (H 2 O 2) for å omdanne klorioner (Cl -) til det sterkt reaktive klorerings oksydasjonsmiddel underklorsyrling (HOCl), som reagerer lokalt med disse matriksproteiner og forstyrrer deres celle adhesive egenskaper (figur 1) 8,9, 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generelt Endothelial Cell Culture
- Kultur bovine aorta-endotelceller (passasjer 4-9) på gelatin-belagte vevskulturflasker (vevskultur belegge overflaten med 0,1% w / v gelatin i PBS ved romtemperatur i 15 min) i EGM-2 medium (med EGM-2 kule kit inneholdende 5% føtalt bovint serum, vekstfaktorer og alle bilag som leveres av produsenten, bortsett fra hydrokortison).
- Når cellene er nær sammenflytende (ca. 3 dager etter såing etter en 1: 4-splitt), høste celler ved behandling med 0,05% w / v trypsin / 0,02% vekt / volum EDTA i PBS ved 37 ° C. Etter de fleste celler har frittliggende, legger komplette EGM-to medier for å slukke trypsin og deretter sentrifuge (100 xg, 5 min).
- Forbered celler for studier på de novo adhesjonen av endotelceller til fibronektin (Eksperiment 1: Seksjon 2) og den etterfølgende de-adhesjonen av endotelceller til etablert adhesjon på dette substratet (Forsøk 2: § 3).
- Vask høstetcellene en gang med serumfritt medium 199 inneholdende 1% w / v bovint serumalbumin (BSA) og re-sentrifuge (100 x g, 5 min).
- Re-suspendere cellene i serumfritt medium 199 inneholdende 1% w / v BSA ved 2,5 x 10 5 celler / ml (celle-substrat impedansmålinger) eller 5 x 10 5 celler / ml (levende celle avbildningsanalyser) og opprettholder ved 37 ° C før bruk.
MERK: adhesjonen responser av cellene er meget følsomme for temperaturforskjeller (f.eks, på grunn av konveksjons-effekter) slik at alt utstyr og løsninger for å håndtere og behandle celler i løpet av de følgende protokoller bør holdes ved en konstant temperatur på 37 ° C.
2. Forsøk 1: Kvantifisering De Novo endotelcelle Vedheft på Native og MPO-oksidert Fibronektin (Cell-substrat Impedans)
MERK: Forsøk 1 undersøker graden som MPO-formidlet oksydasjon av fibronektin svekker dets evne til å støtte de novo
- Coat fibronektin til 96-brønners celle gull-substrat impedans microelectrode matriser. Legg 80 ul / brønn av renset bovin fibronektin på 5 ug / ml i PBS, inkuberes i 2 timer ved 37 ° C og fjerne oppløsningen.
- Inkuber fibronektin-belagte overflater med MPO for å tillate binding av MPO til overflaten bundet fibronektin. Legg 80 ul / brønn av renset human neutrofil MPO ved 20 nM i Hanks balanserte saltløsning (HBSS) og inkuberes i 0,5 timer ved 37 ° C.
- Vask to ganger med HBSS overflater for å fjerne eventuelt ubundet MPO.
- Legg H 2 O 2 (0-10 pM sluttkonsentrasjon) til brønner i mikroelektroden matrise plate inneholdende 80 ul / brønn HBSS for å initiere MPO-katalyserte, HOCl-avhengig oksidasjon fibronektin og inkuberes i ytterligere 0,5 timer ved 37 ° C.
- Å undersøke effekten av relevante hemmere eller modulatorer av MPO-katalyserte reaksjoner (f.eks alternativ MPO enzymsubstrater, hemmere eller antioksidanter; se 9 for detaljer), legge disse til HBSS umiddelbart før H 2 O 2 tillegg.
- Etter 0,5 timer, behandle overflater med metionin å slukke restoverflate bundet oksiderende arter, dvs. reaktivt protein-bundet kloraminer, som kan utøve konfunderende cellulære aktiviteter. Tilsett 10 mM metionin i 80 ul HBSS per brønn og inkuber i 10 min ved 37 ° C.
- Block flater med BSA. Legg 80 ul / brønn av BSA i 0,2% vekt / volum i PBS, inkuberes i 2 timer ved 37 ° C og fjerne oppløsningen.
MERK: Residual-belagte overflateområder vil støtte celleadhesjon og blokkerer disse med et ikke-klebende protein (dvs. BSA) sikrer at cellulære responser vedheft strengt er avhengig av den rensede celleheftende matrise som anvendes, i dette tilfelle fibronektin. - Vask flater to ganger med HBSS.
MERK: Ingen av de foregående overflatebehandlinger bart påvirker celle-substrat readings. - Frø suspendert endotelceller (legg 200 mL / brønn ved ca 2,5 x 10 5 celler / ml, utarbeidet i serumfritt medium 199 inneholder 1% BSA, se 1.3) på de innfødte eller MPO-oksidert fibronektin belagt overflater.
- Umiddelbart etter utsåing celler (dvs. før noen celleadhesjon og spredning), montere microelectrode matrise platen på inkubatoren port (som ligger i en 37 ° C inkubator i nærvær av 5% CO2).
- Ved hjelp av instrumentet programvaren umiddelbart ta en "blank" lese for å normalisere påfølgende celle-substrat impedans ('celleindeks ") verdier til de opprinnelige bakgrunnsverdier som oppnås i fravær av celle-adhesjon.
- Initiere kjøp av kontinuerlige celleindeksdata (minimum av én celle indeksen lesing / min).
- Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i 2 timer, en periode i løpet av hvilken maksimal cellebinding og spredning er oppnådd; dette gjenspeiles aven plateauing av celleindeksverdier (se figur 3A).
NB: Det foregående eksperiment (Eksperiment 1) undersøker hvordan innledende MPO-formidlet oksydasjon av fibronektin begrenser muligheten av endoteliale celler til å etablere celleadhesjon på dette substratet. Det følgende eksperimentet (Forsøk 2) undersøker hvordan MPO-mediert fibronektin oksydasjon fremmer reduksjon i celle-matrise-adhesjon (dvs. de-adhesjon) i endotelceller med etablerte adhesjon på dette substratet. Behandlingene i disse to forsøk er i det vesentlige identiske, bortsett fra tidspunktet for MPO-mediert fibronektin oksidasjon (dvs. før celleadhesjon - Forsøk 1; etter celleadhesjon - Forsøk 2).
3. Forsøk 2: Kvantifisering endotelcelle De-heft fra Fibronectin i Response til MPO-mediert Fibronectin Oksidasjon (Cell-substrat Impedans og Live Cell Imaging)
- Frakk fibronektin på 96-brønn gull microelectrode enrrays for celle-substrat impedansmålinger (legge til 80 mL / brønn fibronektin på 5 mikrogram / ml i PBS og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C) eller 35 mm glassbunn cellekultur retter for levende celle bildeanalyser (tilsett 2 ml / skål av fibronektin ved 5 ug / ml i PBS og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C).
- Block flater med BSA. Legg BSA 0.2% vekt / volum i PBS ved volumene indikert i 3.1 og inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
- Inkuber flater med MPO for å tillate binding av MPO til fibronektin. Tilsett 20 nM renset humant MPO i HBSS ved volumene indikert i 3,1 og inkuberes i 0,5 timer ved 37 ° C.
- Vask to ganger med HBSS overflater for å fjerne eventuelt ubundet MPO.
- Seed suspenderte endotelceller (fremstilt i serumfritt medium 199 inneholdende 1% w / v BSA, se 1.3) på de native eller MPO-bærende fibronektin-belagte overflater.
- Tilsett 200 ul / brønn med 2,5 x 10 5 celler / ml i 96-brønners celle-substrat impedans microelectrode matriser. <li> Legg til 2 ml / oppvask på 5 x 10 5 celler / ml til 35 mm glassbunn cellekultur retter.
- Mount 96 brønners microelectrode matriseplater over på celle-substrat impedans inkubator port (som ligger i en 37 ° C inkubator i nærvær av 5% CO2) og ta "blanke" avlesninger for å initiere kontinuerlig anskaffelse av celleindeksdata (§ 2.10 ).
- Overføring 35 mm glassbunn cellekulturskåler i en 37 ° C inkubator i nærvær av 5% CO2.
MERK: HBSS er ansatt når studere MPO-katalysert oksidative reaksjoner i stedet for komplette kulturmedier som sistnevnte inneholder oxyderbare arter som forstyrrer de oksideringsreaksjoner.
MERK: Etter 0,5 timer likevekt i HBSS, celleindeksverdier stabilisere seg på litt lavere verdier; når preinkubere celler med enzymsubstrater, enzym og cellesignale hemmere eller antioksidanter, først sørge for at these ikke vesentlig påvirke verdiene oppnådd etter likevekt.
- For celle impedans studier med 96 vel microelectrode array-plater:
- Ta av microelectrode rekke plate fra inkubatoren og pause celle indeksmålinger.
- Legg H 2 O 2 (sluttkonsentrasjon på 0-10 pM) til HBSS og forsiktig blandes ved gjentatt pipettering.
- Umiddelbart, re-montere microelectrode rekke tilbake på 37 ° C inkubator port og re-starte oppkjøpet av cellen indeksavlesninger.
- For live cell imaging studier som bruker 35 mm glassbunn cellekultur parabolen:
- Fjern dyrkningsskålen fra inkubatoren og montere på en 37 ° C oppvarmet stadium av en invertert konfokal mikroskop utstyrt med en 63X vann objektiv med egnede DIC optikk for opptak levende celle filmer.
- Fokus på celler ogoptimalisere DIC optikk (Köhler belysning, skjevhet retardasjon og kamera offset / gain, for detaljer, se 13).
- Initiere DIC film og spille baseline målinger av ubehandlede celler i 1 min.
- Legg H 2 O 2 (sluttkonsentrasjon på 0-10 uM), og bland forsiktig ved gjentatt pipettering. Fokuser mikroskop (om nødvendig) og fortsette innspillingen DIC filmer av de behandlede cellene for ønsket tidsperiode.
4. Data Analysis og Presentasjon
- Cell-substrat impedans data
- Eksportere rådata (celle indeks versus tid) i et regneark.
- For de celle-adhesjons-studier (Eksperiment 2: Del 3), normalisere data ved å sette verdiene som er registrert umiddelbart før initieringen av MPO-mediert fibronektin oksydasjon ved en verdi på fra 1 (dvs. umiddelbart før tilsetningen av H 2 O 2 i 3.11 .1.1).
MERK: Dette sikrer at relativforandringer i celleindeksverdier fremkalt av MPO-mediert fibronektin oksidasjon er ikke maskert av små initielle forskjeller i absolutte celleindeksverdier mellom brønnene.- Presentere data som plott av normaliserte celle indeks (y-aksen) som funksjon av tid (x-aksen).
- Levende celle bildedata (celle de-vedheft studier i Eksperiment 2: § 3)
- Åpne DIC leve celle bildebehandling filmer som er spilt umiddelbart før og etter oppstart av MPO-mediert fibronektin oksidasjon i en standard bildeanalyseprogram (f.eks ImageJ programvare).
- I det minste to separate filmer DIC tilfeldig velge flere celler og måle deres projiserte areal i sekvensielle rammer (for eksempel ved 1 minutts intervaller) ved manuelt å spore deres membrankanten og kvantifisere antallet av lukkede piksler.
- Eksportere rådata (projisert celle området versus tid) til et Excel-regneark og normalisere celle området data ved å sette verdier registreres umiddelbart førinitiering av MPO-mediert fibronektin oksydasjon ved en verdi på fra 1 (dvs. umiddelbart før tilsetningen av H 2 O 2 i 3.11.2.3).
- Presentere data som et plott av normalisert celleområdet (y-aksen) som funksjon av tid (x-aksen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sanntids kvantifisering av endotelceller de-adhesjon fra fibronektin i respons til MPO-mediert fibronektin oksidasjon (Forsøk 2). Den seeding av endoteliale cellesuspensjoner på mors (MPO gratis) fibronektin eller MPO bærende fibronektin resulterer i maksimal celle vedlegget og sprer i løpet av 2 timer, som bedømt ved en plateauing av celleindeksverdier i cellen substrat impedansmålinger (figur 3A). Denne innledende fasen av cellebinding og spredning reduseres markert når MPO-mediert fibronektin oksydasjon blir initiert før celle såing i eksperimenter utført i henhold til protokollen som er beskrevet i eksperiment 1 (data ikke vist, For detaljer se 9). Når maksimal celleadhesjon er etablert på nativt eller MPO bærende fibronektin, fibronektin målrettet oksydasjon mediert av MPO-katalyserte HOCl (initiert ved tilsetning av MPO co-substrat H 2 O 2) fører til en rask reduksjon i suransiktet området av celle-matrise kontakt målt ved celle-substrat impedans (figur 3A, B) og av levende celle imaging (Figur 3C, for en representant DIC film, se film 1; celle indeks eller celleområde tap etter H 2 O 2 tillegg er minimal i fravær av MPO 9). Mens celle indeks og celleområdet endres under MPO-indusert de-adhesjon var svært like, de relativt tregere nedgang i celle indeksverdier kan gjenspeile de isolerende effekten av cellemembranmaterialer stede i 'celle-free' regioner i cellen periferien under de- vedheft, som ikke er kvantifisert i de projiserte målinger celle området. Den hurtige mobil de-adhesjon tydelig i endotelceller bundet til MPO bærende fibronektin i respons til H 2 O 2 behandling er fraværende i celler behandlet med H 2 O 2 alene (dvs. celler som ikke inneholder MPO) (Figur 3A) og blokkeres by MPO-hemmere eller HOCl-fjernere (data ikke vist, se 9 for detaljer), identifisering av at denne prosessen er avhengig av den MPO-katalyserte fremstilling av HOCl (se figur 1). Hemming av myosin II motorisk funksjon med Blebbistatin hemmer frekvensen av endotelceller de-adhesjon målt ved celle-substrat impedans (Figur 3B) og av levende celle imaging (Figur 3C, Movie 2), identifisere at mobilnettet de-heft og sammentrekning i respons til MPO-katalyserte oxydasjon subcellulære matrise er drevet av actomyosin strekkrefter 9.
Figur 1. MPO-mediert subcellulære matrise oksidasjon utløser celle-matrix de-heft og cellesignalisering. MPO utløser raske de-vedheft svar og endringer i vedheft avhengig signalering ved å formidle målrettet oxidation av klebende subendotelmatriksen proteiner, som omfatter de følgende hendelser 9: (A) MPO bindes kraftig til subendotel matriks og bruker H 2 O 2 til å generere svært reaktive oksydasjonsmiddel HOCl som reagerer lokalt med matriksproteiner (f.eks, fibronektin) og forstyrrer deres celle klebende egenskaper. (B) Denne skaden forstyrrer klebekontakter på celle-matriks-grensesnitt, noe som fører til (C) membran tilbaketrekking drevet av uhindret strekk i aktin cytoskjelettet og endring av adhesjons-avhengige cellesignalveier (gjengitt med tillatelse fra Rees et al. 9 ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figure 2. Arbeid-flow og prinsippet om celle-substrat impedans analyser for å kvantifisere endotelceller de-adhesjon fra fibronektin i respons til MPO-mediert fibronektin oksidasjon (Forsøk 2). Cell indeksverdier målt ved celle-substrat microarray impedans biosensor system reflektere evne til cellemembranen å begrense felt-indusert ion strømmer på elektrodeoverflaten og er proporsjonal med arealet av celle-substrat kontakt 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sanntids kvantifisering av endotelial celle de-adhesjon av fibronektin i respons til MPO-mediert fibronektin oksidasjon (Forsøk 2). Endotelial cellesuspensjoner (i serumfritt medium 199 inneholdende 1%BSA) ble sådd ut på nativt eller MPO bærende fibronektin (fibronektin belagt med 5 g / ml, og deretter inkubert i fravær eller nærvær av 20 nM MPO) i 96-brønners mikroelektrode arrays (celle-substrat impedansmålinger) eller 35 mm glassbunn cellekultur retter (levende celle bildebehandling analyser). Celler ble deretter inkubert ved 37 ° C i 2 timer for å tillate maksimal cellebinding og spredning før ekvilibrering celler med HBSS og initiere MPO-mediert fibronektin oksydasjon ved tilsetning av H 2 O 2 (10 pM) (tid i H 2 O 2 tillegg satt til t = 0 min). (A) Full tidsforløpet av celle-substrat impedansmålinger før og etter behandling med H 2 O 2 i nærvær (+ MPO) og fravær (-MPO) av MPO. (B) Cell-substrat impedansmålinger og (C) celleområdemålinger av levende celle avbildningsanalyse, etter behandling av MPO-inneholdende celler med H 2 O 2 i nærvær (Blebbistatin +) og fravær (-blebbistatin) av myosin II-inhibitor Blebbistatin (40 pM). Cell indeks og celleområdeverdier er normalisert til verdier umiddelbart før tidspunktet for H 2 O 2-addisjon, som ble gitt en verdi på 1. Celle indeksere data representerer gjennomsnitt SEM, n = 6 duplikate målinger fra et representativt eksperiment. Celle arealverdier representerer gjennomsnittet SEM, n = 10 celler (2 replikere filmer, fem tilfeldig utvalgte celler per film: se filmer 1 og 2). (Figur 3B Figur 3C, Movie 1 og Movie 2 er gjengitt med tillatelse fra Rees et al. 9). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1 . Tid forfalle DIC microkopi film av endotelceller festet på MPO bærende fibronektin i løpet av 0-15 minutter etter eksponering for H 2 O 2 (10 uM); 1 sek = 3 min.
Film 2 . Tidsforkortelsen DIC mikros film av endotelceller festet på MPO bærende fibronektin i løpet av 0-15 minutter etter eksponering for H 2 O 2 (10 uM) i nærvær av Blebbistatin (40 uM); 1 sek = 3 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celle-matrise heft og de-vedheft prosesser kan kvantifiseres presist i sanntid med høy tidsoppløsning ved hjelp av celle-substrat impedans og levende celle bildebehandling analyser. Disse sanntids tilnærminger gir en stor fordel i forhold til endepunktet analyser av celleadhesjon, noe som gir dårlig tidsmessig oppløsning. Ved nøyaktig kvantifisere raske de-vedheft svar med høy tidsoppløsning, kan disse analysene gi kritisk innsikt i hvordan morfologisk respons til matrise modifikasjoner er regulert og hvordan de påvirker vedheft avhengige cellesignale prosesser, målt i parallelle ved hjelp av relevante biokjemiske analyser (f.eks Western blotting).
I nyere studier, ble disse metodene brukes til å avsløre en ny rolle for MPO-formidlet oksydasjon av subendotel-matriksen i å utløse de-adhesjonen av endotelceller og viste: (i) at frekvensen av de-adhesjonen var kritisk avhengig av pre- eksisterende actomyosinkontraktilitet (jfr figurene 3B og 3C) og (ii) at tap av celle-matrise-adhesjon drev endringer i viktige adhesjons-avhengige cellesignalveier inkludert Src-avhengig fosforylering paxillin og myosinlettkjedefosfatase II fosforylering 9 (se figur 1). Disse dataene har viktige implikasjoner for forståelsen av endotelfunksjon og barriereintegritet under betennelsesreaksjoner, hvor subendotel ekstracellulære matrise er innblandet som et viktig mål for oksidanter produsert av subendotel forekomster av matrise-bundet MPO eller andre kilder til reaktive oksidanter 3,5-9, 14.
Bruken av en mikromatrisebasert, celle-substrat impedans biosensor system gir en plattform for robuste, high-throughput celle adhesjon målinger. Hver brønn i 96-brønners celle-substrat impedans microelectrode matriser har potensiale for samtidig å analysere 32 forskjellige eksperimentelle betingelser (det vil si, 3 brønner per tilstand). Imidlertid, når man sammenligner små endringer i celleadhesjon, i det minste fire eller flere brønner bør brukes pr eksperimentell tilstand. Under celle seeding og påfølgende celle behandlinger, bør man sørge for å holde alle løsninger ved 37 ° C og redusere tiden det tar å behandle celler utenfor 37 ° C inkubator miljø (dette unngår potensielle temperaturforskjeller over microelectrode array som kan påvirke vedheft svar ). Spesielt, er følsom for ionestyrken av cellesupernatanten 10 den elektriske strøm ved den celle substrat grensesnitt: følgelig celler bør få lov til å stabilisere seg etter tilsetning av nye buffere / media for å oppnå en jevn celleindeks respons før overvåke effekten av stimulans av interesse (se 3.10 og figur 3A). Reduksjoner i celleindeks kan ikke bare gjenspeile en reduksjon i det gjennomsnittlige område av celle-matriks kontakt, men kan også gjenspeile en reduksjon i antall festede celler. Å diskrimineremellom disse muligheter, kan endringer i antallet festede celler på mikroelektrode arrays kvantifiseres umiddelbart etter celle-substrat impedansmålinger ved krystallfiolett farging denne metoden har blitt benyttet for å bekrefte at MPO-mediert fibronektin oksydasjon utløser en rask reduksjon i det gjennomsnittlige område av celle-matrise kontakt, men ikke fremme celle avløsning (for detaljer, se 9).
En begrensning av den celle substrat impedans teknikken er at den gir en gjennomsnittlig grad av adhesjon endringer over alle cellene som er tilstede på overflaten mikroelektroden, og det gir ikke informasjon om den nøyaktige natur av adhesjon eller morfologiske endringer på nivå av individuelle celler. For å møte denne begrensningen, levende celle DIC mikroskopi og bildeanalyse gir en utfyllende mål på vedheft endringer og avslører morfologiske endringer av individuelle celler. Således avtar i celleindeks i respons til MPO-mediert fibronektin oksydasjon meamålt ved celle-substrat impedans (figur 3A) korrelerer godt med reduksjoner i det projiserte område av celler målt ved levende celle bildeanalyse av DIC filmer (figur 3B). Viktigere, DIC filmer avsløre at i enkeltceller, MPO-indusert de-adhesjon innebærer rask tilbaketrekking av perifere cellemembranen fra undergrunnen og tilstøtende celler og til slutt resulterer i celler forutsatt en kompakt "rundet opp" morfologi, men uten resultat i celle avløsning (Movie 1). Som med celle-substrat impedansmålinger, for å sikre reproduserbare cellulære responser, bør man sørge for å opprettholde løsninger ved 37 ° C før bruk på celler og et oppvarmet mikroskop scenen (eller tilsvarende temperaturkontroll enhet) må være ansatt under live cell imaging innspillinger.
De protokoller som er beskrevet her kan modifiseres lett ved å erstatte fibronektin med andre rensede matrikssubstrater (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen opplysninger å gjøre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
