Introduction
L'introduzione di tecnologie iperespressione impulso sia gli studi biochimici di basso numero di copie enzimi e la produzione industriale di proteine farmacologicamente attive (ad esempio, insulina). Con l'avvento di queste tecnologie, progressi significativi sono stati raggiunti per aumentare la resa e la qualità delle proteine ricombinanti. Inoltre, procariote ed eucariote 1,2 3 sistemi iperespressione sono stati sviluppati nel corso degli anni, offrendo alternative utili al "cavallo di lavoro" di proteine biotecnologie, cioè, Escherichia coli. In particolare, la disponibilità di piattaforme alternative a E. coli ha portato alla produzione di peptidi o proteine ricombinanti recanti modificazioni post-traduzionali. Tuttavia, va detto che E. coli rappresenta ancora l'organismo di riferimento per la produzione di proteine ricombinanti. Ciò è dovuto a diversi fattori, tra cui la più rilevante può essereconsiderato: i) la disponibilità di un certo numero di sistemi iperespressione (vettori di espressione e ceppi) per E. coli 1,2; ii) i tempi breve generazione, e alti rendimenti biomassa, di E. coli in una varietà di media ricchi e sintetici; iii) la manipolazione facile né al biochimico e a livello genetico di questo microrganismo; iv) l'isolamento di ceppi capaci di produzione di proteine tossiche 4; v) la costruzione di ceppi caratterizzati induzione omogenea a livello di popolazione 5,6. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che i sistemi di espressione adatti per la produzione in E. coli di proteine post- traslazione modificati può essere concepita e costruita 2.
Allo stato attuale, la proteina sovraespressione è principalmente utilizzato per ottenere proteine monomeriche o omo-oligomeri, le cui hypersynthesis può essere eseguita con un singolo gene clonato in un plasmide appropriata. Tuttavia, l'attenzione è stata recentementeversato alla costruzione di E. sistemi di proteine co-espressione coli, sfidando la produzione, in vivo, di complessi etero-oligomerica 2. È interessante notare che i primi esperimenti di proteine co-espressione di fronte all'Assemblea inter-specie di grandi e piccole subunità di carbossilasi cianobatteri ribulosio-1,5-bisfosfato / ossigenasi 7,8, e l'associazione di forme troncate e lungometraggi di HIV-1 trascrittasi inversa 9. Questi studi pionieristici hanno dimostrato che la proteina co-espressione rappresenta una potente alternativa al tradizionale ricostituzione vitro. Inoltre, la proteina co-espressione in E. coli è stato usato per produrre diverse proteine recanti modificazioni post-traduzionali 2, per ottenere proteine contenenti amminoacidi innaturali 2, e per aumentare la resa di proteine di membrana sovraespresso 2. Inoltre, il potenziale della proteina co-espressione come uno strumento per conferire a E. coli competerence della secrezione di proteine è sotto inchiesta attiva 2.
Due strategie principali di proteine co-espressione in E. coli può essere perseguito: i) l'uso di un singolo plasmide per ospitare diversi geni da sovraespresso; ii) l'uso di più plasmidi in singole cellule co-esprimono proteine bersaglio. Nel primo caso, i criteri per la scelta del plasmide non differiscono da quelle dei tradizionali esperimenti singole proteine iperespressione, anche se particolari plasmidi contenenti tandem elementi promotore / operatore stati costruiti per co-espressione 10. Questo primo approccio è quindi molto semplice. Tuttavia, va detto che l'uso di un singolo plasmide co-esprimere proteine diverse facce due grandi difficoltà: i) la massa molecolare del vettore aumenta con il numero di geni ospitati, limitando il numero di proteine co-espresse; ii) quando più geni clonati sono sotto il controllo di un unico promotore, polarità può decreasall'e l'espressione dei geni distali dal promotore. L'uso di plasmidi doppi o multipli in un'unica E. coli deve compiere la compatibilità dei vettori di scelta, quindi imporre vincoli alle combinazioni ammissibili di plasmidi. Tuttavia, questa seconda strategia co-espressione presenta il vantaggio di contenere la massa molecolare di vettori, e limita la polarità. Recentemente abbiamo costruito un sistema di co-espressione della proteina progettato per facilitare la spola di geni tra plasmidi co-espressione 11. In particolare, abbiamo costruito la serie vettori PGOOD, le caratteristiche rilevanti dei quali sono: i) origine p15A di replica, per garantire la compatibilità dei plasmidi PGOOD con i vettori commerciali che contiene l'origine ColE1 (ad esempio, la serie pBAD 12); ii) una cassetta tetraciclina resistenza; iii) la presenza di lac -derived elementi regolatori, cioè, il promotore-operatore (O 1) Coppia e Laci q. Utilizzando un adeguato paio pBAD-PGOOD, siamo stati in grado di iperespressione nucleo catalitico di E. DNA polimerasi coli III, composto da tre differenti subunità, cioè, α (il 'polimerasi, ε (3'-5 5'-3)' exonuclease) e θ (stabilizzazione ε) 13. In particolare, abbiamo dimostrato che la co-espressione del complesso αεθ era strettamente dipendente dalla aggiunta alla E. coli terreno di coltura sia di IPTG e arabinosio, innescando sovraespressione da PGOOD e pBAD rispettivamente (Figura 1A).
Nella presente relazione, illustriamo come proteine co-espressione può efficacemente risolvere le difficoltà legate alla scarsa solubilità di un complesso proteico subunità. Inoltre, si mostra come nei test di complementazione proteica vivo possono essere eseguiti, e abbiamo finalmente riportiamo l'uso di proteine co-espressione di frequenza sintonizzare mutazione in E. coli. A questo scopo, abbiamo utilizzato le coppie PGOOD-PBAD idonei per illustrare esempi rilevanti di ciascun caso di studio.
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Protocol
1. Isolamento di E. coli Co-trasformanti
- Preparare le cellule elettro-competente della appropriata E. coli da trasformare. Trasferimento a 1 ml di terreno LB (Triptone, estratto di lievito, NaCl a 10, 5, e 10 g / L, rispettivamente) una singola colonia del ceppo di scelta, e incubare a 37 ° C in stringono condizioni di 180 giri al minuto. Diluire la precoltura 1: 500 in 25 ml di mezzo fresco LB ed incubare la coltura a 37 ° C.
- A log-fase (0,6 OD) centrifugare la sospensione cellule a 5.000 xg per 20 minuti), e risospendere il pellet in 10%, v / v sterile glicerolo-acqua ghiacciata nella metà del volume cultura originaria. Ripetere questa operazione 4 volte, dimezzando ogni volta il volume risospensione. Infine, risospendere il pellet in glicerolo / acqua e dividere la sospensione cellule in 50 microlitri aliquote. Conservare le aliquote a -80 ° C fino a 6 mesi.
- Sciogliere il plasmide desiderato in acqua sterile integrato con EDTA 0,5 mm. Thaw su ice un'aliquota di cellule elettro-competente e mescolare con una quantità appropriata (2,5-5 ng) di vettore. Versare il composto in una vaschetta 0,1 centimetri adatto per elettroporazione, e applicare 1,8 kV.
- Immediatamente trasferire le cellule elettroporate in 1 ml di terreno SOC (terreno LB integrato con 0,2% w / v di glucosio, 10 mM MgCl 2, 2.5 mM KCl), incubare per 1 ora sotto agitazione, e infine trasferire aliquote di 100 microlitri di piastre di Petri contenenti LB agar con l'antibiotico appropriato. Incubare O / N a 37 ° C.
- Purificare trasformanti strisciando singole colonie su piastre di Petri.
- Preparare le cellule elettro-competente dei trasformanti primari e ripetere i passaggi da 1.1 a 1.5 per trasformare con ulteriori plasmidi.
- Preparare glicerolo scorte di co-trasformanti. Trasferimento di una singola colonia in LB addizionato con antibiotici appropriati, incubare a 37 ° C sotto agitazione, e al log-fase (0,6 OD) centrifugare la sospensione cellule a 5.000 xg per 20 min. Resuspend il pellet in LB-antibiotici mezzo contenente 15% v / v glicerolo. Distribuire in aliquote e conservare a - 80 ° C.
2. Co-espressione di α e ε subunità E. coli DNA polimerasi III
- Trasferire con un'ansa sterile una piccola quantità di glicerolo magazzino ceppo appropriata (ad esempio, TOP10 / PGOOD-ε243 e TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160, vedi Figura 1) in una capsula di Petri contenente terreno LB e antibiotici. Lasciate che le cellule di sospensione secca sulla piastra di Petri, e strisciare le cellule gocciolina. Incubare a 37 ° CO / N.
- Trasferimento, utilizzando uno stuzzicadenti sterili, una singola colonia di 1 ml di LB-antibiotici medie. Incubare 8 ore a 37 ° C. Diluire la precoltura 1: 500 in mezzo fresco e incubare a 30 ° C per 15 h.
- Aggiungi IPTG, arabinosio, o arabinosio e IPTG, 1 mm ciascuna. Incubare a 30 ° C per 2,5 ore. Raccogliere le cellule, e memorizzare i pellet a -20 ° C.
- Pellets Scongelare su ghiaccio e risospendere in tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, ditiotreitolo 2,5 mm, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), pH 8). Omogeneizzare delicatamente la sospensione cellule con un vasaio vetro freddo.
- Sonicare a 15 W per 15 secondi, seguito da 15 intervallo di raffreddamento sec (4 cicli).
- Centrifugare gli estratti proteici totali a 10.000 xg per 20 minuti, a 4 ° C per recuperare la frazione solubile.
- Analizzare mediante SDS-PAGE (12,5% acrilammide) aliquote di ogni estratto proteina solubile. A tale scopo, trasferire 20 microlitri di ogni estratto proteina solubile in provette Eppendorf contenenti 60 ml di H 2 O e 20 microlitri di tampone di caricamento (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanolo, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) di glicerolo, 0,25% (w / v) di blu di bromofenolo) e bollire per 5 min. Carico 18 microlitri di ciascun campione ed eseguire l'elettroforesi a 140 V per circa 1,5 ore.
3. Co-espressione di α subunità di Deinococradiodurans CUS DNA polimerasi III e ε subunità di E. coli DNA polimerasi III
- Preparare una precoltura della E. coli ceppo TOP10 / pBAD-α Dr / PGOOD-ε243 in 1 ml di terreno LB-ampicillina-tetraciclina e incubare 8 ore a 37 ° C. Diluire 1: 1.000 in terreno fresco e incubare O / N a 37 ° C.
- Diluire 1: 100 in 200 ml di mezzo fresco, incubare a 37 ° C per 3 ore, poi indurre per 3 ore con arabinosio e IPTG, 1 mM ciascuno. Raccogliere le cellule, e conservare il pellet a -20 ° C.
- Risospendere il pellet in 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Mescolare e distruggere le cellule, come descritto in 2.4 e 2.5.
- Centrifugare immediatamente le cellule lisato a 10.000 xg per 20 min. Eliminare il pellet. Filtrare il surnatante con un imbuto Buchner dotato di 3 strati di carta da filtro. Applicare dolce di vuoto. Per evitare eccessiva formazione di schiuma, mantenere la beuta vuoto su ghiaccio durante la filtrazione.
- Determinare la concentrazione di proteine secondo Bradford 14.
4. Gel Filtration Chromatography
- Equilibrare un 16X70-rivestito di acqua (200) colonna di gel filtrazione con 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. carico sulla colonna dell'estratto proteina solubile. Per una risoluzione ottimale, utilizzare un ciclo campione di 1 ml. Eseguire la cromatografia a 0.6 ml / min. Mantenere la temperatura della colonna a 4 ° C in tutto.
- Raccogliere 0,9 ml frazioni e analizzare con SDS-PAGE. Trasferire 20 ml di ogni frazione rilevante per provette Eppendorf contenenti 60 ml di H 2 O e 20 microlitri di tampone di caricamento (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanolo, 10% (w / v) di SDS, 50% ( v / v) di glicerolo, 0,25% (w / v) di blu di bromofenolo) e far bollire per 5 min. Carico 18 microlitri di ciascun campione ed eseguire l'elettroforesi a 140 V per circa 1,5 ore.
- Determinare il 3'-5 'esonucleasi e l'attività della DNA polimerasi di ciascuna frazione in 96-cill micropiastre. Analizzare l'attività di esonucleasi 5'-utilizzando timidina monofosfato estere p-nitrofenil (p NP-TMP) come substrato 15. Stima polimerasi DNA usando l'PPX (pirofosfatasi, Purine nucleoside fosforilasi, xantina ossidasi) enzima accoppiato dosaggio 16 e 2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrofenil) -5-cloro fenil-2H-tetrazolio (INT) come accettore di elettroni 16.
5. Mutazione Analisi delle popolazioni Co-esprimono la wild-type ε subunità di E. coli DNA polimerasi III e mutageni εD12A Variant
- Trasferire una singola colonia di E. coli TOP10 contenente il pBAD-ε e le pGOOD1-εD12A 11 vettori a 1 ml di LB-antibiotici media. Incubare O / N a 37 ° C.
- Diluire la precoltura 1: 250 in 3 fiasche contenenti mezzo fresco (10 ml), aggiungere le appropriate induttori (arabinosio, IPTG o arabinosio e IPTG, 1 mM ciascuno) e incubare a 37 ° Cper 8 ore. Preparare in culture non-indotta paralleli.
- Raccogliere aliquote di 1 ml, poi diluito 1: 500 in nuove fiasche contenenti mezzo fresco (10 ml) integrato o meno con gli induttori appropriati. Incubare O / N a 37 ° C.
- Ripetere i punti 5.2 e 5.3 e raccogliere aliquote di 1 ml.
- Determinare il numero di generazioni è verificato in ciascuna cultura. Trasferimento su piastre LB, 100 ml di appropriate diluizioni seriali di inoculo e cultura. Incubare O / N a 37 ° C. Contare le colonie su piastre LB, e calcolare il logaritmo del numero di cellule presenti nel inoculo (log I) e nella coltura alla fine della crescita (log C). Per determinare il numero di generazioni, utilizzare la formula: (log C - log I) /0.301.
- Centrifugare a 5.000 xg per 20 min e risospendere le cellule in 1 ml di 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 50 mM. Per permeabilize le celle, aggiungere 2-3 gocce di cloroformio e vortex per 20 sec.
- Determinare il β-Attività glucosidasi di ciascuna aliquota in una micropiastra a 96 pozzetti, utilizzando p -nitrophenyl-β-D-glucopiranoside (PNPGluc) come substrato. Aggiungere a ciascun pozzetto 100 l di cellule permeabilizzate e 100 ml di substrato (16 mg / ml soluzione madre in H 2 O). Fare attenzione ad evitare bolle d'aria nei pozzetti. Leggere l'assorbanza a 420 nm, utilizzando un lettore di micropiastre e il filtro appropriato.
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Representative Results
La subunità ε di E. coli DNA polimerasi III è composto da 243 aminoacidi e dispone di scarsa solubilità 17,18, a meno che i residui 187-243 vengono cancellati 17. Tuttavia, abbiamo già dimostrato 11 che il co-espressione di α full-length, ε, e subunità θ produce solubile DNA polimerasi III nucleo catalitico (Figura 1). In particolare, utilizzando il sistema pBAD-PGOOD co-espressione, abbiamo dimostrato che: i) la sovraespressione di α e subunità ε può essere controllato in modo indipendente da arabinosio e IPTG, rispettivamente (Figura 1A); ii) full-length ε subunità può essere rilevato in estratti proteici solubili isolati da E. coli overesprimenti α, ε e θ e sottoposto a gel-filtrazione (Figura 1B). In questo caso, l'attività esonucleasi stato distribuito in 3 picchi principali (Figura 1B, cerchi pieni), e il picco centrato fraczione 23 ha dimostrato di contenere il nucleo catalitico αεθ (Figure 1C e 1D). La stabilità di ε è notevolmente aumentato in seguito al legame di α e θ. Quando abbiamo già sovraespresso full-length ε in E. coli, una bassa quantità di ε gratuito è stato rilevato da western blotting di proteine solubili estratti 19 (Figura 2A). È interessante notare che, nelle stesse condizioni, abbiamo sempre rilevato maggiore quantità di C-ter forme troncate liberi di ε (ε-234, ε-228, ε-213, o ε-186), tra cui ε-186 risultati migliori 19 (Figura 2A). Abbiamo anche dimostrato che la proteolisi di ε dominio C-terminale è impedito dal legame di α e subunità θ 19. L'effetto, se presente, di co-espressione sulla solubilità di ε può essere facilmente testato. Come riportato in figura 2B, estratti proteici solubili isolate da cellule sovraesprimentiα, ε, o α e ε possono essere analizzati da SDS-PAGE, e convenientemente confronto con estratti di proteine totali. In questo caso, l'analisi elettroforetica indica che, quando overexpressed solo, caratteristiche subunità ε scarsa solubilità (confrontare corsie 1 e 2), mentre la co-espressione di α migliora notevolmente la concentrazione di ε in estratti proteici solubili (confrontare corsie 3 e 4 ).
Co-espressione può anche essere usato per eseguire prove complementazione inter-specie. Di conseguenza, abbiamo pensato che potrebbe essere di interesse per valutare l'interazione tra subunità appartenenti ai macchinari replicative di Gram + e Gram -. Batteri Deinococcus radiodurans è un batterio Gram +, con un grande subunità α (1335 aminoacidi, 150 kDa) e una subunità ε putativo contenente 197 aminoacidi. È interessante notare che, D. radiodurans subunità ε è privo del C-terminale del dominio presente nel suo E. coli E. coli e D. subunità radiodurans ε sono pari al 29% e 59%, rispettivamente, (considerando la regione 1-178, coordinate D. radiodurans). Per saggiare la competenza di D. radiodurans polimerasi III subunità α (α Dr) nel legame E. coli ε subunità, abbiamo clonato nel vettore pBAD un gene sintetico che codifica per α Dr e abbiamo co-trasformato E. coli con pBAD-α Dr e PGOOD-ε. L'aggiunta simultanea di IPTG e arabinosio al mezzo di coltura innesca la co-espressione di α Dr e ε (Figura 3A). L'associazione di questi 2 proteine è stata testata mediante gel filtrazione. Le cellule co-esprimono il DNA polimerasi III α Dr e ε subunità sono stati raccolti mediante centrifugazione (5000 x g, 20 min), sospesa in tampone di lisi, interrotta da sonicazione, e le proteine solubili sono stati immediatily caricata su una colonna Superdex 200 (Figura 3B). Come mostra la Figura 3C, quando le frazioni raccolte sono stati sottoposti a exonuclease 3'-5 'e al DNA polimerasi saggi di attività, i picchi di attività sono state rilevate presso significativamente spostato posizioni, il che suggerisce che α Dr non è competente nel legame E. subunità coli ε. Ciò è stato confermato quando aliquote di frazioni 32, 36, e 52 sono stati concentrati e analizzati mediante SDS-PAGE. Frazione 36 è stato trovato per contenere α Dr e di essere privo di E. coli ε subunità, mentre frazione 52 conteneva E. coli ε ma era privo di α Dr (Figura 3D).
Replica fedeltà si basa principalmente sulla capacità di DNA polimerasi discriminare abbinamenti di base erronee durante l'estensione DNA. Tuttavia, deoxynucleotides non corrispondenti possono essere incorporati a 10 -4 frequenza 20, e l'azionedi 3'-5 'esonucleasi è essenziale per rileggere il filamento di DNA di nuova sintesi. Inoltre, è stato stimato che questa azione di modifica del DNA aumenta la replicazione fedeltà da 3 ordini di grandezza 20. Di conseguenza, i ceppi mutator possono essere costruiti alterando correzione del DNA, ad esempio, da condizionale esprimendo una variante mutageno di E. subunità coli DNA polimerasi III ε. Questo può essere ottenuto costruendo una variante di ε competente legame α ma privo della sua attività di correzione di bozze, e controllare la produzione di ε mutageno da sistemi di espressione appropriati. Usando questa strategia, è stato dimostrato che E. coli frequenza aumenta mutazione in condizioni che inducono varianti mutagene di ε 11,21. Tuttavia, nessuna messa a punto della frequenza di mutazione è stato compiuto con questo mezzo. Protein co-espressione può essere utilizzato per ottenere un migliore controllo di ceppi mutatori. A questo scopo, abbiamo co-trasformati E. coli conPBAD-ε e pGOOD1-εD12A, al fine di indurre l'espressione del wild-type e la variante D12A mutageno di ε con arabinosio e IPTG rispettivamente. Come test fenotipico, abbiamo determinato la comparsa di attività β-glucosidasi, che è criptico (Bgl -) in wild-type E. coli 22,23. Mutanti spontanei in grado di utilizzare β-glucosidi come fonti di carbonio (Bgl +) possono essere arricchiti o isolati con fluidi liquidi o solidi 23 24, rispettivamente. Quando le cellule sono state indotte ad esprimere la D12A variante mutageno, l'attività β-glucosidasi è stata acquisita in ca. 20 generazioni (Figura 4A). Va notato che una tendenza simile è stato osservato in cellule non-indotta (Figura 4A), molto probabilmente perché il controllo trascrizionale esercitata su pGOOD1 è piuttosto perde 11. Tuttavia, quando il wild-type ε subunità è stata indotta, da solo o in combinazione con la variante D12A, β-glucosidasil'attività è stata acquisita da E. coli a livelli moderati (Figura 4A). L'attività β-glucosidasi di BGL + mutanti è stato segnalato per variare tra 3 e 40 micron / min 23. Il livello stabilito qui a E. popolazioni coli sottoposti al espressione di εD12A è molto più basso, ma deve essere considerato che non abbiamo tentato di isolare BGL + mutanti su terreni solidi.
Figura 1. Co-espressione di E. DNA polimerasi coli III nucleo catalitico. (A) SDS-PAGE delle proteine totali estratte da E. coli TOP10 / pBAD-α1160 / PGOOD-ε243 coltivata in assenza di induttori, in presenza di soli arabinosio, di IPTG solo, o in mezzo integrato sia con arabinosio e IPTG (corsie 1-4 rispettivamente). (B) Assorbanza (cerchi vuoti) e l'attività exonuclease (cerchi pieni) di frazioni isolate sottoponendo a gel-filtrazione proteine solubili estratte da E. coli TOP10 overexpressing α, ε, e subunità θ di E. coli DNA Pol-III. (C) SDS-PAGE delle frazioni 6, 12, 23, 31, e 41 (corsie 1-5, rispettivamente) riportati in Pannello B. (D) SDS-PAGE di un'aliquota concentrato della frazione 23, la cui attività esonucleasi e elettroforetico modello sono riportate in pannelli B e C, rispettivamente. Ristampato con il permesso di Biotecnologia Letters, 33, Conte et al:. "PGOODs: nuovi plasmidi per la co-espressione di proteine in Escherichia coli"., 1815-1821 (2011) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. proteolisi di E. coli DNA polimerasi III ε subunità. (A) Degrado del monomero, come rivelato dal western blotting di proteine estratte da E. coli TOP10 overexpressing full-length o forme troncate di ε; frecce indicano la posizione di 25 e 19 marcatori molecolari kDa pre-macchiati. Ristampato con il permesso di Elsevier da Biochimica et Biophysica Acta Proteine e Proteomica, 1794, Bressanin et al:. "La proteolisi della subunità revisione controlla il montaggio di Escherichia coli DNA polymerase III nucleo catalitico", 1606-1615 (2009). (B) Co-espressione di α e ε subunità di E. DNA polimerasi coli III nucleo catalitico. SDS-PAGE del totale (corsie 1 e 3) e solubili (corsie 2 e 4) proteine extracts isolati da cellule sovraesprimenti ε subunità (corsie 1 e 2), o α e subunità ε (corsie 3 e 4).
Figura 3. Co-espressione di DNA polimerasi III α e ε subunità di Deinococcus radiodurans e Escherichia coli, rispettivamente. (A) SDS-PAGE del totale estratti proteici isolati da cellule non indotte (corsia 1), o indotti a iperespressione α Dr, ε, o α Dr e ε (corsie 2-4, rispettivamente). (B) Chromatogram (cerchi vuoti, l'asse a sinistra) e la concentrazione di proteine di frazioni (cerchi pieni, asse a destra) eluizione formare una colonna di gel filtrazione (Superdex 200) caricato con proteine solubili estratte da E. coli overexpressing α Dr unsubunità nd ε. (C) Correzioni (cerchi vuoti, asse a sinistra) e la DNA polimerasi (cerchi pieni, asse a destra) attività delle frazioni riportati in Pannello B. (D) SDS-PAGE delle aliquote concentrate di frazioni di 32, 36, e 52. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. frequenza di mutazione di E. coli sottoposte o meno a co-espressione del wild-type e la variante D12A mutageno di DNA polimerasi III ε subunità. Viene mostrata anche la mappa della nuova pFINE plasmide. (A) L'attività β-glucosidasi di E. coli TOP10 non indotta (No Ind) o sottoposti a sovraespressione di wild-type ε subunità (Ara), la D12A mutageno variante (IPTG), o entrambi wild-type e D12A subunità ε (Ara + IPTG). L'attività β-glucosidasi è riportata in funzione delle generazioni. (B) Mappa del nuovo vettore di espressione pFINE. Il sito di clonaggio multiplo (MCS) di questo plasmide è identico a quelli presenti nelle PBAD e PGOOD vettori compatibili, lasciando spola facile di geni tra loro.
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Discussion
Le proteine possono essere intrinsecamente disordinato, con le regioni la cui struttura terziaria non è limitata a un numero limitato di conformazioni 25. Queste proteine sono disordinati solito incline all'aggregazione 25, e l'isolamento e la caratterizzazione potrebbero rappresentare un compito difficile. La subunità ε di E. DNA polimerasi coli III dispone di due domini distinti 26,27, vale a dire: i) il dominio N-ter, recante la 'attività esonucleasica 3'-5, e competente vincolante subunità θ; ii) il dominio C-ter, responsabile del legame al α (polimerasi) subunità. Il dominio C-ter del ε è noto per conferire scarsa solubilità di questa proteina, promuovendo la sua aggregazione. È stato infatti dimostrato che ε-186, una forma troncata della proteina priva del dominio C-ter, è solubile, e può essere purificato con alte rese 17. Tuttavia, quando l'interazione di ε con α deve essere quantitativamente studiare(Ad esempio, per determinare il K D del complesso αε), è necessaria la purificazione di full-length ε, implicando un compito difficile biochimico. In questo quadro, la proteina co-espressione fornisce stime qualitative del legame di ε a α. Abbiamo dimostrato che elevate rese del complesso αεθ possono essere ottenuti in vivo mediante co-espressione (Figura 1), bypassando la scarsa solubilità della subunità ε. Sorprendentemente, la purificazione del complesso αεθ overexpressed stato segnalato 28,29. La strategia di co-espressione può anche essere utilizzato per verificare se l'inserimento di mutazioni sito-specifiche in uno dei partner interagenti ostacola la formazione del complesso. Pertanto, la proteina co-espressione rappresenta uno strumento comodo e rapido effettuare test qualitativi di interazione proteina-proteina. Va inoltre notato che il nostro sistema di co-espressione si basa sulla diversa induttori 2, cioè, arabinosio e IPTG. Pertanto, controlli appropriati possono essere facilmente eseguite quando si verifica la formazione di un complesso proteico, ad esempio, omettendo uno induttore dal mezzo di crescita batterica (Figura 1A).
Abbiamo presentato qui una procedura ottimale per la co-espressione della α e subunità ε di E. DNA polimerasi coli III. Quando questo protocollo è stato progettato e testato, i seguenti parametri sono stati identificati come critico per il successo di esperimenti di co-espressione: i) la temperatura a cui viene effettuata l'induzione; ii) il tempo di lunghezza dell'induzione; iii) la concentrazione di induttore (s). In particolare, siamo stati in grado di ottenere solubile αεθ complesso 11 da cellule indotte a 37 ° C, indipendentemente dal tempo di induzione. Si consiglia quindi di testare diverse temperature per la fase di induzione, e per controllare la sovraespressione di proteine come funzione del tempo. Inoltre, la valutazione parallela di co-espressione differente E. ceppi coli possono essere di aiuto nell'affrontare i rendimenti moderati delle proteine bersaglio.
Abbiamo riportato qui un esperimento rappresentativo eseguito per verificare il legame delle proteine da specie diverse, e abbiamo dimostrato che la proteina co-espressione è utile per testare rapidamente sezione 2 proteine eterologhe in un complesso funzionale ibrido. Cromatografia di filtrazione gel è stato usato qui per valutare la formazione del complesso (Figura 3). Tuttavia, l'inserimento di un tag appropriato per una delle parti interagenti potrebbe facilitare questa valutazione, lasciando l'uso di metodi di cattura affinità. Per evitare interferenze del tag con le interazioni proteina-proteina, il gene che codifica per uno dei partner interagenti potrebbe essere inserito in parallelo in pBAD / Sua e pBAD / Myc -Il suo vettori, rispettivamente conferiscono un motivo hexahistidine al N- e C -terminus della proteina bersaglio.
E. coli mutatoceppi r presentano frequenze di mutazione più elevate rispetto ai loro omologhi di tipo selvatico. Ceppi mutator sono di interesse nella biotecnologia 30, ad esempio, di evolvere rapidamente un ceppo bersaglio verso nuovi, desiderati, fenotipi. Abbiamo fornito qui la prova che co-esprimono la wild-type e una subunità ε mutageno di E. coli DNA polimerasi III, la frequenza di mutazione del batterio ospite può essere sintonizzato con la convenienza sufficiente. Per migliorare ulteriormente questa tecnologia, vettori di espressione strettamente regolati sono necessarie per reprimere il più possibile l'espressione della variante D12A fortemente mutageno di subunità ε. In particolare, sarebbe interessante per testare la frequenza di mutazione in E. coli trasformato con il pBAD-εD12A e pGOOD1-ε, cioè, l'alternativa di configurazione a quella qui presentata. I vettori PBAD sono infatti noti per essere strettamente regolata 12, e questa caratteristica potrebbe aiutare a mantenere la concentrazione basale di εD12Aa livelli bassi.
Gli esempi di proteine co-espressione qui riportati testimoniano la natura multiforme di questa tecnica. Tuttavia, è importante notare che l'utilizzo di una molteplicità di plasmidi compatibili in un'unica E. coli possono espandere notevolmente le sfide che possono essere ripresi da proteine co-espressione. Negli ultimi anni, intenso lavoro è stato dedicato per espandere il repertorio di plasmidi compatibili di essere utilizzati per la proteina co-espressione. In particolare, un sistema ternario basandosi su plasmidi compatibili portanti le origini ColE1, p15A e pSC101 di replica è stato usato per co-esprimere sia le proteine batteriche e di mammifero 31. Recentemente, è stato segnalato un sistema di co-espressione quaternario. In questo caso, 13 geni eterologhi sono stati co-espresse in E. coli co-trasformato con 4 vettori di espressione compatibili, contenente la ColE1, p15A, CloDF13, e le origini di replicazione 32 RSF. Questo sistema di co-espressione è stata usata con successo per produrre inE. coli idrogenasi solubile funzionalmente attiva mi da Pyrococcus furiosus 32. Per ampliare il nostro sistema binario, abbiamo costruito un nuovo vettore di espressione, pFINE, contenente l'origine di replicazione pSC101, una cassetta neomicina-resistenza, e gli elementi regolatori lac (Figura 4B). Questo plasmide contiene la stessa polylinker presente in PBAD e PGOOD vettori, facilitando così gene spola tra i 3 componenti del sistema di co-espressione. Sebbene pFINE è un basso numero di copie del plasmide, la sua stabilità è risultata soddisfacente quando testati in terreno ricco. Siamo attualmente impegnati in ulteriore espansione del nostro sistema di co-espressione ternario. A questo scopo, abbiamo costruito un derivato pBAD contenente una cassetta cloramfenicolo-resistenza, e siamo sulla strada per scambiare l'origine ColE1 di replica con uno compatibile con ColE1, p15A, e pSC101. È infatti nostra opinione che l'uso di più plasmidi in un'unica E. coli cellule reprisente un potente strumento per sfidare l'espressione in vivo di complessi proteici composto da una moltitudine di differenti subunità.
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Acknowledgments
Il permesso di Springer e Elsevier ristampare dati è fortemente riconosciuta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
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