Abstract
Müller hücrelerinin retina ana glial hücreler bulunmaktadır. Bunların son ayak, dış ve iç sınır membran (ILM) retinanın sınırlarını oluştururlar ve astrositler, perisitlere ve endotelyal hücreler ile bağlantılı olarak, kan-retina bariyerini (BRB) oluşturmaktadır. ILM retina ve vitreus boşluğuna arasında histolojik sınırı tanımlayan bir bazal membran gibi davranır ise BRB kan ve retina arasındaki malzeme taşıma sınırlar. Müller hücrelerinin etiketlenmesi bu hücreler BRB ve ILM ayrılmaz bir parçası olarak, retina bariyerinin fiziksel durumunu incelemek için özellikle önemlidir. BRB ve ILM Hem sık retina hastalığında değişmiş ve hastalık belirtileri sorumludur vardır.
Böyle Evans mavisi deney veya floresein anjiyografi gibi brb bütünlüğünü incelemek için birkaç köklü yöntemler vardır. Ancak bu yöntemler BRB geçirgenlik t ölçüde bilgi vermemektedirnanometre aralığı içinde daha büyük moleküller, o. Ayrıca, böyle ILM gibi diğer retina engellerin durumuna ilişkin bilgi vermemektedir. Retina ILM ile birlikte BRB geçirgenliğini incelemek için, hastalık durumlarında ILM ve hücre dışı matris proteinlerinin durumunu gösteren ancak daha büyük moleküllere BRB geçirgenliği ile ilgili bilgi sağlayan bir AAV esaslı yöntemi kullanılır. İki AAV varyantlar, çalışma için faydalıdır: AAV5 ve ShH10. AAV5 Fotoreseptörlerin için doğal bir tropizm vardır ama ILM sağlam olduğunda (vahşi tip retina yani) vitreus içine verildiğinde, dış retina genelinde alınamıyor. ShH10 glial hücrelerine karşı güçlü bir tropizm vardır ve seçici sağlıklı ve hastalıklı retina hem de Müller glia etiketleyecektir. ShH10 ILM tehlikeye retina daha verimli gen teslim sağlar. Immunohistokimyası ve kan-DNA analizi ile birleştiğinde bu viral hastalığın araçlar retina engellerin durumuna da ışık tutacaktır.
Introduction
Müller hücreleri retinanın büyük glial bileşenidir. Morfolojik, onlar, vitreus ile temas radyal retina ve endfeet, yayılan ILM ve ikinci gizli bileşenleri karşı karşıya. ILM on farklı hücre dışı matris proteinleri (laminin Agrin, perlekan, nidojen, kollajen ve çeşitli heparin sülfat proteoglikanlar) oluşan bir taban zarıdır. Gelişimi sırasında, kendi varlığı ganglion hücrelerinin 1-3 retina histogenezisleri, optik akson navigasyon, ve hayatta kalmak için vazgeçilmezdir. Ancak, ILM yetişkin retinada önemsiz olduğunu ve cerrahi retina hasarı 4 neden olmadan belirli patolojilerin kaldırılabilir. Gen terapisi, bu membran intravitreal enjeksiyonu 5 ile AAVS kullanarak retinanın verimli iletimi için fiziksel bir bariyer haline gelir.
Süreçlerini geniş arborization sayesinde, Müller hücreleri beslenme ve düzenleyici Suppo sağlamakoda sıcaklığı, retina nöronlarının ve vasküler hücrelerin hem de. Müller hücrelerinin de BRB 6 oluşumu ve bakım, retina homeostazının düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Sıkı bağlantılar retina kapilar endotelial hücreler arasında, Müller hücrelerin, astrositlerin ve perisitler BRB oluştururlar. BRB diyabetik retinopati, retina ven tıkanıklığı ve solunum yolu hastalıkları gibi birçok hastalığın retina.In girmesini bazı maddeler önler, retinanın hipoksi BRB 7-9 ile sızıntı neden olur. Bu yırtılma vazojenik ödem, retina dekolmanı ve retina hasarına yol açan damar geçirgenliği bir artış ile ilişkilidir.
Müller hücrelerinin sıkı hem BRB ve ILM bütünlük içinde önemli bir rol oynayan, kan damarları ve bazal membran ile ilişkilidir. Sonuç olarak, Müller glial hücreler etiketleme bu retina engellerin fiziksel durumunun çalışmaya özellikle önemlidir.
Klasikortağı BRB geçirgenliği plazma albümini ile kovalent olmayan bir şekilde bağlanan Evans mavi boya, sistemik enjeksiyonundan oluşan Evans mavisi analizi kullanılarak ölçülür. Bu tahlil retina içine kan damarlarının 10 (Protokoller Bölüm 5'e bakınız) albumin kaçağı (orta büyüklükte protein, ~ 66 kDa) ölçer. Alternatif olarak, vasküler sızıntı floresan sızıntı doğrulayan floresan retina anjiyografi ile görüntülendi olabilir (küçük molekülü, ~ 359 Da; Protokoller Bölüm 6) 11. Bununla birlikte, her iki yöntem küçük moleküller ve proteinlere BRB geçirgenlik değerlendirilmesini sağlar ancak ILM bütünlüğü hakkında bilgi vermemektedir.
Bu nedenle, BRB geçirgenliğini incelemek için, biz, daha büyük moleküller (örneğin, AAV parçacıklar 25 nm çapında) için BRB geçirgenliği ile ilgili bilgi veren bir AAV esaslı yöntemi kullanılır. Nitekim, bizim yöntem öneririz, hangi kan AAV transgen varlığını tespit edebilir ~ 25 nm çapında parçacıkları olurkana sızmak mümkün. Bu yöntem, aynı zamanda patolojik durumlarda ILM ve hücre dışı matris proteinlerinin yapısı hakkında bilgi içerir. İki AAV varyantlar, çalışma için faydalıdır: AAV5 ve ShH10. Subretinally enjekte AAV5 fotoreseptör ve retina pigment epiteli 12 için doğal bir tropizm var ama sağlam ILM 5,13 ile yabani tip retina vitreus içine verildiğinde, dış retina genelinde alınamıyor. ShH10 özellikle nöron 14,15 fazla glial hücreler hedef için işlenmiş olan bir AAV varyantıdır. ShH10 seçici tehlikeye engelleri 16 retina artan verimlilik ile sağlıklı ve hastalıklı retina hem de Müller hücreleri etiketler. Immuhistochemistry ve kan-DNA analizi ile birleştiğinde bu viral araçlar retina engellerin devlet ve hastalık onların katılımı (Şekil 1) hakkında bilgi verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO Tablosuna göre bakım ve ele alınmıştır.
HEK-293 hücrelerinden 17,18 süreli transfection ile Rekombinant AAV (rAAV), 1. Üretim
NOT: McClure C, (2011) 19 vallahi bak.
- AAV vektörü plazmid geniş ölçekli bir plazmid hazırlama (en az 1 mg / ml) ile saflaştınlır. 3 plazmidler kullanın. AAV ters terminali olmadan çoğaltma ve kapsid genleri taşıyan AAV yardımcı plazmid ITR'ler, AAV ITR transferi plazmid olarak anılacaktır taşıyan transgen ifade kaseti, adenovirüs ve yardımcı genleri E2, E4, ve VA RNA genleri tedarik plazmid sevk edilen tekrarlar pHELPER olarak.
- Bu 3 plazmidler polietilenimin (ya da diğer transfeksiyon reaktifi) kullanılarak 293 hücreleri transfekte. Transfeksiyon verimi% 80 üzerinde iyi vi için gerekli olanral verimleri.
- Bir iyodiksanol degrade üzerinde 293 hücre lisatlanndan rekombinant AAV arındırın. % 15,% 25,% 40,% 60 iyodiksanol gradyanı elde etmek için kullanılır. AAV parçacıkları ihtiva eden% 40 iyodiksanol fraksiyonu toplamak% 0.001 Pluronic PBS'ye 1 saat karıştırıldı ve tampon değişimi (fosfat tamponlu tuzlu su) için 500,000 x g'de ultrasantrifugasyon sonra fraksiyonu konsantre edilir.
- Viral genomik titresi 20 belirlemek için, qPCR ardından DNAz ProteinaseK özet gerçekleştirin. ileri ve geri primerler AAV2 ITR bulunan 62 bp bölgesini yükseltmek. Plazmid standart için, prob FAM ile etiketlenmiş ve (BHQ) söndürücü bir kara delik vardır.
- ITR primeri, 100 nM ileri ITR primeri, 100 nM, AAV2 ITR probu, 0.4 mM dNTP, 2 mM MgCI2, 1 x Platin Taq tampon, 1U Platin ters 340 nM kullanılarak 25 ul nihai hacim içinde qPCR (kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu) yapınız Taq ve 5 ul şablonu (standart, numune ve hiçbir şablon kontrolü).
- Içinstandart seri seyreltileri ile 10 katı 7 x transfeksiyon için plazmid kullanımı (5 ul 10 Ekim-10 Nisan genomları / ml nihai bir konsantrasyonda elde edilen, 2 x 10 9 3 10 ila 2 x genomları / ml her biri).
- Denatürasyon için 40 döngü, ardından 15 dakika boyunca 95 ° C'de bir ilk denatürasyon adımı programı başlayın 1 dakika tavlama / uzatma için 95 ° C 'de 1 dakika süre ile 60 ° C'de ilave edildi. Kısa süreli depolama için veya uzun depolama süreleri boyunca -20 ° C 'de 4 ° C' de muhafaza edin.
AAV 2. Intravitreal
- Ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile C57BL6J fareler anestezi ve refleks, uygun bir anesthetization gösteren çekme refleksi ve kuyruk kıskaç yanıt doğrultma kaybını kontrol edin. Neosynephrine% 5 kornea uygulama ile öğrencilerin genişletmek ve göz damlası% 0.5 mydriaticum. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göze veteriner merhem kullanın.
- Bir ultra ince 30 G disposab geçmekle ekvator boyunca iğne ve vitreus boşluğuna, limbusa yanındaki (Chiu K, vallahi (2007) 21). Vitröz kavitesine merkezi iğne, doğrudan gözlemiyle ShH10-GFP veya rAAV5-GFP 1 ila 10 x 4 11 vp ihtiva eden 1 ul stok (Şekil 1) enjekte edilir. ILM deney için bir kontrol olarak, bir göz kullanın. BRB deneyler için her iki gözleri enjekte edilir. Enjekte gözleri bir anti-inflamatuar ve antibakteriyel topikal tedavi uygulayın.
- Neosynephrine ile öğrencileri genişletmek ve mydriaticum göz görüntüleme için düşer. GFP (Yeşil Floresan Protein) ifadesi 1 hafta, 2 hafta, 1 ay, intravitreal enjeksiyondan sonra 2 ay (Şekil 1) takip göz fundus kamera ile fundus muayeneleri gerçekleştirin. CO 2 inhalasyon 1 ila 2 ay sonrası enjeksiyon yoluyla fareler Kurban.
3. İmmünohistokimya
- Retina cryosections (Şekil 1) için, l kaldırmak için enüklee gözleri teşrih1 saat süresince% 4 paraformaldehit içinde sapiens ve kornea ve daldırma düzeltme.
- Oda sıcaklığında 1 saat, oda sıcaklığında bir saat için% 20 sakroz,% 10 sukroz içinde daha önceden belirlenmiş gözleri cryoprotect. Gece boyunca 4 ° C'de% 30 sukroz çözeltisi içerisinde cryoprotect. Freeze ve Cryo-matris olarak reçine gömme eyecups embed. 10 mikron cryosections olun ve özel dondurulmuş doku bölümleri için tedavi slaytlar üzerine monte ve boyama sırasında doku uyumu artırmak.
- 5 dakika boyunca PBS pH 7.4 içinde% 0.1 Triton X100 ile bölümleri geçirgenliği. PBS Yıkama 2x ve blok,% 1 BSA ile PBS içinde oda sıcaklığında 1 saat,% 0.1 Tween 20.
- Retina flatmounts (Şekil 1) için, diseksiyon kolaylaştırmak için, 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid içinde enüklee gözleri düzeltin.
- 15-30 dakika içinde, kornea ve lens çıkarmak için gözleri teşrih. Ora serrata etrafında keserek retina pigment epiteli (RPE) ve sklera gelen retina ayırın veoptik sinir. Retina ve kalıt retina hücrelerinde floresan proteini (tespit 24 saat aşmamalıdır) sabitlemek için başka bir 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid içinde bırakın. Steril PBS, pH 7.4 içinde 5 dakika yıkanır.
- (% 1 BSA,% 2 normal keçi ya da eşek serumu PBS,% 0.5 Triton X-100), bloke edici tampon ile PBS değiştirin ve oda sıcaklığında 4 saat ya da gece boyunca 4 ° C'de ya da blokaj tamponunda inkübe edilir.
- Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de ya da 4 saat süre ile blokaj tamponu içinde primer antikorlar ile dokuların inkübe edin. PBS ile yıkayın 3x.
NOT: Aşağıdaki olarak kullanılan antikorlar: Anti-laminin (/ 1,000 1) etiketleme ILM anti-rodopsin klon 4D2 (1/500) etiketleme çubuklar, anti-glutamin sentetaz klonu GS-6 (1 / 1.500) etiketleme Müller hücreleri PNA lektin (1/40) etiketleme kozalakları. - Oda Tempe 1 saat (halinde kriyoseksiyonlar) ya da 2 saat (flatmounts) blokaj tamponunda Alexa Fluor konjuge sekonder antikor: 500 oranında seyreltilmiş 1 ile dokuları inküberature ve ışıktan korunan. PBS ile yıkayın 3x.
- Retinaya giderici kesim yapmak ve fotoreseptör veya retina ganglion hücre (RGH) iki tarafında yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine flatmount. 4 ° C'de lamel ve mağaza uygulamak, sulu mountingmedium ekleyin.
- Lazer tarama konfokal mikroskop konfokal mikroskopi gerçekleştirin. Uyarma ve emisyon karışma azaltmak için, satır görüntüleri sırayla, çizgi edinin. Nyquist-Shannon örnekleme teoremine göre adım boyutunu tanımlayın. Son görüntülerde doygun piksel en aza indirmek pozlama ayarlarını kullanın. Z-proje fonksiyonu altında maksimum şiddeti kullanarak ve nihayet 8-bit RGB renk moduna dönüştürmek tek düzlemde FIJI ile Süreci 12-bit görüntüleri, proje Z-bölümleri.
Fare Kan Örneklerinin 4. PCR Analizi
- Anestezi C57BL6J farelerin penil ven içine bir AAV-GFP 1 10 4 x 11 partikülleri içeren 100 ul stok (izofluran% 5 enjekteultra-ince 6 mm'lik bir iğne ile bir insülin şırıngası kullanılarak yakın bir bölmesi içinde indüksiyon ve ameliyat sırasında bir burun konisi ile izofluran% 2,5) dir. Bu hayvan AAV tanecikleri dolaşan bir pozitif kontrol olarak görev yapacak.
- Enjeksiyon ve 3 saat, 24 saat, 2 gün ve 3 gün ShH10 intravitreal enjeksiyonu sonrası veya intrapenile enjeksiyon (Şekil 1) önce sonra fare kuyruğu örnek kan. 10-20 ul heparin tüpler toplanır. Prosedürün tamamlanmasından sonra CO 2 inhalasyon fareler Kurban.
- Seçtiğiniz ekstraksiyon kiti kullanılarak, kan örneklerinden genomik DNA ayıklayın.
- Genomik DNA, PCR amplifikasyon yapın. Bu protokol için aşağıdaki primer çifti kullanın: GFP, 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', 5'-antisens CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3' seziyorum. Aşağıdaki PCR programı gerçekleştirildi: 95 ° C'de 2 dakika (1 döngü); 95 ° C, 45 sn, 55 ° C, 1 dakika, 72 ° C, 45 sn (30 döngü); 72 ° C'de 5 dakika (1 döngü);4 ° C tutun.
5. İsteğe bağlı Evans Mavisi Yöntemi
NOT: Evans mavisi yöntemi kullanılarak 10 retina içine kan damarlarından albümin kaçağı ölçerek damar geçirgenliği niceliğini.
- 5 um'lik bir filtreden 5 ultrasonik banyoda dakika ve filtreleme için normal tuzlu su çözeltisi (6 mg / ml), sonikasyon içinde çözülerek Evans Mavisi boya hazırlanır.
- (Adım 4.1, izofluran solumaktan) C57BL6J fareler anestezi refleksi, geri çekme refleksi ve uygun bir anesthetization gösteren kuyruk tutam yanıt doğrultma kaybını kontrol ve penil ven (Şekil 1) ile Evans mavisi (45 mg / kg) enjekte edilir. Farelerin pençeleri, namlu ve kulaklar, Evans mavisi enjeksiyonu takiben boya alımını ve dağılımını teyit açıkça mavi hale olmadığını kontrol edin.
- Ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile, boyanın enjeksiyonundan sonra C57BL6J fareler 3 saat anestezisi ve rightin kaybını doğrulamakg doğru anesthetization gösteren refleks. Örnek intrakardiyak 500 heparin tüplerde kan ul bir sitrat tampon maddesi ile sol ventrikil yoluyla 2 dakika boyunca fareler serpmek (0.05 M, pH 3.5; sitrik asit 7.8 g damıtılmış su, 1 L sodyum sitrat ve 3.8 g çöz) vazokonstriksiyon önlemek için 37 ° C sıcaklığa daha önceden ısıtılmıştır. Fareler perfüzyon yoluyla kurban edilir.
- Dikkatle perfüzyon, aydınlatmak ve sonra retina toplamak için bir işletim mikroskop altında her iki gözleri teşrih (Bölüm 3.2). Santrifüjlü bir buharlaştırıcıda Kuru retina gece boyunca, tartılmakta ve (100 xg) çalkalanarak 65 ° C'de 18 saat formamid 100 ul ile retina inkübe edilerek Evans mavisi ekstrakte edin. 4 ° C'de 2 saat süre ile 20,798.5 xg'de 30K omega filtre tüpleri Santrifüj retina örnekler ve santrifüj kan örnekleri 4 ° C sıcaklıkta 15 dakika boyunca 20,798.5 xg'de.
- Absorbansı ölçmek için, her iki süpernatantlar kullanın. Absorbans en fo çıkarılarak her numunenin absorbansı belirlemek740 nm'de absorbans minimum 620 nm mavi r Evans. Formamid Evans mavisi, standart bir eğriden plazma ve retinada Evans mavisi konsantrasyonu hesaplanır. Saatte kuru retina (plazma / g retina kuru ağırlık / saat ul) gram Evans mavisi mikrolitre içinde BRB geçirgenliği ifade eder.
6. İsteğe bağlı Floresein Anjiyografi
Not: farelerdeki retinal kan damarlarından Kaçak sodyum fluoresein intraperitonal enjeksiyon ile görselleştirilebilir.
- C57BL6J fareler anestezi (izofluran solumaktan, adım 4.1) ve göz (neosynephrine ve mydriaticum) düşer Öğrencileri dilate. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göze veteriner merhem kullanın.
- Floresein anjiografi 0.1 ml steril tuzlu su içinde% 10 sodyum fluoresein karın 0,01-0,02 ml enjekte edilir.
- Bir göz fundus kamera kullanarak enjeksiyon sonrası her iki gözün görüntüleri toplayın. Yanlısı sonra CO 2 solumaktan fareler Kurbanketencik.
NOT: retinal damarlar anjiyografide görünür hale gelebilmesi için 20 sn gereklidir. Görüntüler floresein enjeksiyondan sonra 3-10 dk maksimum arasındaki yakalanan gerekir. kaçak noktalar (mevcut ise) 2.5 dakika sonra gözlenebilir. Daha sonra zaman noktalarında görüntü kalitesi nedeniyle sodyum floresein kısa bir süre analiz için kullanılan sonra elde edilen camsı, böylece sadece görüntü içine difüzyon kaybolur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hayvan modeli ILM (- B Şekil 2A) yapısındaki düzensizlikler gösterir eğer biz ShH10 kullanarak Müller glial hücrelerin retina iletimini artış bekliyoruz. Örneğin, Dp71 yokluğunda göstermiştir, ShH10 hedefler özel olarak, fakat daha etkili Müller yabani tip farelere 16 (Şekil 2C - F) ile kıyaslandığında, bu fare çizgisinde ILM artan bir geçirgenlik gösteren intravitreal enjeksiyon ile glial hücreleri.
RAAV5 da ILM geçirgenlik bir göstergesi olarak da kullanılabilir. Vahşi tip farelerde intravitreal enjeksiyon ile etkisiz AAV5, örneğin Dp71-olmayan farelerde, 16 ya da başka retinal dejenerasyon 22 (- lH Şekil 2G) 'de, taviz veren retina engellerle farelerde fotoreseptör gen verilmesi güçlü etkili olur. Bu da ILM düzensizlik ve potansiyel geçirgenlik yükselmektedir teyitretina nöronları çevreleyen hücre dışı matris içinde örn.
Biz intravitreal Dp71 boş fareler 16 (Şekil 3) enjekte AAV'nin hiçbir iz kan örneklerinde bulundu beri Dp71 boş farelerin BRB dökümü AAV parçacıklara seçici kalır bulundu.
Şekil 1:. Genel prosedürün şematik gösterimi, AAV üretimi sonra partiküller vitröz içine ya da anestezi yetişkin farelere penis damarına enjekte edilir. Micron III kamera ile fundus görüntüleri GFP ifade izlemek için yapılır. GFP desen retina cryosections analiz ve immünohistokimyasal ve konfokal görüntüleri retina sayesinde flatmounted edilir. BRB ile AAV kanalı intravital veya intrapenially enjekte edilmiş farelerde gelen kan örnekleri üzerinde PCR analizi ile değerlendirilir iN, GFP dizinin varlığını saptamak için, AAV gösterge kana varlığını parçacıkları.
Şekil 2, AAV transdüksiyon ILM geçirgenliği bir pan-laminin antikorunun (A, B) ile etiketlenir flatmounted yabani tip ve Dp71 boş retina Konfokal görüntüler. (Ölçek çizgisi: 50 um). GFP ifade (C, D) gösteren fundus görüntüleri. ShH10-GFP intravitreal enjeksiyonu (E, F) sonra retinalar bir ay flatmounted. E gösteren bir yıldız işareti ile belirtilen alanın üç boyutlu sulandırma (E *) kırmızı (Anti-GFAP antikoru) Müller glial yeşil hücreleri ve astrositler transdük. (: 500 mikron ölçekli bar) AAV5-GFP (G, H) intravitreal enjeksiyonu sonrası retinalar bir ay flatmounted. Kırmızı (PNA lektin boyama) yeşil ve koni dış segmentlerinde transdüse fotoreseptörleri gösteren H bir yıldızla (H *) ile belirtilen alanın Konfokal görüntü. Sol sütun, vahşi tip fare retinalarında sonuçlarını gösterir ve orta kolon Dp71 boş fare retinalarında sonuçlarını gösterir. şema (I) vitreus ile Dp71 boş retina olarak tehlikeye engelleri ile retinanın AAV iletimini temsil eder. Kısaltmalar: CV, koroid damarları; RPE, retina pigment epiteli; Phr fotoreseptör hücreleri (silindirik ve konik); MGC Müller glial hücreler; HC yatay hücreleri; M.Ö., bipolar hücreler; Ac, amacrine hücreleri; M, mikroglia; AT, endotel hücreleri; P, perisitler; GC, ganglion hücreleri; Bir astrositler; ILM, iç sınırlayıcı membran; V, vitreus; AAV, adeno-ilişkili virüs. (Vacca ve ark., Glia (2013) 16, # 3483740951391 izniyle yeniden baskı).
tp_upload / 52.451 / 52451fig3.jpg "/>
Şekil 3, AAV parçacıklara BRB geçirgenlik fare kan örneklerinden ekstre GFP transgenin PCR büyütmesi.. Fareler her iki enjeksiyondan sonra farklı zamanlarda intravital (IVT), AAV-GFP ile intrapenially ShH10-GFP veya (İP) ile enjekte edilmiştir. Şerit 5-18, Dp71 boş fareler için wild-tip fareler ve hatta numaraları için tek sayılar; şerit 2, AAV, plazmid, PTR-SB-smCBA-hGFP 1 ng; şerit 3, su; 5-6, enjeksiyon öncesi kan, DNA şeritleri; şerit 7-8, 3 saat sonrası IVT; şerit 9-10, 24 saat sonrası IVT; şerit 11-12, 24 saat sonrası IP; şerit 13-14, 48 saat sonrası IVT; şerit 15-16, 48 saat sonrası IP; şerit 17-18, 72 saat sonrası IVT; 19-20, 72 saat sonrası IP şeritleri. 1 ve 4. şeritler, Invitrogen ölçekli merdiven (100 bp): 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1500, 2000, 3000 bp'lik. (Vacca ve ark., Glia (2013) 16, # 3483740951391 izniyle yeniden yazdırmak).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BRB kan ve retina arasındaki moleküller değişimini kontrol eder. Bu dökümü diyabetik retinopati veya yaşa ilişkin makula dejenerasyon (AMD) gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilidir. Son zamanlarda geçirgen BRB görüntüleyen bir distrofin nakavt fare üzere retina adeno-ilişkili viral vektörler (AAV) tarafından aracılık edilen gen aktarımı için daha geçirgen hale göstermiştir. Ancak, BRB geçirgenlik AAV parçacıklar rağmen göz içine bu modelde göz bölmeye sınırlı kalmak enjekte. Sonuçlarımız, sistemik yan etkiler ilave riskleri temsil etmez geçirgen BRB göstermek hastalıklar için gen tedavisi göstermektedir. Ayrıca, böyle ILM gibi diğer engeller viral parçacıkların daha iyi erişime izin retina hastalığı sırasında tehlikeye hale gerçeğini desteklemektedir. Bulgularımız AAV kodlama muhabiri genler retina hastalığının hayvan modellerinde BRB geçirgenliği ve ILM bütünlüğünü incelemek için mükemmel bir araç olduğunu düşünüyorum bizi. Özellikle güneylikle, özellikle Müller glia etiketler AAV varyant ShH10, retina glia etiketlemek ve hastalığa tepki olarak retinanın durumu hakkında rapor için bir araç olarak kullanılabilir. ShH10 seçici sağlıklı ve hastalıklı retina hem de Müller glia etiketleyecektir. Ancak, ShH10 ve diğer AAVler hem tehlikeye engellerle retina daha verimli gen teslim sağlayacaktır.
Yukarıda anlatılan protokolleri uygulayarak bazı kritik adımlar (1) güvenli intravitreal enjeksiyonu gerçekleştirmek için el becerisi geliştirme, ve (2) düzgün öncesi ve diseksiyonu sonrası doku sabitleme. Lens veya retina dokunmadan - retina engelleri incelerken, intravitreal enjeksiyon kuyusu olduğunu idam edilmelidir. Merceği Zarar veya retina ayırma BRB geçirgenlik 23,24 etkiler. Ayrıca objektif hasar fundus görüntüleme engellemektedir. Retina dokunmak ILM delinmesine ve retina yapısına zarar verebilir. , Tecrübe retina dokunmamak içindoğruya retina önünde, vitröz kavitesi ortasında Hamilton şırınga ucu dikkat edilmelidir. Toksik olmayan boya vitröz içine akışkan enjeksiyonunun gözlem yardımcı olmak üzere viral çözelti (örneğin, fenol kırmızı veya floresan gibi) dahil edilebilir. Retinasına yaptığı hasar kolaylıkla enjeksiyon prosedür takip edilerek, fundus görüntüleme sırasında görülebilir. Yeterli ifade seviyeleri ulaşıldığında sonra başka önemli bir adım dokusunun tespiti olduğunu. Enükleasyondan sonra, gözler hemen sabitleyici tampon daldırılmış olmalıdır ve doku geçirgenliği önce bir ikinci sabitleme GFP sızıntıyı önlemek için gereklidir. Bu sabitleştirici tüm göz çeker önce kornea yarık için yararlı olabilir - bu fiksatif vitreus içine nüfuz için bir şans verecektir. Bu adım, genel doku istikrarı artırabilir.
Son olarak, etkili bir retina transdüksiyonu için yeterli AAV parçacıkları enjekte etmek ve GFP ex dikkat etmek de önemlidirGöz fundus görüntülerde pression. AAV parçacıklarının optimal miktarı 10 10 parçacıkların GFP her zaman fundus görüntüleme tarafından gözlemlenen değil aşağıda, göz başına yaklaşık 10 10 -10 11 VG olduğunu.
Bu teknik, doğrudan ILM veya brb altındaki damarsal gözlemlemek imkanı vermeyecektir. Ancak Evans mavisi deneyi ve floresein anjiografi kullanarak daha önce mümkün olmayan bir şekilde retina engelleri ve hastalık durumlarında kendi değişiklik, incelemek için bir yol sağlar. Belirli retina iletim özelliklerine sahip AAVS kullanarak, glial hücreler, hücre dışı matriks ve ILM ile ilgili retinanın haline iyi fikir almak mümkündür. Bu tekniği mastering sonra, bir tedavi stratejilerinin etkinliğini ve brb üzerindeki etkilerini ve retina geçirgenliğini test edebilirsiniz ve tedavi i sonrası normal şartlarda geri hastalığın ilerlemesi ve olasılığı daha iyi anlaşılması doğru gitmekretina hastalığı na fare modeli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6J mice strain | JANVIER LABS | mice | |
| Ketamine 500 | Virbac France | anesthetic | |
| Xylazine Rompun 2% | Bayer Healthcare | anesthetic | |
| Neosynephrine 5% Faure | Europhta | dilatant | |
| Mydriaticum 0.5% | Thea | dilatant | |
| Sterdex | Novartis | anti-inflammatory | |
| Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | 10143352 | slides |
| anti-laminin | Sigma | L9393 | antibody |
| anti-rhodopsin clone 4D2 | Millipore | MABN15 | antibody |
| anti-glutamine synthetase clone GS-6 | Millipore | MAB302 | antibody |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein | Dako | 334 | antibody |
| PNA Lectin | Invitrogen | L32459 | probe |
| Alexa fluor conjugated secondary antibodies | Invitrogen | antibody | |
| Fluorsave reagent | Calbiochem | 345789 | mounting medium |
| QIAmp DNA Micro Kit | QIAGEN | 56304 | |
| GoTaq DNA polymerase | Promega | M3001 | |
| Evans Blue dye | Sigma | E2129 | dye |
| 5 µm filter | Millipore | ||
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-2.5KG | |
| Formamide spectrophotometric | Sigma | 295876-2L | |
| Fluorescein | Sigma | F2456 | dye |
| Micron III | Phoenix Research Labs | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. | |
| Insulin Syringes | Terumo | SS30M3109 | |
| Syringe 10 µl Hamilton | Dutscher | 74487 | Seringue 1701 |
| Needle RN G33, 25 mm, PST 2 | Fisher Scientific | 11530332 | Intravitreal Injection |
| UltraMicroPump UMP3 | World Precision Instruments | UMP3 | Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | UMP3-1 | Digital controller | |
| Binocular magnifier SZ76 | ADVILAB | ADV-76B2 | Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection |
| Spring scissors straight - 8.5 cm | Bionic France S.a.r.l | 15003-08 | Retinas dissection |
| curved Vanna scissor | 15004-08 | ||
| Pince Dumont 5 | 11254-20 | ||
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Life technologies | 4375786 | Thermocycler |
| Ultrasonic cleaner | Laboratory Supplies | G1125P1T | |
| Nanosep 30k omega tubes | VWR | ||
| Speedvac | Fisher Scientific | SC 110 A | |
| Spectrofluorometer | TECAN | infinite M1000 |
References
- Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
- Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
- Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
- Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
- Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
- Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
- Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
- Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
- Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
- Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
- Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
- Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
- Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467 (2009).
- Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
- Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313 (2007).
- Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
- Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329 (2009).
- Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).
