Her presenterer vi en protokoll for kontinuerlig å kvantifisere celle adhesjon og adhesjons-de prosesser med høy tidsmessig oppløsning i en ikke-invasiv måte ved celle-substrat impedans og levende celle bildeanalyser. Disse tilnærmingene avsløre dynamikken i celle adhesjon / de-vedheft prosesser som utløses av matrise modifikasjon og deres tidsmessige forhold til vedheft avhengig signale hendelser.
Celle-matrise heft spiller en sentral rolle i å kontrollere cellemorfologi og signalering. Stimuli som forstyrrer celle-matrise-adhesjon (f.eks, myeloperoksidase og andre matriks-modifiserende oksidanter / enzymer som frigjøres under inflammasjon) er involvert i å utløse patologiske forandringer i cellulær funksjon, fenotype og levedyktighet i en rekke sykdommer. Her beskriver vi hvordan celle-substrat impedans og levende celle avbildningsfremgangsmåter lett kan anvendes for nøyaktig å kvantifisere sanntids endringer i celle adhesjon og de-adhesjon indusert av matrise modifikasjon (ved bruk av endoteliale celler og myeloperoksidase som en patofysiologisk matriks-modifiserende stimulus) med høy tidsoppløsning, og i en ikke-invasiv måte. Den xCELLigence celle-substrat impedans system kvantifiserer kontinuerlig område av celle-matriksinteraksjonsprosesser, adhesjon ved å måle den elektriske impedans ved celle-substrat-grensesnitt i celler dyrket på gull microelectrode matriser. Bildeanalyse av time-lapse differential kontrast interferens filmer kvantifiserer endringer i det projiserte område av individuelle celler over tid, som representerer endringer i det området av celle-matriks kontakt. Begge teknikkene nøyaktig kvantifisere raske endringer i mobilnettet vedheft og de-vedheft prosesser. Cell-substrat impedans på microelectrode biosensor arrays gir en plattform for robust, high-throughput målinger. Live-cell imaging analyser gi flere detaljer om natur og dynamikk av de morfologiske endringene kvantifisert ved celle-substrat impedansmålinger. Disse komplementære tilnærminger gi verdifull ny innsikt i hvordan myeloperoxydase-katalysert oksidativ modifikasjon av subcellulære ekstracellulære matrikskomponenter utløser raske endringer i celle adhesjon, morfologi og signalering i endotelceller. Disse metodene er også aktuelt for å studere cellulære vedheft dynamikk i respons til andre matrisemodifiser stimuli og i beslektede adherente celler (f.eks, epiteliale celler).
Stabile klebende kontakt mellom cellene og deres omgivende ekstracellulær matriks er nødvendig for opprettholdelse av homøostase vev. For eksempel, endotelial celleadhesjon til subendotel matriks i blodkar spiller en kritisk rolle i å opprettholde integriteten av endotelial laget og homeostatisk funksjon som et regulatorisk, semi-permeabel barriere vaskulær 1. Aktin cytoskjelettet er mekanisk koblet til den selvklebende matriks molekyler på områder av celle-matrise-adhesjon og klebekontakter på celle-matriks-grensesnitt spille en viktig rolle i å bestemme posisjonen av cellemembranen ved å motstå sentralt rettede actomyosin strekkrefter. Ekstracellulære stimuli som endrer celle-matrise-adhesjon nødvendigvis å endre balansen av krefter på celle-matriksinteraksjonsprosesser grensesnitt, en hendelse som er hurtig 'avfølt' ved mekanisk-sensitivt signaleringsproteiner, hvilket resulterer i transduksjon av "utenfor-i signale". Dette krysstale betlom celler og deres omliggende ekstracellulære matrise spiller en nøkkelrolle i å kontrollere celleform, bevegelighet, funksjon, spredning og overlevelse 2.
Forskjellige patofysiologiske prosesser (embryoutvikling, inflammasjon, sårhelbredelse og kreft metastase) er kjennetegnet ved dynamisk remodellering av klebemiddel matrikssubstrater av matrisenedbrytende oksidanter og / eller enzymer 3,4. For eksempel lim subendotelmatriksen proteiner i blodkarene (f.eks fibronektin) er implisert som viktige mål for modifisering eller nedbrytning i humane inflammatoriske sykdommer på grunn av den lokaliserte produksjon av reaktive oksidanter (f.eks, hypoklorsyre, HOCl) av leukocytt-avledede enzym myeloperoksidase (MPO), som akkumuleres i løpet av subendotel inflammatorisk vaskulær sykdom (figur 1) 5-9. Endringer i celle-matrix adhesjon indusert av MPO-avledet oksidanter og andre matrisemodifiserende stimuli er likEly å spille viktige roller i å endre vaskulær homeostase i en rekke patologiske prosesser, for eksempel, ved å forandre endotelial cellesignalisering, morfologi og levedyktighet, som i sin tur perturbs endotelial funksjon og barriereintegritet. Imidlertid er de morfologiske og cellesignale svarene av heftende celler til ekstracellulære matrise modifikasjoner bare begynner å bli forstått.
For å forstå hvordan matrise modifikasjoner drive endringer i celle adhesjon dynamikk og adhesjons-avhengige cellesignalveier, er teknikker som kreves som nøyaktig kvantifisering av endringer i celle-matrise-adhesjon i sanntid med høy tidsoppløsning. Her beskriver vi komplementær celle-substrat impedans og levende celle avbildningsteknikker som oppfyller disse kriteriene og gir en plattform for å kvantifisere celleadhesjon og de-adhesjons prosesser i en ikke-invasiv måte.
Vi viser hvordan disse celle-substrat impedans og levende celle bildebehandling hensiktssmerter kan lett anvendes for å (i) å overvåke dynamikken i celleadhesjon og spredning (dvs. de novo celleadhesjon) på native og det modifiserte matrikssubstrater, og (ii) for å måle dynamikken i celle-matriks løsgjøring (dvs. de-adhesjon ) av adherente celler eksponert for matriks-modifiserende stimuli. Den xCELLigence celle-substrat impedans biosensor system gir en kontinuerlig måling av det området av celle-matriksinteraksjonsprosesser kontakt ved å kvantifisere elektrisk impedans ved overflaten av 96-brønners gull microelectrode matriser og uttrykker disse elektriske impedansmålinger som "celleindeks", en dimensjonsløs verdi som er stort sett proporsjonal med arealet av celle-substrat kontakt 10 (figur 2), mens det også er følsomme for endringer i den gjennomsnittlige avstand mellom (isolerende) cellemembranen og elektrodeoverflaten 11. En ytterligere økning i celleindeksverdier er også oppnådd ved dannelse av tett celle-celle-kontakter that begrense paracellulære strøm flyter, 11 betingelser som ikke gjør seg gjeldende i de eksperimenter som er beskrevet i denne studien. Måling av anslått areal av individuelle celler over tid ved bildeanalyse av time-lapse differensial interferens kontrast (DIC) filmer gir en utfyllende mål på endringer i området av celle-substrat kontakt og gir mer informasjon om den nøyaktige natur og dynamikk av morfologiske endringer kvantifisert ved celle-substrat impedans tilnærming.
Nærmere bestemt beskrives anvendelsen av disse fremgangsmåter for å overvåke hvordan MPO-formidlet oksydasjon av klebe subendotel matriksproteiner (f.eks fibronektin) (i) reduserer de novo adhesjon av suspenderte endotelceller mot renset fibronectin og (ii) utløser celle-matriks de -adhesion i endotelceller med etablert vedheft på fibronektin. Ved å utføre parallell celle signale analyser over tid ved hjelp av relevant Biochemical analyser (for eksempel Western blotting), tidsmessige og årsakssammenhenger mellom adhesjon / de-vedheft prosesser og tilhørende endringer i vedheft avhengige cellesignale hendelser kan bestemmes.
Disse fremgangsmåter ble nylig anvendt for å demonstrere at ekstracellulære matriks oksidasjon katalysert av subendotel forekomster av MPO utløser et hurtig tap i celle-matrise-adhesjon av endotelceller som er drevet av pre-eksisterende actomyosin kontraktile krefter 9. Viktigere, ved at den tidsmessige forholdet mellom endringer i både celleadhesjonen og heft-avhengige celle signale å være bestemt, identifisert disse tilnærmingene som MPO-indusert matrise modifisering og cellulær de-adhesjon utløser endringer i viktige vedheft avhengige cellesignalveier inkludert Src kinase -avhengig paxillin fosforylering og myosinlettkjedefosfatase II fosforylering (figur 1) 9. Denne modusen av Redox-avhengige signalering, invOlving aktivering av intracellulære signalhendelser ved ekstracellulære oksidative reaksjoner som forstyrrer celle-matrise-adhesjon, representerer en ny modus av cellesignale betegnet "utenfor-i redoks-signalering" (figur 1) 9.
Generelt bør disse utfyllende celle-substrat impedans biosensor og levende celle avbildningsfremgangsmåter være verdifulle i å avsløre hvordan ulike matrise-modifiserende stimuli eller agenter drive endringer i celle adhesjon dynamikk, morfologi og signalering innenfor forskjellige adherente celletyper som er utsatt for en rekke eksperimentelle innstillinger.
Følgende protokoll beskriver hvordan å kvantifisere effekten av MPO-mediert matrise oksidasjon på de novo endotelceller adhesjon (Forsøk 1) og endotelceller de-adhesjon (Eksperiment 2) prosesser. MPO bindes kraftig til fibronektin og andre klebe subendotel ekstracellulære matrix proteiner og osses hydrogenperoksid (H 2 O 2) for å omdanne klorioner (Cl -) til det sterkt reaktive klorerings oksydasjonsmiddel underklorsyrling (HOCl), som reagerer lokalt med disse matriksproteiner og forstyrrer deres celle adhesive egenskaper (figur 1) 8,9, 12.
Celle-matrise heft og de-vedheft prosesser kan kvantifiseres presist i sanntid med høy tidsoppløsning ved hjelp av celle-substrat impedans og levende celle bildebehandling analyser. Disse sanntids tilnærminger gir en stor fordel i forhold til endepunktet analyser av celleadhesjon, noe som gir dårlig tidsmessig oppløsning. Ved nøyaktig kvantifisere raske de-vedheft svar med høy tidsoppløsning, kan disse analysene gi kritisk innsikt i hvordan morfologisk respons til matrise modifikasjoner er regulert og hvordan de…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |