Introduction
A introdução de tecnologias superexpressão potenciado quer os estudos bioquímicos de baixo número de cópias enzimas Número e a produção industrial de proteínas farmacologicamente activas (por exemplo, insulina). Desde o advento das tecnologias, avanços significativos foram conseguidos para aumentar o rendimento e a qualidade de proteínas recombinantes. Além disso, 1,2 procariotas e eucariotas 3 sistemas superexpressão foram desenvolvidos ao longo dos anos, oferecendo alternativas úteis para o "cavalo de trabalho" da biotecnologia proteína, ou seja, Escherichia coli. Em particular, a disponibilidade de plataformas alternativas para E. coli levou à produção de péptidos recombinantes ou proteínas de rolamento modificações pós-traducionais. No entanto, deve ser mencionado que a E. coli ainda representa o organismo de eleição para a produção de proteína recombinante. Isso se deve a vários fatores, entre os quais o mais relevante pode serconsiderado: i) a disponibilidade de um grande número de sistemas de sobre-expressão (vectores de expressão e estirpes) para E. coli 1,2; ii) vezes a curto geração e de alto rendimento de biomassa, de E. coli em uma variedade de mídia rica e sintética; iii) a manipulação fácil, quer a bioquímica e genética ao nível deste microrganismo; iv) o isolamento das estirpes capazes de produção de proteínas tóxicas 4; v) a construção de cepas que caracterizam indução homogênea a nível da população 5,6. Além disso, demonstrou-se recentemente que os sistemas de expressão adequados para a produção em E. coli de proteínas modificadas pós-tradução podem ser concebidos e construídos 2.
Actualmente, a sobre-expressão da proteína é utilizada, principalmente, para obter proteínas monoméricas ou homo-oligoméricas, cuja hypersynthesis pode ser realizado com um único gene clonado num plasmídeo adequado. No entanto, a atenção foi recentementepago para a construção de E. sistemas de proteína co-expressão de E. coli, desafiando a produção, in vivo, de complexos hetero-oligomérica 2. Curiosamente, os primeiros experimentos de proteína co-expressão se dirigiu à assembléia inter-espécies de grandes e pequenas subunidades de carboxylase cianobactérias ribulose-1,5-bisfosfato / oxigenase 7,8, ea associação de formas truncadas e de corpo inteiro de HIV-1 transcriptase reversa 9. Estes estudos pioneiros demonstrado que a co-expressão da proteína representa uma poderosa alternativa ao tradicional na reconstituição in vitro. Além disso, a proteína co-expressão em E. coli foi utilizado para produzir diferentes proteínas que ostentam modificações pós-traducionais 2, para se obter proteínas que contêm aminoácidos não naturais 2, e para aumentar o rendimento de proteínas de membrana overexpressed 2. Além disso, o potencial de co-expressão da proteína como uma ferramenta para conferir a E. coli competirnce na secreção de proteínas está sob investigação ativa 2.
Duas estratégias principais de co-expressão da proteína em E. coli pode ser prosseguido: i) o uso de um único plasmídeo para receber os diferentes genes a ser sobre-expresso; ii) a utilização de vários plasmídeos em células individuais para co-expressar as proteínas alvo. No primeiro caso, os critérios para a escolha do plasmídeo não diferem dos de experiências individuais tradicionais sobre-expressão da proteína, embora determinados plasmídeos contendo em tandem os elementos promotor / operador foram construídos para co-expressão de 10. Esta primeira abordagem é, portanto, bastante simples. No entanto, deve mencionar-se que o uso de um único plasmídeo de co-expressar proteínas diferentes enfrenta dois grandes problemas: i) a massa molecular do vector aumenta com o número de genes que alberguem, limitando o número de proteínas co-expressas; ii) quando vários genes foram clonados sob o controlo de um único promotor, de polaridade pode decreasum e a expressão dos genes distais do promotor. O uso de plasmídeos duplos ou múltiplos no único E. células de E. coli tem de realizar o grau de compatibilidade dos vectores de escolha, por conseguinte, a imposição de restrições para as combinações de plasmídeos elegíveis. No entanto, esta segunda estratégia de co-expressão apresenta a vantagem de conter a massa molecular de vectores, e limita polaridade. Construiu-se, recentemente, um sistema de co-expressão de proteínas concebido para facilitar o vaivém de genes entre os plasmídeos de co-expressão de 11. Em particular, nós construídos vectores da série pGOOD, as características relevantes dos quais são os seguintes: i) uma origem de replicação de p15A, para proporcionar a compatibilidade dos plasmídeos pGOOD com os vectores comerciais contendo a origem ColE1 (por exemplo, a série de pBAD 12); ii) uma cassete de resistência à tetraciclina; iii) a presença de lac -derived elementos reguladores, ou seja, o promotor-operador (O 1) casal eo lacI q. Usando um par pBAD-pGOOD disso, fomos capazes de overexpress o núcleo catalítico de E. coli ADN polimerase III, composto por três subunidades diferentes, ou seja, α (5'-3 'da polimerase), ε (3'-5' exonuclease) e θ (estabilizador ε) 13. Em particular, foi demonstrado que a co-expressão do complexo αεθ era estritamente dependente da adição à E. coli meio de cultura de ambos IPTG e arabinose, provocando a sobre-expressão de pBAD pGOOD e, respectivamente (Figura 1A).
No presente relatório, que ilustram como proteína co-expressão pode eficientemente resolver dificuldades relacionadas com a baixa solubilidade de uma proteína subunidade complexo. Além disso, mostramos como em testes de complementação de proteína vivo pode ser realizada, e, finalmente, um relatório sobre a utilização de proteínas co-expressão a frequência de mutação sintonizar E. coleu. Para tal, utilizou-se casais pGOOD-pBAD adequados para ilustrar exemplos relevantes de cada estudo de caso.
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Protocol
1. Isolamento de E. coli co-transformantes
- Prepare células eletro-competente do E. apropriado coli estirpe a ser transformada. Transferência para 1 ml de meio LB (triptona, extracto de levedura, NaCl a 10, 5 e 10 g / L, respectivamente) de uma única colónia da estirpe de escolha, e incubar a 37 ° C sob condições de agitação de 180 rpm. Dilui-se a pré-cultura de 1: 500 em 25 ml de meio LB fresco e incuba-se a cultura a 37 ° C.
- Na fase de log (0,6 OD) centrifugar a suspensão de células em 5000 xg durante 20 min), e ressuspender o sedimento em 10%, v / v arrefecido em gelo estéril de glicerol-água em metade do volume de cultura original. Repita este passo 4 vezes, reduzir para metade a cada vez que o volume de ressuspensão. Finalmente, ressuspender o sedimento em glicerol / água e dividir a suspensão de células em alíquotas de 50 ul. Armazenar as alíquotas a -80 ° C até 6 meses.
- Dissolve-se o plasmídeo pretendido em água estéril suplementado com 0,5 mM de EDTA. Thaw em ice uma alíquota de células eletro-competentes e misturar com uma quantidade apropriada (2,5-5 ng) de vector. Dispensar a mistura em uma solução de 0,1 cm de percurso óptico adequado para a electroporação, e aplicam-se 1,8 kV.
- Transferir imediatamente as células electroporadas em 1 ml de meio SOC (meio LB suplementado com 0,2% w / v de glucose, 10 mM de MgCl2, 2,5 mM de KCl), incubar durante 1 h sob agitação, e, finalmente, transferi-se alíquotas de 100 ul para placas de Petri contendo LB agar com o antibiótico apropriado. Incubar O / N a 37 ° C.
- Purifica-se os transformantes por estrias colónias únicas em placas de Petri.
- Prepare células eletro-competente dos transformantes primários e repita os passos 1.1 a 1.5 para transformar com outros plasmídeos.
- Prepare stocks de glicerol dos co-transformantes. Transferir uma única colónia em LB suplementado com os antibióticos apropriados, incubar a 37 ° C sob agitação, e a fase de log (0,6 OD) centrifugar a suspensão de células a 5000 x g durante 20 min. Resuspend o sedimento em meio LB-antibióticos contendo 15% v / v de glicerol. Dispensar em alíquotas e armazenar a - 80 ° C.
2. A co-expressão de α e ε Subunidades de E. coli ADN polimerase III
- Por meio de uma agulha esterilizada uma pequena quantidade do estoque de glicerol tensão adequada (por exemplo, TOP10 / pGOOD-ε243 e TOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, veja a Figura 1) em uma placa de Petri contendo meio LB e antibióticos. Deixe secar células suspensão na placa de Petri, e raia as células gota. Incubar a 37 ° CO / N.
- Transferência, utilizando um palito estéril, uma única colónia para 1 ml de meio LB-antibióticos. Incubar 8 horas a 37 ° C. Dilui-se a pré-cultura de 1: 500 em meio fresco e incuba-se a 30 ° C durante 15 h.
- Adicionar IPTG, arabinose, ou arabinose e IPTG 1 mM cada. Incubar a 30 ° C durante 2,5 h. Recolher as células, e armazenar os peletes a -20 ° C.
- Descongelar as pelotas em gelo e ressuspender em tampão de lise (50 mM Tris-HCl, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2,5 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), pH 8). Gentilmente homogeneizar a suspensão células com um oleiro vidro frio.
- Sonicar a 15 W durante 15 segundos, seguido por 15 segundos de intervalo de arrefecimento (4 ciclos).
- Centrifuga-se os extractos de proteína total a 10.000 xg durante 20 min, a 4 ° C para recuperar a fracção solúvel.
- Analisar por alíquotas de cada extracto de proteína solúvel em SDS-PAGE (12,5% de acrilamida). Para este objectivo, transferir 20 ul de cada extracto de proteína solúvel para tubos Eppendorf contendo 60 ul de H2O e 20 ul de tampão de carga (250 mM de Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) e ferver durante 5 min. Carga de 18 ul de cada amostra e realizar a electroforese a 140 V durante cerca de 1,5 h.
3. Co-expressão de α Subunidade de Deinococradiodurans cus ADN Polimerase III e ε Subunidade de E. coli ADN polimerase III
- Prepara-se uma pré-cultura de E. coli estirpe TOP10 / Dr pBAD-α / pGOOD-ε243 em 1 ml de meio LB-ampicilina-tetraciclina e incubar 8 horas a 37 ° C. Diluir 1: 1000 em meio fresco e incubam O / N a 37 ° C.
- Dilui-se 1: 100 em 200 ml de meio fresco, incubar a 37 ° C durante 3 h, em seguida, induzir durante 3 horas com arabinose e IPTG, 1 mM de cada um. Colher as células, e armazenar o sedimento a -20 ° C.
- Ressuspender o pellet em 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Homogeneizar e perturbar as células conforme descrito em 2.4 e 2.5.
- Imediatamente centrifugar as células lisado a 10.000 xg durante 20 min. Desprezar o pelete. Filtra-se o sobrenadante com um funil de Buchner equipado com 3 camadas de papel de filtro. Aplicar vácuo suave. Para evitar a formação excessiva de espuma, manter o vácuo no frasco Erlenmeyer de gelo durante a filtração.
- Determinar a concentração de proteína de acordo com Bradford 14.
4. Cromatografia de Filtração em Gel
- Equilibrar um 16x70 encamisado-água (200) de coluna de filtração em gel com 50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 8. Carga na coluna o extracto de proteína solúvel. Para melhor resolução, use um loop de amostra de 1 ml. Realize a cromatografia em 0.6 ml / min. Manter a temperatura da coluna a 4 ° C durante toda.
- Recolha 0,9 ml frações e analisá-los por SDS-PAGE. Transferir 20 uL de cada fracção relevante para tubos Eppendorf contendo 60 ul de H2O e 20 ul de tampão de carga (250 mM de Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) de SDS, 50% ( v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) e fervura durante 5 min. Carga de 18 ul de cada amostra e realizar a electroforese a 140 V durante cerca de 1,5 h.
- Determinar a exonuclease 3'-5 e a actividade de polimerase de ADN de cada fracção em 96 nósll microplacas. Ensaiar a actividade de exonuclease 5'-timidina utilizando monofosfato de éster de p-nitrofenilo (p-NP PGT) como substrato 15. Estimar a actividade da polimerase de ADN, utilizando o PPX (pirofosfatase, purina nucleosídeo fosforilase, xantina oxidase) acoplado a enzima e ensaio de 16 2- (4-iodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-2H-tetrazólio (INT) como o aceitador de electrões 16.
5. Mutação análise de populações Co-expressam o Wild-tipo ε Subunidade de E. coli DNA polimerase III e mutagênicos εD12A Variant
- Transferir uma única colônia de E. coli TOP10 contendo o pBAD-ε e os pGOOD1-εD12A 11 vectores para 1 ml de meio LB-antibióticos. Incubar O / N a 37 ° C.
- Dilui-se a pré-cultura de 1: 250 em três balões contendo meio fresco (10 ml), adicionar os indutores apropriados (arabinose, IPTG, ou arabinose e IPTG, 1 mM de cada um) e incubar a 37 ° Cdurante 8 h. Prepara-se culturas paralelas não induzidas.
- Recolhe alíquotas de 1 ml, depois dilui-se 1: 500 em novos frascos contendo meio fresco (10 ml) suplementado ou não com os indutores apropriados. Incubar O / N a 37 ° C.
- Repita os passos 5.2 e 5.3 e recolhem alíquotas de 1 ml.
- Determinar o número de gerações ocorreu em cada cultura. Transferir em placas de LB, 100 ul de diluições em série apropriadas de inoculo e cultura. Incubar O / N a 37 ° C. Contar as colónias nas placas de LB, e calcular o logaritmo do número de células presentes no inoculo (log I) e na cultura no final do crescimento (log C). Para determinar o número de gerações, usar a fórmula: (log C - log I) /0.301.
- Centrifugar a 5.000 xg durante 20 min e ressuspender as células em 1 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 50 mM. Para permeabilizar as células, adicionar 2-3 gotas de clorofórmio e de vórtice durante 20 seg.
- Determinar a β-actividade de glicosidase cada aliquota numa microplaca de 96 poços, utilizando-se p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (PNPGluc) como substrato. Adicionar a cada poço 100 ul de células permeabilizadas e 100 ul de substrato (16 mg / ml em solução de H2O). Tome cuidado para evitar bolhas de ar nos poços. Ler a absorvância a 420 nm, utilizando um leitor de microplacas e o filtro apropriado.
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Representative Results
A subunidade de E. ε coli DNA polimerase III é composto por 243 aminoácidos e possui baixa solubilidade em 17,18, a menos que os resíduos 187-243 são eliminados 17. Contudo, mostrámos previamente 11 que o co-expressão de α de comprimento completo, ε, e subunidades θ produz DNA polimerase III solúvel do núcleo catalítico (Figura 1). Em particular, usando o sistema de pBAD-pGOOD co-expressão, demonstramos que: i) a sobre-expressão de subunidades α e ε pode ser controlada independentemente pela arabinose e IPTG, respectivamente (Figura 1A); ii) de comprimento completo ε subunidade pode ser detectada em extractos de proteínas solúveis a partir de isolados de E. células de E. coli que sobre-expressam α, ε, e θ e submetido a filtração em gel (Figura 1B). Neste caso, a actividade de exonuclease foi distribuída em três picos principais (Figura 1B, círculos a cheio), e o pico centrado em fracção 23, mostrou conter o núcleo catalítico αεθ (Figuras 1C e 1D). A estabilidade de ε é grandemente aumentada após ligação a α e θ. Quando anteriormente superexpressado full-length ε em E. coli, uma baixa quantidade de ε livre foi detectada por transferência Western em extractos de proteínas solúveis de 19 (Figura 2A). É interessante notar que, sob as mesmas condições, sempre detectadas maiores quantidades de C-ter formas truncadas livres ε (ε-234, ε-228, ε-213, ou ε-186), entre os quais ε-186 realizada melhor 19 (Figura 2A). Também se mostrou que a proteólise de ε domínio C-terminal é impedido pela ligação de subunidades α e θ 19. O efeito, se algum, da co-expressão da solubilidade de ε pode ser facilmente testada. Conforme relatado na Figura 2B, os extractos de proteína solúvel isolada a partir de células que sobre-expressamα, ε, ou α ε e pode ser analisada por SDS-PAGE, e convenientemente em comparação com os extractos de proteína total. Neste caso, a análise electroforética indica que, quando sobre-expresso por si só, as características de subunidade ε fraca solubilidade (comparar as pistas 1 e 2), enquanto que a co-expressão de α aumenta grandemente a concentração de ε em extractos de proteína solúvel (comparar pistas 3 e 4 ).
A co-expressão pode também ser utilizado para executar testes de complementação inter-espécies. Assim, achamos que poderia ser de interesse para avaliar a interação entre subunidades pertencentes às máquinas replicadoras de Gram + e Gram -. Bactérias Deinococcus radiodurans é uma bactéria Gram +, com uma grande subunidade α (1335 aminoácidos, 150 kDa) e uma subunidade ε putativo contendo 197 aminoácidos. Curiosamente, D. radiodurans ε subunidade é desprovido do domínio C-terminal presente na E. coli E. coli e D. subunidades radiodurans ε são iguais a 29% e 59%, respectivamente (considerando a região 1-178, D. radiodurans coordenadas). Para analisar a competência do D. radiodurans polimerase III subunidade α (α Dr) de ligação em E. coli ε subunidade, temos clonado no vector pBAD um gene sintético que codifica para α Dr e temos co-transformada E. coli com pBAD-α Dr e pGOOD-ε. A adição simultânea de IPTG e arabinose para o meio de cultura desencadeia a co-expressão de α Dr e ε (Figura 3A). A associação destas duas proteínas foi testada por filtração em gel. As células que co-expressam o ADN-polimerase III α Dr e ε subunidades foram recolhidas por centrifugação (5000 xg, 20 min), suspenso em tampão de lise, rompidas por ultra-sons, e as proteínas solúveis foram imediatasly carregada numa coluna Superdex 200 (Figura 3B). Como a Figura 3C mostra, quando as fracções recolhidas foram submetidas a exonuclease 3'-5 'e para os ensaios de actividade de polimerase de ADN, os picos de actividade foram detectados em significativamente deslocado posições, sugerindo que α Dr. não é competente de ligação em E. coli ε subunidade. Isto foi confirmado quando se alíquotas de fracções 32, 36 e 52 foram concentradas e analisadas por SDS-PAGE. Fraction 36 foi encontrado para conter α Dr e ser desprovido de E. coli ε subunidade, enquanto fracção 52 continha E. coli ε mas era desprovida de α Dr (Figura 3D).
Fidelidade de replicação conta principalmente com a capacidade de DNA polimerases de discriminar emparelhamentos de bases erradas durante a extensão do DNA. No entanto, desoxinucleótidos desemparelhados podem ser incorporados em 10 -4 frequência 20, e a acçãode 3'-5 'exonucleases é essencial para corrigir a cadeia de DNA recém-sintetizado. Além disso, estima-se que esta acção edição DNA aumenta a fidelidade de replicação por três ordens de magnitude 20. Deste modo, as estirpes mutantes podem ser construídos por prejudicando revisão de ADN, por exemplo, por condicionalmente expressando uma variante de E. mutagénico coli ADN polimerase III ε subunidade. Isto pode ser obtido construindo uma variante de ε competente na ligação α mas desprovido da sua actividade correctora, e controlar a produção de ε mutagénico por sistemas de expressão apropriados. Usando esta estratégia, foi demonstrado que a E. coli aumenta a freqüência de mutação em condições que induzem variantes mutagênicos da ε 11,21. No entanto, nenhum ajuste fino da frequência de mutação foi realizada por este meio. A proteína co-expressão pode ser utilizado para obter um melhor controle de estirpes mutantes. Para esse objetivo, que é co-transformada E. coli compBAD-ε e pGOOD1-εD12A, de modo a induzir a expressão do tipo selvagem e a variante D12A mutagénicas de ε com arabinose e IPTG, respectivamente. Como um teste fenotípica, determinou-se o aparecimento de actividade β-glucosidase, que é críptica (Bgl -) do tipo selvagem em E. coli 22,23. Mutantes espontâneos capaz de utilizar β-glicosídeos como fontes de carbono (BGL +) pode ser enriquecido ou isoladas por líquidos ou sólidos media 23 24, respectivamente. Quando as células foram induzidas para expressar a variante mutagénico D12A, actividade β-glucosidase foi adquirido em ca. 20 gerações (Figura 4A). Deve notar-se que uma tendência similar foi observada em células não induzidas (Figura 4A), muito provavelmente porque o controlo transcricional exercida sobre pGOOD1 é bastante permeável 11. No entanto, quando o ε subunidade do tipo selvagem foi induzida, por si só ou em conjunto com a variante D12A, β-glicosidaseatividade foi adquirida pela E. coli em níveis moderados (Figura 4A). A actividade β-glucosidase de BGL + mutantes foi relatada na faixa entre 3 e 40 uM / min 23. O nível determinado aqui em E. coli populações submetidas à expressão de εD12A é muito menor, mas deve ser considerado que não tentar isolar BGL + mutantes em meios sólidos.
Figura 1. A co-expressão de E. coli ADN polimerase III do núcleo catalítico. (A) SDS-PAGE das proteínas totais extraídas a partir de E. coli TOP10 / pBAD-α1160 / pGOOD-ε243 cultivadas na ausência de indutores, na presença de arabinose apenas, apenas de IPTG, ou em meio suplementado com IPTG e tanto arabinose (pistas 1-4, respectivamente). (B) Absorvância (círculos vazios) e a actividade de exonuclease (círculos a cheio) das fracções isoladas por sujeição a filtração em gel, as proteínas solúveis extraídos a partir de E. coli TOP10 que sobre-expressam α, ε, e subunidades de E. θ coli DNA Pol-III. (C) de SDS-PAGE de fracções de 6, 12, 23, 31, e 41 (pistas 1-5, respectivamente) relataram no Painel B. (D) de SDS-PAGE de uma alíquota de concentrado da fracção 23, cuja actividade de exonuclease e electroforética padrão são relatadas nos Painéis B e C, respectivamente. Reproduzido com permissão da biotecnologia Letters, 33, Conte et al:. "PGOODs: novos plasmídeos para a co-expressão de proteínas em Escherichia coli"., 1815-1821 (2011) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A proteólise de E. coli ADN polimerase III ε subunidade. (A) A degradação do monomérica como revelado por western blotting de proteínas extraída a partir de E. coli TOP10 que superexpressam de comprimento completo ou as formas truncadas de ε; As setas indicam a posição de 25 e 19 kDa marcadores moleculares pré-corados. Reproduzido com permissão da Elsevier de Biochimica e Biophysica Acta Proteínas e Proteômica de 1794, Bressanin et al.: "A proteólise da subunidade revisão controla a montagem de Escherichia coli DNA polimerase III núcleo catalítico", 1606-1615 (2009). (B) A co-expressão de α ε e subunidades de E. coli ADN polimerase III do núcleo catalítico. SDS-PAGE do total (pistas 1 e 3) e solúveis (pistas 2 e 4) proteína extracts isoladas a partir de células que sobre-expressam a subunidade ε (pistas 1 e 2), ou α e subunidades ε (pistas 3 e 4).
Figura 3. A co-expressão de ADN-polimerase III α ε e subunidades de Deinococcus radiodurans e Escherichia coli, respectivamente. (A) SDS-PAGE de extractos de proteína total isolado a partir de células não induzidas (pista 1), ou induzidas para sobre-expressar α Dr, ε, ou α Dr e ε (pistas 2-4, respectivamente). (B) Cromatograma (círculos vazios, eixo esquerdo) e a concentração de proteína das fracções (círculos a cheio, eixo direito) eluída formar uma coluna de filtração em gel (Superdex 200) carregado com proteínas solúveis extraídos a partir de E. coli overexpressing Dr α umnd ε subunidades. (C) Revisão (círculos vazios, eixo esquerdo) e DNA polimerase (círculos preenchidos, eixo da direita) Actividades das fracções mencionadas no Painel B. (D) SDS-PAGE de alíquotas concentradas de frações 32, 36 e 52. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. freqüência de mutações de E. células de E. coli ou não submetido a co-expressão do tipo selvagem e a variante D12A mutagénicas de ADN polimerase III ε subunidade. O mapa do plasmídeo pFINE novo também é mostrada. (A) a actividade β-glucosidase de E. coli TOP10 não induzida (n Ind) ou submetido a sobre-expressão do tipo selvagem ε subunidade (Ara), a variante D12A mutagénico (IPTG), ou ambos do tipo selvagem e D12A subunidades ε (Ara + IPTG). A actividade β-glicosidase é relatado como uma função de gerações. (B) Mapa de novo pFINE vector de expressão. O local de clonagem múltipla (MCS) deste plasmídeo é idêntico aos presentes nos vectores pBAD e pGOOD compatíveis, permitindo fácil vaivém de genes entre eles.
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Discussion
As proteínas podem ser intrinsecamente desordenados, caracteriza regiões cuja estrutura terciária não está restrita a um número limitado de conformações 25. Estas proteínas são geralmente desordenados propensos a agregação de 25, e o seu isolamento e caracterização pode representar uma tarefa difícil. A subunidade de E. ε DNA polimerase III coli apresenta dois domínios distintos 26,27, a saber: i) o domínio N-ter, tendo o 'exonuclease 3'-5, e competente na ligação da subunidade θ; ii) o domínio C-ter, responsável pela ligação ao α (polimerase) subunidade. O domínio C-ter de ε é conhecido para conferir solubilidade pobre a esta proteína, promovendo a sua agregação. Foi de facto demonstrado que ε-186, uma forma truncada da proteína desprovida do domínio C-ter, é solúvel, e pode ser purificado com rendimentos elevados 17. No entanto, quando a interacção de ε com α tem de ser estudados quantitativamente(Por exemplo, para determinar a K D do complexo αε), é necessária a purificação de ε de comprimento completo, o que implica uma tarefa difícil bioquímica. Neste quadro, a co-expressão de proteínas fornece estimativas qualitativas da ligação de ε para α. Mostrámos que rendimentos elevados do complexo αεθ pode ser obtida in vivo por co-expressão (Figura 1), contornando a fraca solubilidade da subunidade ε. Notavelmente, a purificação do complexo αεθ sobrexpressa foi reportado 28,29. A estratégia de co-expressão, também pode ser utilizado para testar se ou não a inserção de mutações específicas do local em um dos parceiros interactuantes prejudica a formação do complexo. Por conseguinte, a co-expressão da proteína representa uma ferramenta conveniente e rápida de realizar testes qualitativos de interacção proteína-proteína. Deve também notar-se que o nosso sistema de co-expressão baseia-se em dois indutores, isto é, arabinose e IPTG diferente. Por conseguinte, os controlos adequados pode ser facilmente realizada ao testar a formação de um complexo de proteínas, por exemplo, omitindo-se a partir de um indutor ao meio de crescimento bacteriano (Figura 1A).
Apresentamos aqui um procedimento otimizado para a co-expressão da α e subunidades de E. ε coli ADN polimerase III. Quando este protocolo foi concebido e testados, os seguintes parâmetros foram identificados como sendo críticos para o sucesso das experiências de co-expressão: i) a temperatura na qual a indução é realizada; ii) o tempo de duração de indução; iii) a concentração de indutor (s). Em particular, não foi possível obter solúvel αεθ complexo 11 de células induzidas a 37 ° C, de forma independente do tempo de indução. Recomenda-se portanto para testar diferentes temperaturas para o passo de indução, e para verificar a expressão elevada de proteínas como uma função do tempo. Além disso, a avaliação paralela de co-expressão em different E. estirpes de E. coli pode ser de grande ajuda quando enfrenta rendimentos moderados das proteínas-alvo.
Relatamos uma experiência representativa realizada para testar a ligação de proteínas a partir de espécies diferentes, e que demonstraram que a co-expressão da proteína é útil para testar rapidamente a associação de duas proteínas heterólogas num complexo funcional híbrida. Cromatografia de filtração em gel foi utilizado aqui para avaliar a formação de complexos (Figura 3). No entanto, a inserção de uma etiqueta apropriada a um dos parceiros interactuantes pode facilitar esta avaliação, permitindo a utilização de métodos de captura de afinidade. Para evitar a interferência com a etiqueta de interacções proteína-proteína, o gene que codifica para um dos parceiros interactuantes pode ser inserido em paralelo em pBAD / His e pBAD / Myc-His, respectivamente, os vectores que conferem um motivo de hexa-histidina no terminal N e o C -terminus da proteína alvo.
E. coli Mutator estirpes apresentam frequências de mutação mais elevadas do que as suas contrapartes de tipo selvagem. Cepas Mutator são de interesse na área de biotecnologia 30, por exemplo, a evoluir rapidamente de uma estirpe alvo em direção novel, desejados, fenótipos. Nós aqui fornecida evidência de que a co-expressam o tipo selvagem e uma subunidade ε mutagénicas de E. coli DNA polimerase III, a freqüência de mutação do hospedeiro bacteriano pode ser sintonizado com a conveniência suficiente. Para melhorar ainda mais esta tecnologia, vectores de expressão altamente regulados são necessários para reprimir tanto quanto possível a expressão da variante D12A fortemente mutagénica da subunidade ε. Em particular, seria interessante para testar a frequência de mutação em E. coli transformada com o pBAD-εD12A e pGOOD1-ε, isto é, a configuração alternativa ao que aqui apresentada. Os vetores pBAD estão realmente conhecido por ser fortemente regulada 12, e esta característica pode ajudar a manter a concentração basal de εD12Aem níveis baixos.
Os exemplos de proteína co-expressão relatado aqui testemunhar a natureza multifacetada desta técnica. No entanto, é importante notar que o uso de uma multiplicidade de plasmídeos compatíveis na única E. coli pode expandir muito os desafios que podem ser tomadas pela proteína co-expressão. Nos últimos anos, foi devotado um intenso trabalho para expandir o repertório de plasmídeos compatíveis para serem utilizados para a co-expressão da proteína. Em particular, um sistema ternário depender de plasmídeos compatíveis que suportam as origens de ColE1, p15A e pSC101 de replicação foi utilizado para co-expressar tanto proteínas bacterianas e de mamífero 31. Recentemente, um sistema de co-expressão quaternário foi referida. Neste caso, 13 genes heterólogos foram co-expressos em E. coli co-transformadas com vectores de expressão compatíveis 4, contendo a ColE1, p15A, CloDF13, e origens de replicação RSF 32. Este sistema de co-expressão foi usada com sucesso para produzir emE. coli hydrogenase solúvel funcionalmente ativo I de Pyrococcus furiosus 32. Para ampliar o nosso sistema binário, construiu-se um novo vector de expressão, pFINE, contendo a origem de replicação de pSC101, uma cassete de resistência à neomicina, e os elementos reguladores lac (Figura 4B). Este plasmídeo contém o mesmo poliligante presente em pBAD e pGOOD vectores, facilitando assim o gene vaivém entre os três componentes do sistema de co-expressão. Embora pFINE é um plasmídeo de baixo número de cópias, a sua estabilidade foi considerada satisfatória quando testados em meio rico. Estamos atualmente envolvidos em uma maior expansão do nosso sistema de co-expressão ternária. Para este objectivo, construímos um derivado pBAD contendo uma cassete cloranfenicol-resistência, e estamos no caminho para trocar a origem ColE1 de replicação com um compatível com ColE1, p15A e pSC101. Na verdade, é nossa opinião que a utilização de vários plasmídeos em único E. coli células repressente-se uma ferramenta poderosa para desafiar a expressão in vivo dos complexos de proteínas compostas por uma multiplicidade de diferentes subunidades.
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Acknowledgments
A permissão da Springer e Elsevier para reimprimir figuras é muito reconhecido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
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